余萬(wàn)桂，鄧德明，張恒文 (長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

楊 濤 (荊州市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科，湖北 荊州 434023)

張道明，劉 蓮 (長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

蓮心堿對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織中一氧化氮和一氧化氮合酶的影響

余萬(wàn)桂，鄧德明，張恒文 (長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

楊 濤 (荊州市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科，湖北 荊州 434023)

張道明，劉 蓮 (長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

目的：觀察蓮心堿對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷后腦組織一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性的影響，為蓮心堿治療腦缺血提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：線栓法阻塞大鼠大腦中動(dòng)脈2h/再灌注24h制備大鼠腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型。24只SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、缺血再灌注組和蓮心堿(3mg/kg)組，分別于術(shù)前30min、再灌注即刻、再灌注12h舌靜脈注射蓮心堿3mg/kg。再灌注24h后處死大鼠，取腦組織以硝酸還原酶法測(cè)定腦組織中的NO水平，以化學(xué)比色法測(cè)定總NOS活性，并測(cè)定誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活力。結(jié)果：大鼠腦缺血2h、再灌注24h后，腦組織NO水平顯著升高，總NOS和iNOS 活性顯著增加，蓮心堿可顯著降低缺血再灌注損傷大鼠腦組織NO含量和總NOS、iNOS 活力。結(jié)論：蓮心堿可能通過(guò)降低NO對(duì)腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)毒性作用而發(fā)揮腦缺血的保護(hù)作用。

蓮心堿；腦缺血/再灌注損傷；一氧化氮；一氧化氮合酶

一氧化氮(NO)以L-精氨酸為底物，在一氧化氮合酶(NOS)催化作用下生成，是一種重要的信使分子，參與多種疾病的病理生理過(guò)程，在腦缺血再灌注損傷中起重要作用[1]。蓮心堿是從中藥蓮子芯中提取分離得到的雙芐基異喹啉類化合物，具有降壓、抗心律失常等心血管活性[2]，文獻(xiàn)報(bào)道與蓮心堿同屬蓮子心主成分的另一生物堿——異蓮心堿對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血損傷和腦缺血/再灌注損傷均具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能與它抗氧化和抗自由基損傷有關(guān)[3]。同時(shí)我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到蓮心堿對(duì)腦缺血有保護(hù)作用[4]。本實(shí)驗(yàn)觀察蓮心堿對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷后腦組織NO水平和NOS活性的影響，為蓮心堿治療腦缺血提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)藥物 蓮心堿由武漢大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)研究室提供(含量為96.8%)，為微黃色結(jié)晶，實(shí)驗(yàn)時(shí)，加1mol/L鹽酸溶解，再以0.1mol/L 氫氧化鈉將pH調(diào)至5.8，置冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2動(dòng)物 大鼠，SD種，一級(jí)，雄性，體質(zhì)量200～240g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物中心許可證號(hào)為SYXK(鄂)2004-0028，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(鄂)2004-0007)。

1.1.3試劑與儀器 NO和NOS 測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所； 756mc紫外分光光度計(jì)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型制備與分組 健康雄性SD大鼠24只，隨機(jī)平均分為3組，即假手術(shù)組、缺血再灌注組和蓮心堿組。3組大鼠分別予以戊巴比妥鈉30mg/kg，腹腔注射麻醉，線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)/再灌注模型[5]。缺血2h后輕輕提拉所留線頭至有阻力時(shí)再灌注24h，分別于術(shù)前30min、再灌注即刻、再灌注12h舌靜脈注射蓮心堿3mg/kg，缺血再灌注組舌靜脈注射同等劑量生理鹽水，假手術(shù)組不給于處理。

1.2.2腦缺血體積的測(cè)量 大鼠斷頭取腦，去除嗅球、小腦及低位腦干后，腦組織放于-20℃冰箱中，冷凍20min，取出后間隔3mm連續(xù)做冠狀切片，置于1%TTC磷酸緩沖液中，37℃下恒溫避光孵育30min，正常組織染成紅色，梗塞灶染成白色，腦片置4%多聚甲醛固定，數(shù)碼相機(jī)拍照，多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行處理,計(jì)算出大鼠的梗死灶體積和體積百分比。

1.2.3腦組織勻漿制備 大鼠再灌注24h，斷頭處死，立即于冰浴上取出損傷側(cè)的大腦皮層，稱取0.5g前腦組織，置于4.5ml 4℃勻漿介質(zhì)中充分研磨使組織勻漿化，4℃ 3 000r離心10min，上清液即為腦組織勻漿，留取1ml置-20℃貯存待測(cè)。

1.2.4腦組織NO含量和總NOS、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活力測(cè)定 嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明，以硝酸還原酶法測(cè)定腦組織勻漿中NO含量，NO活性單位以μmol/g表示。以化學(xué)比色法測(cè)定總NOS活性，并根據(jù)對(duì)鈣的依賴性測(cè)定iNOS并測(cè)定誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活力。

2 結(jié) 果

2.1腦缺血體積變化經(jīng)TTC染色后，缺血再灌注組大鼠腦梗死體積百分比為(28.91%±3.71%)，與假手術(shù)組比較明顯增多(Plt;0.01)；蓮心堿組腦梗死體積百分比為(10.33%±2.87%)，與缺血組比較明顯減少(Plt;0.01)。

2.2各組大鼠NO、NOS和iNOS的比較與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組大鼠腦組織中NO、NOS和iNOS水平明顯升高；與缺血再灌注組比較，蓮心堿組大鼠腦組織NO、NOS和iNOS水平明顯降低。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠腦組織NO、NOS和iNOS的檢測(cè)結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，**Plt;0.01；與缺血再灌注組比較，△Plt;0.05。

圖1 對(duì)照組Hsp-70陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(×40) 圖2 預(yù)處理組Hsp-70陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(×40)

圖3 對(duì)照組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(×40) 圖4 預(yù)處理組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(×40)

3 討 論

蓮心堿是從中藥蓮子芯中提取分離得到的雙芐基異喹啉類化合物，具有降壓、抗心律失常等心血管活性[2]。蓮子心中含有主要生物堿有蓮心堿、甲基蓮心堿、異蓮心堿等。文獻(xiàn)報(bào)道與蓮心堿同屬蓮子心主成分的另一生物堿——甲基蓮心堿，具有減輕光化學(xué)誘導(dǎo)大鼠腦缺血的作用，其機(jī)制可能與對(duì)抗腦缺血時(shí)NO、Ca2+的病理性改變有關(guān)[9]，另有文獻(xiàn)報(bào)道異蓮心堿對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血損傷具有保護(hù)作用與其抗脂質(zhì)過(guò)氧化，氧自由基生成和增強(qiáng)氧自由基的清除有關(guān)[3]。前期研究表明蓮心堿可減輕腦缺血/再灌注所造成的損傷，改善腦功能[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，蓮心堿可能通過(guò)降低NO的神經(jīng)毒性而對(duì)缺血再灌注腦損傷發(fā)揮保護(hù)作用，但缺血再灌注腦損傷的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，各種因素間可能相互促進(jìn)、相互影響，蓮心堿究竟是通過(guò)直接還是間接途徑降低NO的神經(jīng)毒性，值得進(jìn)一步探討。

[1]張建新，張會(huì)欣，李蘭芳，等.大鼠局灶性腦缺血后一氧化氮合酶基因表達(dá)的變化[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2005，21(3)：246-247.

[2]許磊，姚崇舜，陳濟(jì)明.蓮心堿的研究概況[J].中草藥，2000，31(12)：955-957.

[3]徐俊英，彭佳林，王嘉陵.異蓮心堿對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2005，25(11)：1026-1028.

[4]余萬(wàn)桂，張道明，鄧德明，等. 蓮心堿對(duì)大鼠局灶性腦缺血的保護(hù)作用[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自然版)醫(yī)學(xué)卷，2006，3(3)：213-214.

[5]Longa EZ，Weistein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20(1)：84-91.

[6]Samdani AF, Dawson TM, Dawson VL. Nitric oxide synthase in models of focal ischemia[J]. Stroke,1997，29:1283-1288.

[7]Plotkine M, Margaill I. NO synthases: new pharmacological targets incerebrovascular accident[J]. Therapie, 2002，57(6): 548-553.

[8]Holtz ML, Craddock SD, Pettigrew LC. Rapid expression of neuronal and inducible nitric oxide synthases during post-ischemic reperfusion in rat brain[J]. Brain Res, 2001，898(1): 49-60.

[9]劉劍萍，唐偉軍，吳俊，等.甲基蓮心堿對(duì)光化學(xué)誘導(dǎo)大鼠腦缺血損害的保護(hù)作用[J].中國(guó)臨床藥學(xué)雜志，2002，11(5)：267-269.

[10]余萬(wàn)桂，張恒文，鄧德明，等.蓮心堿對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中藥藥理與臨床，2007，23(3)：23-25.

[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.04.002

R364.12

A

1673-1409(2009)04-R003-03

2009-09-17

湖北省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目(JXzb74)；長(zhǎng)江大學(xué)校基金項(xiàng)目(05Z1809)

余萬(wàn)桂(1970-)，女，湖北荊州人，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事生理學(xué)教學(xué)與研究工作。