羅　彪　梁　謹　黃世慶　黃　冰　侯雙雁　黃嵩峰

【關(guān)鍵詞】小檗堿；鼻咽癌；CNE-2細胞；鈣含量

文章編號：1003-1383(2009)01-0086-02

中圖分類號：R 739.63

文獻標(biāo)識碼：Bお

研究表明，小檗堿對鼻咽癌細胞有明顯的抑制作用［1］。細胞內(nèi)線粒體參與了腫瘤細胞增殖、凋亡的過程，線粒體的功能與線粒體膜的通透性即跨膜電位差密切相關(guān)。有實驗證實［2］，細胞內(nèi)大量鈣離子儲存于線粒體內(nèi)，鈣離子在誘導(dǎo)細胞凋亡中起重大作用。本研究小檗堿作用于體外培養(yǎng)的人鼻咽癌CNE-2細胞，觀察CNE-2細胞內(nèi)鈣離子濃度水平變化，探討小檗堿對鼻咽癌CNE-2瘤株抑制的分子機理。

材料和方法

1.藥品小檗堿由本院自行采集， RPMI-1640 培養(yǎng)基為 Gibco-BRL產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。鈣離子熒光指示劑：Fluo-3/AM為Sigma公司產(chǎn)品，用二甲基亞砜(DMSO)配成1.0 mM濃度。

2.細胞株人鼻咽癌CNE-2 細胞株購自中科院上海生命科學(xué)院細胞庫，本院傳代保存。

3.方法

(1)細胞培養(yǎng):CNE-2細胞株常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的 RPMI-1640 完全培養(yǎng)液（青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 U/ml，谷氨酸 30 μg/ml）置37℃， 5%CO₂、飽和濕度中培養(yǎng)，所有實驗均在細胞處于對數(shù)生長期進行。

(2)生長抑制實驗［1］：取對數(shù)生長期細胞，用完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞數(shù)為 1×10⁶個/ml，接種于 96 孔板， 24 h后分別加入終濃度為：20 mg/L，40 mg/L的小檗堿，同時設(shè)置空白對照組（加實驗組等體積培養(yǎng)液做對照），每組6復(fù)孔。藥物作用48 h后，進行流式細胞儀檢測。

(3)細胞內(nèi)鈣離子含量測定：①IECa測定方法［3］：用不含Ca、Mg的磷酸鹽緩沖液(PBS)2 ml漂洗細胞2次（1000轉(zhuǎn)/分，5分鐘），棄上清后，用PBS稀釋，調(diào)節(jié)CNE-2細胞數(shù)為6×105/ml配成細胞懸液。取兩支5 ml試管，第1支加細胞懸液490 μl和10 μl 1.0 mM的Fluo-3/AM液；第2支僅取500 μl細胞懸液，不加Fluo-3/AM液，兩支試管均在37℃條件下孵育30分鐘，用無Ca²⁺PBS緩沖液洗滌細胞2次，最后加500 μl無Ca²⁺PBS緩沖液待檢。②CNE-2細胞內(nèi)鈣離子(IECa²⁺)的流式細胞定量檢測:應(yīng)用FACSCalibur型流式細胞儀(美國BD公司生產(chǎn))。每份標(biāo)本(包括Fluo-3/AM染色管和無Fluo-3/AM染色管)均收檢2萬個CNE-2細胞。激光源為488 nm氬離子激光，取數(shù)之點圖X軸取前向散射(FSC)Y軸取側(cè)向散射(SSC);以組方圖檢測熒光強度:熒光素Fluo-3強度為X軸、Y軸為細胞數(shù)。③熒光散射強度FL3-H以對數(shù)(log值)放大，計算機存儲檢數(shù)據(jù)。檢測條件(包括染色時間、濃度、溫度及電壓等)保持穩(wěn)定。以CellQuestPlot軟件(BD公司生產(chǎn))分析每例樣品Fluo-3/AM染色管或無Fluo-3/AM染色管CNE-2細胞熒光強度(平均道數(shù)值)，得出每例IECa含量(以細胞內(nèi)鈣離子指數(shù)表示IECa²⁺):

IECa²⁺＝(受Fluo-3/AM作用后CNE-2細胞熒光強度平均道數(shù))/(無FLuo-3/AM作用CNE-2細胞熒光強度平均道數(shù))×1000

結(jié)果

20 mg/L、40 mg/L小檗堿對人鼻咽癌細胞CNE-2作用后細胞內(nèi)鈣離子濃度變化，經(jīng)小檗堿處理CNE-2細胞內(nèi)鈣離子含量增多，與空白組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)。見表1。

討論

小檗堿對很多腫瘤細胞生長、繁殖有抑制作用，對鼻咽癌細胞有明顯的抑制作用［1］，但作用的分子機制尚不清楚。離子鈣是細胞內(nèi)外Ca²⁺唯一的生理活性形式，作為細胞內(nèi)反應(yīng)的第二信使，在細胞的生理調(diào)控中起著重要的作用。線粒體參與了腫瘤細胞增殖、凋亡的過程。在腫瘤細胞凋亡早期，線粒體首先出現(xiàn)形態(tài)改變，同時它參與細胞呼吸、氧的代謝、酶活性和能量供應(yīng)。這些功能與線粒體膜的通透性即跨膜電位差密切相關(guān)。線粒體以一種獨特的方式調(diào)控著與細胞凋亡有關(guān)的因子如鈣離子等。線粒體釋放這些因子可抑制或促進細胞凋亡，因此，被認為是凋亡調(diào)節(jié)中心［4］。細胞內(nèi)大量鈣離子儲存于線粒體內(nèi)，鈣離子在誘導(dǎo)細胞凋亡中起著主要作用［2］。本研究顯示，小檗堿可上調(diào)鼻咽癌細胞CNE-2內(nèi)IECa²⁺含量，提示小檗堿通過改變細胞內(nèi)鈣離子的變化影響線粒體的功能，參與腫瘤細胞增殖、凋亡的過程，其他參與小檗堿抗鼻咽癌CNE-2細胞增殖和促凋亡機制有待深入研究闡明。

參考文獻

［1］羅彪，韋啟后，梁謹，等.小檗堿對人鼻咽癌細胞生長的抑制作用［J］.右江醫(yī)學(xué)，2006，34(4):373-374.

［2］Fernandez MC，Bick RJ.Apoptosis Suppression by bcl-2 is correlated with the regulation of nuclear and cytosolic Ca²⁺［J］.Oncogene，1996，129110:2259-2265.

［3］尹格平，郝天羽，袁瑋，等.妊高征患者外周血紅細胞內(nèi)鈣含量測定及其臨床價值［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2001，9（2）：20-23.

［4］羅菲君，胡智，曹亞，等.茶多酚誘導(dǎo)鼻咽癌cyclin D1表達下調(diào)［J］.癌癥，2001，20（4）：358-362.

(收稿日期：2008-12-30修回日期：2009-02-10)

(編輯：潘明志)