李立梅　趙曉青　郭忠輝　王靜力

【摘 要】 通過研究棉酚衍生物—?；撬崦薹樱℅SNH）對大鼠精子乳酸脫氫酶的作用機(jī)理發(fā)現(xiàn)，隨著大鼠服藥量的累加，作為精子活動能源的主要酶系之一，乳酸脫氫酶（LDH）的X-同工酶（LDH-X）逐漸減弱至消失，GSNH通過競爭抑制精子線粒體特異性酶—LDH-X，使精子的濃度能量來源被徹底阻斷，從而產(chǎn)生了抗生育作用。

【關(guān)鍵詞】 棉酚衍生物; 乳酸脫氫酶; 機(jī)理; 抗生育

棉酚（Gossypol）是我國首創(chuàng)的男性避孕藥，對棉酚的研究和臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，長期使用棉酚具有一定的毒副作用[1]。為達(dá)到既保持棉酚抗生育性能，又降低棉酚毒副作用的目的，我們進(jìn)行了棉酚的分子結(jié)構(gòu)改造[2-4]，合成了棉酚衍生物GSNH，并對它的抗生育機(jī)理進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)GSNH作用機(jī)理與棉酚相似，GSNH通過競爭抑制精子線粒體特異性酶—LDH-X，使精子的能量來源被徹底阻斷，從而發(fā)生了抗生育作用。

1材料與方法

1．1主要材料、試劑與大型儀器

（1）GSNH，由吉林省人口生命科學(xué)技術(shù)研究院實驗室提供。（2）棉酚、醋酸棉酚(山東中醫(yī)藥大學(xué)提供)和GSNH溶液配制：先分別以1%羧甲基纖維素（CMC）助溶，再以蒸餾水稀釋，配制成所需要的濃度。（3）Wistar大鼠，由吉林大學(xué)動物室提供，平均體重230g。（4）所用各種酶及顯色物質(zhì)等生化試劑均為Sigma產(chǎn)品；普通試劑為分析純以上。（5）紫外分光光度計，日本島津UV-260。（6）超聲細(xì)胞粉碎儀，美國Soniprep150。（7）低溫高速離心機(jī)，美國Beckman J2-MC。（8）電泳儀。

1．2實驗方法

1．2.1動物分組、劑量及給藥方法健康成熟雄性大鼠，平均體重230g；40只大鼠分成四組， 10只/組。分別為陽性對照組、樣品高劑量組、樣品低劑量組、陰性對照組。陽性對照組給醋酸棉酚30mg/（kg?d）；陰性對照組給服同樣量的0.5%的CMC；樣品高劑量組給服GSNH 30mg/（kg．d）；樣品低劑量組給服GSNH 15mg/(kg?d)。自制胃管灌喂實驗動物6次/周，連續(xù)56天。

1．2.2提取將大鼠解剖，取睪丸及附睪，首先去除睪丸周圍的脂肪、剝除被膜、稱重、分離得到精子，即睪丸組織按1：6加入蔗糖-Tirs-DETA緩沖液（0.2M蔗糖、5mMTris、1mMEDTA、PH 7.5），剪碎組織，1700g離心5min，上清則為精子溶液，再3000g離心10min，沉淀加去離子水在-30℃冰箱中放置2h，室溫結(jié)凍后，在水浴中超聲勻漿30sec，共3次，1000g離心10min后，取上清為精子勻漿液做電泳分離。

1．2.3電泳條件及實驗方法聚丙烯酰胺盤狀電泳分離同功酶，加以下顯色液作用顯示LDH同功酶：①1M乳酸鈉；②硝基四氮唑蘭（NBT）1mg/ml；③磷酸緩沖液0.5M PH 7.5；④輔酶I（NAD+）10mg/ml；⑤吩嗪甲酯硫酸鹽（PMS）2mg/ml；⑥5mM MgCl2溶液。按3∶7.5∶7.5∶3∶0.75∶3比例混合，在37℃暗處保溫45~120min，至同功酶區(qū)帶清晰可見，取出膠柱，用水洗去顯色液，7.5%醋酸終止酶促反應(yīng)，觀察結(jié)果。

2結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠精子的乳酸脫氫酶同功酶電泳中，陰性對照組精子勻漿經(jīng)電泳分離顯色后可分成6條紫色的區(qū)帶，泳動最快的是LDH-1，最慢的是LDH-5，在LDH-3、LDH-4之間出現(xiàn)反應(yīng)最強(qiáng)和區(qū)帶最寬的是LDH-X。

服GSNH后，電泳分離、顯色觀察可見，LDH-1至 LDH-5的區(qū)帶強(qiáng)度、寬度變化不大，而LDH-X區(qū)帶明顯減弱至消失，服用GSNH的劑量對LDH-X區(qū)帶寬度和強(qiáng)度有影響，高劑量組變化比低劑量組變化大，作為陽性對照組的棉酚也出現(xiàn)同樣的結(jié)果。

3討論

LDH-X為精子的特異性酶，它占精子LDH總量的40%~50%，在男性生殖生理中具有重要的意義。它只存在于生精細(xì)胞的精母細(xì)胞和精子細(xì)胞的成熟精子中，支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)沒有LDH-X，它定位于精子的線粒體中，為精子活動能源的主要酶系之一，有關(guān)棉酚對人、大小鼠、豬和牛等動物睪丸的LDH-X有抑制作用的研究，早就有過報道，同時有研究表明精子和精漿中，LDH-X活性與男性不育有密切關(guān)系。從本實驗的結(jié)果看， GSNH與棉酚對大鼠精子LDH-X的抑制作用基本一致，隨著服用藥量的累加，LDH-X逐漸減弱至消失，可能由于GSNH對線粒體造成的損傷，導(dǎo)致了酶活性的改變?？梢?，GSNH對LDH-X活性的影響可作為檢驗精子受損的指標(biāo)，說明經(jīng)過分子改造后的GSNH，沒有造成棉酚抗生育作用位點(diǎn)及機(jī)理的改變。

服GSNH后，損傷最明顯的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)是線粒體和膜結(jié)構(gòu)，作為無氧呼吸的重要酶， LDH-X的活性被競爭性地抑制，也就是說，精子線粒體內(nèi)膜受損后，阻礙了三羧酸循環(huán)，有氧呼吸被阻斷，從而發(fā)生了抗生育作用。

我們還對GSNH的抗生育機(jī)理及長期使用的安全性等方面進(jìn)行進(jìn)一步研究，使之成為一種安全、有效、可靠的男用避孕藥，也使深入研究棉酚衍生物抗生育作用呈現(xiàn)出新的希望。

參考文獻(xiàn)

1 男用節(jié)育藥全國協(xié)作組.一種新的男性節(jié)育藥—棉酚[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,1978,58（8）：455-458.

2 National Coordinating Group on Male Anthertility Agents. Gossypol-a new antifertility agent for males[J].Chin Med J， 1978，4:417.

3 Wang YE, Luo YD, Tang XC. Studies on the antifertility effects of cottonseed meal and gossypol. Acta[J].Pharm Sin， 1979，14:662.

4 Huang JX ,Zhao SX, Gu ZP, Zhu YQ, Ji RY. Synthesis of gossypol derivatives and their antifertility action[J].Reprod Contracep, 1986,6:48.

［收稿日期:2009-04-12］