曲恒怡

[摘要] 目的探討PUMA在移植胰腺缺血再灌注損傷中的早期促凋亡作用。方法對(duì)封閉群大鼠建立大鼠腔靜脈內(nèi)分泌引流、腸道外分泌引流的動(dòng)物模型.再灌注后第0 、1 、2 、3 、4 、6 、9 、12 h 等時(shí)點(diǎn), 每時(shí)點(diǎn)處死5只大鼠,切取移植胰腺,石蠟包埋切片,原位DNA缺口末端標(biāo)記( TUNEL) 法測(cè)定胰腺組織細(xì)胞凋亡, Western blot方法測(cè)定移植胰腺組織PUMA,bcl-2 、bax、 caspase-3蛋白表達(dá). 結(jié)果再灌注術(shù)后第0 、1 、2 、3 、4 、6 、9 、12 h,胰腺細(xì)胞凋亡數(shù)分別為(29.42 ±4.93) 、(47.65 ±6.43) 、(74.8 ±9.73) 、(106.35 ±16.8) 、( 148.71 ±19.50) 、(123.96 ±15.54) 、( 97.32 ±10.6) 和(57.42 ±9.56)個(gè)/ 高倍視野。各時(shí)點(diǎn)均顯著高于正常胰腺23.48 ±4.26。第4小時(shí)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增高,12小時(shí)降低到最低值,不同組細(xì)胞凋亡數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( v=42 t=2.785P<0.01); PUMA以及其下游的 bax和caspase-8蛋白表達(dá)在第4小時(shí)達(dá)到最高峰, 12小時(shí)降低到最低值, bcl-2在第4小時(shí)達(dá)到最低值,蛋白表達(dá)差異分別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 以后逐漸升高,12小時(shí)降低到最低值, PUMA表達(dá)與各時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞凋亡數(shù)有明顯的正相關(guān) ( n=5,r=1.00,p<0.05)結(jié)論I/RI后細(xì)胞早期凋亡與PUMA活化有關(guān), PUMA是通過調(diào)節(jié)下游bax、caspase-8、bcl-2基因發(fā)揮凋亡促進(jìn)作用。

[關(guān)鍵詞] 胰腺移植; 缺血再灌注損傷;凋亡;PUMA蛋白;

[中圖分類號(hào)] R364.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1004-8650(2009)12-032-02

近年來大量研究表明,細(xì)胞凋亡是器官移植缺血-再灌注損傷( ischemia-reperfusioninjury,I/RI)的早期事件[1],但細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)理不明。PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis)是2001年發(fā)現(xiàn)的p53下游促凋亡基因,是bcl-2家族BH-3亞家族中的成員,PUMA在受到p53、缺氧、放射、化療、等刺激信號(hào)下迅速被激活,從而導(dǎo)致PUMA下游bcl-2家族基因的活性改變,引起細(xì)胞色素C的釋放和Caspase酶的活化,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[2-3]。本研究應(yīng)用大鼠胰十二指腸移植模型, 探討PUMA在大鼠胰十二指腸移植I/RI中的早期凋亡促進(jìn)作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:43只(對(duì)照組3只)清潔級(jí)封閉群SD大鼠(供體), 體質(zhì)量250～ 300g ,雄性;清潔級(jí)封閉群W istar大鼠, 40只,體質(zhì)量300-350g, 雄性, 均由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑:鼠抗人PUMA多克隆抗體購自Cell Signals公司,兔抗鼠bcl-2 、bax、 caspase-3、Actin多克隆抗體和Western bloting試劑購自Santa Cru公司,細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1 大鼠胰腺移植動(dòng)物模型的制備:見文獻(xiàn)[4]。

1.2.2移植模型的分組和處理:移植模型共分為8組,每組5只;各組大鼠于胰腺再灌注后取移植胰腺。第1-8組分別于移植后0h 、1h、 2h 、3h、 4h、6h、 9h、 12h進(jìn)行,取出胰腺立即放入-800C冰箱中保存?zhèn)溆?其中以正常SD大鼠3只做對(duì)照。

1.3TUNEL 法顯示胰腺細(xì)胞凋亡:實(shí)驗(yàn)方法、結(jié)果判斷、數(shù)據(jù)處理參見文獻(xiàn)[5]

1.4Western-blotting檢測(cè)蛋白表達(dá):參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》提取冰凍移植胰腺細(xì)胞總蛋白,測(cè)定濃度后各取100 ug蛋白,以actin為內(nèi)參照,Western-blotting檢測(cè)PUMA、bcl-2 、bax、 caspase-8蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)步驟按照說明書進(jìn)行。采用北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司 ChampGelTM3-4進(jìn)行 Western blotting圖像定量分析,計(jì)算各蛋白與內(nèi)參actin的比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué):數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差x ±s 表示 ,用 SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2結(jié)果

2.1手術(shù)時(shí)間:供體手術(shù)時(shí)間 47±2 min,袖套準(zhǔn)備2 ±1 min, 袖套吻合2.5±1 min, 熱缺血時(shí)間2 ± 3min, 受體手術(shù)時(shí)間 46±3 min,其中動(dòng)脈吻合10±2 min,冷缺血時(shí)間52 ±5min,與文獻(xiàn)[4]的結(jié)果一致.

2.2 移植胰腺細(xì)胞凋亡的檢測(cè): 再灌注術(shù)后第0 、1 、2 、3 、4 、6 、9 、12 h,胰腺細(xì)胞凋亡數(shù)分別為(29.42 ±4.93) 、(47.65 ±6.43) 、(74.8 ±9.73) 、(106.35 ±16.8) 、( 148.71 ±19.50) 、(1 23.96 ±15.54) 、( 97.32 ±10.6) 和(57.42 ±9.56)個(gè)/ 高倍視野, 正常胰腺細(xì)胞凋亡數(shù)為 23.48 ±4.26 個(gè)/高倍視野,不同組細(xì)胞凋亡數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( v=42 t=2.785P<0.01)

2.3凋亡相關(guān)基因的分析: PUMA、 bax、 caspase-8表達(dá)自1小時(shí)開始表達(dá)上調(diào),4小時(shí)表達(dá)最多,以后表達(dá)逐漸減少,12小時(shí)表達(dá)到最低;而bcl-2 表達(dá)自1小時(shí)開始表達(dá)下調(diào),4小時(shí)表達(dá)最少,以后表達(dá)逐漸增多,12小時(shí)達(dá)到最高,各自的表達(dá)差異分別有顯著性(P<0.05)。

3討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示: 細(xì)胞凋亡數(shù)自移植灌注后1小時(shí)開始明顯升高,4小時(shí)達(dá)到最高,以后逐漸下降,12小時(shí)達(dá)到最低, ,這與[1,6]的研究結(jié)果基本相同,說明細(xì)胞凋亡是胰腺移植I/RI后的早期事件。

Western blot發(fā)現(xiàn), PUMA在I/RI后4小時(shí)表達(dá)最明顯,以后逐漸下降,12小時(shí)后降到最低水平,并且PUMA蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡具有明顯的正相關(guān), 說明I/RI后早期細(xì)胞凋亡與PUMA高度活化有關(guān).與此同時(shí),PUMA下游bax、 caspase-8促凋亡蛋白也遵循PUMA的表達(dá)變化,而PUMA下游的bcl-2抑凋亡蛋白與PUMA的表達(dá)規(guī)律相反,說明PUMA是通過調(diào)節(jié)下游的bax、caspase-8、bcl-2基因發(fā)揮凋亡促進(jìn)作用的.我們的實(shí)驗(yàn)提示,抑制PUMA基因活化可能有助于預(yù)防I/RI后早期細(xì)胞凋亡.該研究為以后的I/RI的防治提供理論依據(jù).

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[3] Nakano, K.H. Vousden. PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced by p53[J].Mol. Cell ,2001,12(7): 683–694.

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(收稿日期2009-10-18)