戴晨陽　梁樹人　李　萍　李秀梅　徐　健　劉　莉

[摘要]目的：建立和應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR)檢測慢性乙型肝炎患者肝組織中乙型肝炎病毒(HBV)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)。方法：應(yīng)用選擇性PCR的方法檢測30例乙肝患者肝組織中cccDNA，同時(shí)驗(yàn)證此方法的特異性。結(jié)果：31例慢性乙型肝炎患者肝組織中，10例HBV cccDNA陽性，陽性率為32.3％。HBV cccDNA陽性組的ALT、HBV DNA、和HBeAg水平均明顯高于陰性組(P<0.01和P<0.05)。結(jié)論：該方法操作簡單，特異性好，可用于測定肝組織中HBV cccDNA，用于了解乙肝患者病情和傳染性強(qiáng)弱以及評(píng)價(jià)抗乙肝病毒藥物的療效。

[關(guān)鍵詞]乙型肝炎病毒；共價(jià)閉合環(huán)狀DNA；聚合酶鏈反應(yīng)；慢性乙型肝炎

[中圖分類號(hào)] R512.6+2[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1673－7210(2009)02(c)－016－03

在感染的肝細(xì)胞核內(nèi)可檢測到一種不同形式的病毒DNA共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cc－cDNA)，不與蛋白共價(jià)結(jié)合。cccDNA是嗜肝DNA病毒科病毒基因組的復(fù)制中間體，是嗜肝DNA病毒mRNA和前基因組RNA的合成模板，雖然其含量較少，但對(duì)乙肝病毒的復(fù)制以及感染狀態(tài)的建立具有十分重要的意義，是嗜肝病毒持續(xù)感染的關(guān)鍵因素。因此，我們選擇其特異性引物，建立了乙肝病毒肝組織的cccDNA檢測方法。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象

慢性乙型肝炎患者肝組織標(biāo)本31例和2例HBV DNA陽性肝癌肝組織標(biāo)本；HBV DNA陽性血清標(biāo)本1例，HBV DNA含量為107 copies/ml；HBV DNA陰性血清標(biāo)本和HBV陰性肝組織標(biāo)本各l例作為陰性對(duì)照，－70℃保存。診斷符合2000年第十次全國病毒性肝炎與肝病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2儀器

PCR自動(dòng)循環(huán)儀，AG－9600 Thermal Station，AcuGen Sva－terns。

1.3引物的設(shè)計(jì)和合成

由于松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)的正鏈和負(fù)鏈上均存在缺口，故可以設(shè)計(jì)跨越兩個(gè)缺口的引物，使rcDNA不會(huì)被擴(kuò)增，而cccDNA由于為完整的雙鏈結(jié)構(gòu)，則可以被選擇性擴(kuò)增，通過GENERUN軟件設(shè)計(jì)一對(duì)跨越缺口的最佳引物，BA3為：5－CCG ACC ACG GGG CGC ACC TCT CTI"TAC G－3，BA4為：5－CAA GGC ACA GCT TGG AGG CTT GAACAGT－3，擴(kuò)增目的基因片段為373 bp。

同時(shí)，另設(shè)計(jì)一對(duì)引物，正義引物和反義引物均位于負(fù)鏈缺口下游雙鏈區(qū)域，能同時(shí)擴(kuò)rcDNA和cccDNA。BAl為：5'－GCC TCC AAG CTG TGC CTT G－3；BA2為：5－TCT GCGACG GCG ATT GAG－3。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1肝組織勻漿制備取肝組織100－200 mg于樣品管中，用干凈的剪刀將組織塊剪碎，加NS約500μl，勻漿30s，放人離心管中，離心10min(2000 r/min)。

1.4.2PCR擴(kuò)增HBV cccDNA在10μl模板中加入PCR反應(yīng)液40μl，混勻。50 μl反應(yīng)體系中，含10xPCR buffer，引物BA3和BA4各200ng/ml，鎂離子終濃度為2mmol/L，dNTP終濃度為200 μmol/L，TaqDNA聚合酶為2U?；靹螂x心，覆蓋滅菌液體石蠟油。PCR條件為：94℃預(yù)變性5 min，然后按以下參數(shù)擴(kuò)增：94℃，45s；55℃，45s；72℃，45s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min，最后4℃→∞，得到PCR產(chǎn)物。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均設(shè)陰性及陽性對(duì)照。

1.4.3 PCR產(chǎn)物的檢測用1％瓊脂糖電泳，0.5μg/ml溴化乙錠(EB)染色后，與標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)比，PCR產(chǎn)物的預(yù)計(jì)分子量為373 bp。

1.4.4特異性檢測取上述乙肝患者血清、HBV DNA陽性肝癌患者肝組織以及HBV陰性肝組織標(biāo)本和陰性血清標(biāo)本，用BA1/BA2進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為50μl，循環(huán)參數(shù)為：94℃，5min；94℃，30s；62℃，30s；72℃，45s，共38個(gè)循環(huán)，72℃5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2％瓊脂糖電泳，得到PCR產(chǎn)物。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用t檢驗(yàn)或X²。檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增HBV cccDNA檢測見圖1。

2.2特異性檢測

用引物BA3/BA4進(jìn)行PCR檢測時(shí)，1例乙型肝炎患者血清和1例陰性血清標(biāo)本以及HBV陰性肝組織標(biāo)本PCB陰性，而2例HBV DNA陽性肝癌患者肝組織PCR陽性。當(dāng)用上述樣品行普通PCR擴(kuò)增時(shí)，BA1/BA2擴(kuò)增1例陰性血清標(biāo)本和HBV陰性肝組織標(biāo)本仍為陰性，1例陽性血清標(biāo)本和2例HBV DNA陽性肝癌患者肝組織標(biāo)本為陽性。

2.3臨床標(biāo)本檢測結(jié)果

31例慢性乙型肝炎患者肝組織中，10例HBV cccDNA陽性，陽性率為32.3％。

2，4肝組織HBV cccDNA陽性組與陰性組血清HBV標(biāo)志及生化指標(biāo)比較

由表1可見，HBV cccDNA陽性組的ALT、HBV DNA載量均明顯高于陰性組(P<0，01)，HBV cccDNA陽性組的HBeAg檢出率明顯高于HBeAg陰性組(P<0，05)。

3討論

HBV感染肝細(xì)胞的標(biāo)志是HBV復(fù)制中間體。包括共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)、單鏈DNA(single－stranded DNA，ssDNA)以及HBV mRNA，通常eccDNA檢測方法為South－em印跡雜交，步驟繁瑣，檢測周期長達(dá)3－4d；放射性標(biāo)記探針可能造成環(huán)境污染和健康損傷，而非放射標(biāo)記探針敏感性又較差。因此，1996年Koek J等設(shè)計(jì)特異性引物，以PCR方法檢測eccDNA取得成功，并被廣泛應(yīng)用。

eccDNA是嗜肝DNA病毒科病毒基因組的復(fù)制中間體，是嗜肝DNA病毒mRNA和前基因組RNA的合成模板，通常情況下，HBV感染宿主肝細(xì)胞后,HBV基因組進(jìn)入肝細(xì)胞核內(nèi)為不完整的雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，即rcDNA。HBV rcDNA解脫負(fù)鏈5端連接的末端蛋白，正鏈5端的RNA殘段，以HBVDNA聚合酶延長正鏈，將各鏈的缺口補(bǔ)平，最后轉(zhuǎn)變成HBV cccDNA的形式。

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)HBV DNA的復(fù)制原理，環(huán)狀HBV基因組缺口部分正、負(fù)鏈的序列，分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物。當(dāng)用跨越兩個(gè)