310007 南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院 田雅軍 徐展 呂珍

·綜述·

胃癌的基因治療研究

310007 南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院 田雅軍 徐展 呂珍

腫瘤從本質上說是一種多基因病，其發(fā)病涉及多階段的基因事件，最終導致正常細胞轉變成腫瘤細胞。腫瘤的基因治療是通過轉入核苷酸序列進入正常細胞或腫瘤細胞，導致腫瘤細胞直接死亡，改變針對腫瘤的免疫反應，或糾正某些基因的異常，逆轉腫瘤的惡性進程，增強腫瘤細胞對放療和化療的敏感性，提高正常組織細胞對放、化療毒副反應的耐受力，最終達到縮小和消滅腫瘤的目的?；蛑委熤凶罨镜膯栴}是：①如何選擇目的基因。②將目的基因高效地導入載體與靶細胞，并在其中表達。③能有效地回輸至體內，并發(fā)揮作用[1]。胃癌為一高發(fā)、高惡性度、預后不良的惡性腫瘤，長期以來臨床手術切除及輔助性化療、放療措施的應用，并沒有帶來滿意的生存率，其死亡率在我國居惡性腫瘤的首位。胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的基因改變近年來受到重視，如何用基因方法或以基因作為靶點來防治胃癌亦成為近年來研究的熱點。本文對近幾年國內外胃癌的基因治療進展作如下綜述。

1 胃癌發(fā)病的分子基礎[2]

1.1 抑癌基因的變化①p53基因的錯義突變、框架移位和雜合性缺失(LOH)，在胃癌和腸化異型增生病變中被發(fā)現(xiàn)。②APC基因在20%～50%胃癌中產生突變，APC突變出現(xiàn)在胃癌的啟動早期，其LOH在彌漫型胃癌中有較高發(fā)生率，提示其基因產物可影響細胞黏附能力和移動性。③DCC基因表達的降低與黏膜細胞的黏附特性改變及生長調節(jié)失控有關，其LOH可在50%腸型胃癌中發(fā)現(xiàn)。

1.2 癌基因的變化①bcl-2基因過度表達時可抑制凋亡，并在上皮細胞的永生化中起作用，它可參與腸型胃癌的早期啟動。②c-erbB2過度表達在90%腸型胃癌中出現(xiàn)。③c-met和k-sam與彌漫型胃癌有關，c-met過度表達導致腫瘤進展。

1.3 其他分子改變CD44基因的變異、細胞周期的負調節(jié)因子p21和p27的表達缺失、端粒酶的活性陽性、E-鈣粘蛋白基因的LOH和突變等常在胃癌中被檢測到。

2 胃癌相關基因[3]

2.1 癌基因已知與胃癌相關的癌基因有:c-myc，ras，hst，c-erbB-2，k-sam，n-myc，met，p53（突變型）等。它們通過點突變、擴增或易位在腫瘤的啟動、促癌以及進展階段過度表達，引起胃黏膜上皮細胞轉化和無限制的增殖，最終導致胃癌的形成、發(fā)展和轉化。在各種癌基因中ras基因特別是h-ras基因與胃癌的關系比較密切，其所編碼的蛋白質rasp12具有調節(jié)細胞生長和分化的功能，它的異常表達對細胞惡變和胃癌的惡性表型起著重要作用。此外，還有一些分子與胃癌細胞的增殖、分化、轉移等惡性行為有關。如增殖細胞核抗原(PCNA)、端粒酶、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、免疫抑制酸性蛋白(IAP)等。

2.2 抑癌基因抑癌基因存在于正常細胞中，是細胞正常增殖的穩(wěn)定因素，Rb基因是最早發(fā)現(xiàn)的人體抑癌基因。此后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種抑癌基因，和胃癌有關的有p53，DCC，APC，MCC等。p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關性最高的基因，定位于17號染色體短臂上。野生型p53基因（AdCA p53）在細胞損傷修復過程中，監(jiān)視著基因組DNA的完整性。當細胞受到射線或某些藥物作用而發(fā)生DNA損傷時，p53基因所編碼的蛋白能使細胞分裂停止在G1/S期，使細胞充分修復DNA的損傷使之恢復正常。倘不能恢復，野生型p53基因還能啟動細胞的凋亡過程從而引導細胞的程序性死亡，阻止具有癌變傾向的突變細胞出現(xiàn)。但野生型p53基因很容易發(fā)生突變，轉變成突變型p53基因。突變型p53基因不但喪失了抑制腫瘤發(fā)生的作用，反而具有致癌作用，成為癌基因。定位于18號染色體長臂的DCC基因，定位于5號染色體短臂的APC基因和MCC基因也是近年來發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，它們的缺乏或突變常見于結、直腸癌，也可在胃癌中發(fā)現(xiàn)。此外nm23和p16基因也被認為是腫瘤抑制基因。

3 胃癌的基因治療策略

3.1 基因置換基因治療基因置換是轉移外源正?；蚧虺；罨幕蛉〈惓Ｓ腥毕莸哪[瘤抑制基因。目前在胃癌基因治療研究中最多的是p53和GCF兩個抑癌基因。

研究較深入的是p53基因置換治療。Steele等[4]報告有大約60%胃癌患者的腫瘤細胞有p53基因的點突變，由于p53基因表達的核蛋白被認為在細胞DNA損傷后的細胞調控中處于中心地位，因此應用野生型p53基因進行基因置換治療胃癌極具吸引力。Ohashi等[5]研究了重組腺病毒介導的野生型p53基因轉染治療胃癌細胞株MKN1、MKN7、MKN28、MKN45、TMK-1在體外和動物體內的作用，結果表明，導入了野生型P53基因的人胃癌細胞株生長明顯受抑制，而未導入的表現(xiàn)為p53基因的細胞株則無此現(xiàn)象；流式細胞儀和DNA檢測表明，AdCA p53對胃癌細胞的機制是導致細胞凋亡。此外，野生型p53基因置換后的腫瘤細胞能恢復對放療、化療的敏感性[6]。因此，p53基因置換治療胃癌是一種可行的有效方法。GCF基因置換治療：GCF基因是一種與人類胃癌有密切關系的抑癌基因，其結合于表皮生長因子受體基因啟動子上富含GC核苷酸序列的特異性區(qū)域，能夠抑制表皮生長因子受體基因的轉錄，從而降低轉化生長因子、胰島素樣生長因子Ⅱ等其他生長因子的表達。Kitadai等[7]將GCF基因轉染人胃癌細胞株TMK-1和MKN-28，結果被轉染的細胞株不能在無血清的培養(yǎng)基中生長，動物試驗同樣證實轉染了該基因的胃癌細胞接種于裸鼠皮下，其生長明顯減慢。

3.2 反義核酸基因治療反義基因治療就是應用反義核酸在轉錄和翻譯水平阻斷某些異?；虻谋磉_，以期阻斷瘤細胞內的異常信號傳導，使瘤細胞進入正常分化軌道或引起細胞凋亡，或抑制自分泌生長因子的分泌，封閉其受體以改變腫瘤的生物學特性達到治療腫瘤的目的。

增殖細胞核抗原(PCAN)是一種能通過δ-DNA聚合酶誘導DNA合成的核蛋白，其基因表達在胃癌細胞中顯著增高，并與胃癌的侵襲、轉移有關，因此利用反義基因技術，合成PCAN的反義cDNA與其相互作用，以抑制或封閉其表達。Sakakura等[8]構建了反義寡核苷酸的真核表達質粒，將其轉染入7種不同的胃癌細胞株，發(fā)現(xiàn)轉染后的胃癌細胞與親本細胞相比，其生長速度均有不同程度的抑制，軟瓊脂集落形成能力減弱，活性降低，并在10～40 mmol/L的濃度下具有劑量、效應關系。這一結果表明，PCAN與胃癌細胞的異常增殖有關，通過反義技術抑制PCAN基因的表達可對胃癌細胞的惡性表型產生逆轉作用，達到控制胃癌生長作用。因此采用反義技術來封閉PCAN的表達不失為胃癌基因治療的一條途徑。Bcl-2基因亦是一種細胞凋亡抑制基因，它是通過影響細胞內Ca2+通道及IL-2β轉化酶(ICE)的表達和釋放而抑制細胞凋亡，并與bax、TNF、Fas的結合與調節(jié)有關，它雖不促進細胞增殖，但可明顯延長細胞的存活時間，在胃癌中常有過度的表達。肖冰等[9]采用反義核酸技術構建Bcl-2反義真核表達載體(PDOR-Bcl-2-cDNA)，采用脂質體轉染胃癌細胞株SGC-7901，結果發(fā)現(xiàn)轉染反義重組基因的胃癌細胞Bcl-2的表達明顯減少，說明反義Bcl-2可以有效阻止胃癌細胞Bcl-2的表達。c-myc癌基因是一種細胞凋亡抑制基因，其蛋白產物是調節(jié)細胞生長、分化的一種重要轉錄激活因子。在多數(shù)情況下，基因表達是細胞分裂周期中進入S期所必需的。腫瘤細胞常伴有基因表達失控。Chen等[10]在體內及體外用重組反義c-myc腺病毒治療人胃癌的研究發(fā)現(xiàn)，在SGC-7901細胞Ad-Asc-myc強烈抑制細胞生長和誘導細胞凋亡，對胃癌的基因治療來說，其具有潛在的臨床使用價值。

3.3 免疫基因治療由于在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中存在著機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的免疫耐受狀態(tài)，而這種狀態(tài)可能是既源于腫瘤細胞本身的免疫原性不強（如MHC表達不足），也可源于抗原遞呈細胞(APC)不能提供足夠的共刺激信號（如B7）或機體免疫因子分泌不足，或腫瘤細胞誘導機體的免疫抑制?；蛎庖咧委煹闹饕瓌t是提高宿主對腫瘤的免疫力?？梢詫⒛承┘毎蜃踊蝠じ椒肿拥幕蜣D染到機體免疫細胞或癌細胞中，以提高機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的識別和反應能力。目前腫瘤細胞靶向的細胞因子基因治療研究較多，該療法以主動性免疫治療為基礎，即將細胞因子基因轉染入腫瘤細胞中，制備出免疫原性更強的新型瘤苗，以激發(fā)機體產生顯著的抗腫瘤免疫功能從而達到治療腫瘤的目的。目前用于胃癌基因治療的細胞因子主要有TNF，IL-2，4，6，IFL-γ，GM-CSF等，均收到不同程度的治療效果。周志強等[11]構建人IL-2及IL-4真核表達載體，轉染人胃癌細胞株SGC-7901，發(fā)現(xiàn)轉基因細胞表達有活性的IL-2及IL-4，基因轉導不改變胃癌細胞的體外生長特性，并能增強LAK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，降低或消除胃癌細胞的體內致瘤性，并且發(fā)現(xiàn)轉基因細胞經大劑量射線照后，仍可以持續(xù)分泌IL-4，3～4周。證明該種瘤苗的安全性。Matsubara等[12]用逆轉錄病毒分別將IL-2，IL-4及GM-CSF基因導入胃癌細胞后，觀察射線對這些細胞代謝及細胞因子分泌的影響，所有細胞在接受6 Gy照射后細胞代謝部分抑制，劑量為20 Gy時完全抑制細胞代謝，而細胞因子的分泌則不受影響，即使在60 Gy照射后仍可檢測到有細胞因子分泌，這些特性對于設計新型瘤苗將是非常有益的。

3.4 自殺基因治療人們將正常細胞的程序性死亡稱為細胞自殺(cell suicide)，隨著對細胞自殺機制的研究，發(fā)現(xiàn)某些來自病毒或細菌的基因的表達產物可將原先對哺乳動物細胞無毒性或極低毒性的藥物轉換成毒性產物，從而導致這些細胞的死亡。因此，將這類基因轉入某一靶細胞，使之對某些藥物有特別的敏感性，利用這些藥物使其死亡，這類基因被稱為“自殺基因”。由于自殺基因的表達產物大多為將無毒性前體轉換為毒性產物的酶類，故又稱為“前藥轉換酶基因”。這種治療稱為腫瘤的“自殺基因”治療。目前，已發(fā)現(xiàn)和克隆的“自殺基因”有多種，如單純皰疹病毒的tk基因(HSV-tk)、胞嘧啶脫氨酶基因(CD)、細胞色素P-450基因等，其中HSV-tk和CD是目前應用最多的基因。Yoshida等[13]通過逆轉錄病毒介導HSV-tk轉染人胃癌TMK-1細胞株，再予以丙氧鳥苷(GCV)后，該胃癌細胞株的增殖明顯受到抑制。Tanaka等[14]將癌胚抗原(CEA)特異性啟動子和增強子組成的轉錄調控序列插入已經含HSV-tk的逆轉錄病毒載體后轉染至表達CEA胃癌細胞的效率大大提高。與應用常規(guī)啟動子構建的HSV-tk相比，CEA啟動子和增強子構建的HSV-tk轉染胃癌細胞后應用GCV治療，可明顯提高其對表達CEA胃癌細胞的殺傷作用[15]。40%的胃癌表達CEA，因此這些表達CEA的胃癌細胞株對該治療方法極為敏感。Lan等[16]以帶有CEA啟動子的腺病毒為載體，將CD轉染人胃癌細胞株MKN-45后接種于小鼠，對荷瘤小鼠全身性氟尿嘧啶(5-FU)治療，結果移植瘤生長顯著受抑，荷瘤小鼠存活期明顯延長，5-FU的不良反應較對照組明顯減輕。

3.5 端粒酶的基因治療端粒酶存在于各種惡性腫瘤細胞中，它具有復制染色體末端DNA，延長端粒長度和維持細胞增殖能力的作用，它的活化是惡性腫瘤細胞無限制增殖的重要基礎。楊金亮等[17]將人端粒酶RNA(hTR)基因反向重組真核表達載體pcl-neo中，轉染SGC-7901細胞，發(fā)現(xiàn)轉染細胞的生長明顯減慢，軟瓊脂中無克隆形成，在1×107個轉染細胞接種到裸鼠皮下均無腫瘤形成，進一步研究發(fā)現(xiàn)，轉染細胞p21基因表達增高，p27、Bcl-2和c-myc基因的表達下降。Shay等[18]對3 500例各種不同的腫瘤及其正常組織中端粒酶活性進行分析，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)腫瘤細胞表達端粒酶，而正常組織中端粒酶多呈陰性，從而認為端粒酶的活化穩(wěn)定了腫瘤細胞嚴重縮短的端粒，使過度增殖的細胞惡性變或永生化，而缺乏端粒酶的細胞則很快死亡。文獻研究表明胃癌中端粒酶陽性率高達92.3%，而正常胃黏膜中無端粒酶表達，因此端粒酶不僅可以作為腫瘤的診斷指標，更可以作為腫瘤基因治療的靶位。

3.6 耐藥基因治療各種腫瘤包括胃癌在內對化療藥物產生多耐藥性及大劑量化療藥物對骨髓的抑制作用是目前臨床化療失敗的主要原因。腫瘤的多耐藥表現(xiàn)為對結構、作用機制及作用部位各不相同的化療藥的交叉耐藥。近年來研究較多的是P-糖蛋白和編碼其多耐藥基因MDR1。P-糖蛋白是分布在細胞膜上的正常糖蛋白。暴露于多種毒物環(huán)境的組織細胞，如消化系組織細胞，在生理條件下就含有較多的P-糖蛋白。P-糖蛋白是一種能量依賴藥物外排泵，以ATP作為能源，將某些化學藥物泵出細胞外。目前發(fā)現(xiàn)與P-糖蛋白有類似作用的尚有多種耐藥相關蛋白(MRP)及肺耐藥相關蛋白(LRP)。腫瘤細胞過度表達，P-糖蛋白或MRP能減少細胞內藥物聚積或可變藥物在細胞內的分布而降低化療效果。對MDR的特性盡可能地保護骨髓組織免受化療藥物的抑制。將MDR轉入造血干細胞中可以保護荷瘤宿主抵抗大劑量化療所致的損傷。這種基因治療方法可以很好的增加腫瘤化療的效果。

4 胃癌基因治療問題和展望

腫瘤的基因治療是隨分子生物學理論和技術的發(fā)展而在近年興起的一種新的治療方法。胃癌的基因治療目前只在于動物試驗研究，還未在臨床上進行實際應用。其主要原因，第一是由于技術的復雜性，很難制成生物制品來用于臨床治療，第二是基因治療中病毒載體的安全性問題尚未解決，第三靶細胞種類的選擇，基因表達水平對基因治療效果以及患者本身的影響問題。今后胃癌基因治療的發(fā)展方向應是：①加強對胃癌基因變化規(guī)律的認識，針對關鍵突變基因，運用基因置換和反義核酸等基因治療策略。②改進基因轉導技術，發(fā)現(xiàn)一種更簡單、安全有效的載體，實施基因定位導入，提高轉導率和外源基因的表達率。③進一步擴大基因受體細胞種類的篩選，提高受體細胞的擴增。

胃癌的基因治療將來成為腫瘤綜合治療的一部分，可以提高化療、放療的敏感性，對減少腫瘤的復發(fā)和轉移起一定作用，甚至是明顯的作用。

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