孟凡杰 王玉芳 王國鳳

[摘要] 目的 探討外周血CK-19 mRNA表達(dá)與乳腺癌的關(guān)系,評價其在乳腺癌診斷上的價值。方法 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測200例乳腺癌患者外周血中CK-19 mRNA表達(dá)情況,并以66例乳腺良性疾病和60例正常健康女性作為對照。結(jié)果 200例乳腺癌患者48例外周血CK-19為陽性,66例乳腺良性疾病患者中3例陽性,而同時檢查的60位健康者,他們的外周血CK-19均為陰性;不同年齡病人的CK-19檢測陽性率對比,彼此之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;腫瘤不同分期CK-19陽性率對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 RT-PCR法檢測CK-19 mRNA可作為乳腺癌診斷的指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌; CK-19 mRNA; 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

[中圖分類號] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701(2009)33-15-02

Clinical Significance of CK-19 mRNA in Patients with Breast Cancer

MENG Fanjie WANG Yufang WANG Guofeng

Yidu Central Hospital of Weifang City,Qingzhou 262500,China

[Abstract] ObjectiveTo investigate the clinical significance of CK-19 mRNA in patients with breast cancer. MethodsThe CK-19 mRNA expression in the peripheral blood of 20 cases of breast cancer was measured by using RT-PCR method before operation,and 66 patients with benign breast diseases and 60 healthy women were taken as controls. ResultsThe positive rates of CK-19 mRNA in patients with breast cancer and benign breast diseases were 24%(48/200)and 4.54%(3/66),respectively,and CK-19 mRNA was all negative in the 60 healthy women. Thepositive rate difference between the breast cancer group and the control group was significant(P<0.01). There was no difference in the positive rate of CK-19 mRNA in patients of all ages. The positive rates at 0～I(xiàn),II and III stages were 15.38%(8/52),20%(24/120)and 57.14%(16/28),respectively. There was a significant difference in the positive rate between stage III and stages of 0～I(xiàn) and II(P<0.05). ConclusionCK-19 mRNA can be used as a molecular marker in the peripheral blood by method of RT-PCR for the detection of breast cancer.

[Key words]Breast cancer; Cytokeratin-19 mRNA; RT-PCR

乳腺癌是一種全身性疾病,在疾病早期腫瘤細(xì)胞就可能經(jīng)血液播散出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。乳腺癌細(xì)胞為上皮來源的細(xì)胞,而外周血中主要是內(nèi)皮細(xì)胞,而并沒有上皮成分,因此乳腺癌患者如果外周血中存在腫瘤細(xì)胞,則其血液中會出現(xiàn)上皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞脫落的組織成分。

本文通過RT-PCR方法檢測乳腺癌患者外周血CK-19 mRNA表達(dá),研究外周血CK-19 mRNA表達(dá)與乳腺癌的關(guān)系,并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

為我院2006年8月至2008年7月女性乳腺癌手術(shù)患者200例共200側(cè),年齡35～78歲,平均年齡49.2歲,左側(cè)96例,右側(cè)104例,按照外科學(xué)第6版AJCC乳腺癌TNM分期,T0～T1期52例,T2期120例,T3期28例,同時以同期我院66例良性乳腺疾病患者和60例正常健康女性為對照,所有入選者手術(shù)前均未接受任何特殊治療。

1.1.1 引物 由生工公司提供:

引物序列

A(sense): 5-AAGCTAACCATGCAGAACCTCAACGACCGC-3;

B(antisense):5-TTATTGGCAGGTCAGGAGAAGAGCC-3;

C(sense):5-TCCCGCGACTACAGCCACTACTACACGACC-3;

D(antisense):5-CGCGACTTGATGTCCATGAGCCGCTGGTAC-3。

1.1.2 試劑 淋巴細(xì)胞分離液購自Qiagen公司;RNA抽提試劑盒PCR試劑盒購及自達(dá)安基因診斷有限公司;SuperscriptⅡ購自Introvigen公司;Progesterone Receptor購自Antibody Diagnostia公司。

1.1.3 實驗器材 美國PE5700熒光定量擴(kuò)增儀

1.2 方法

對所有的研究對象包括乳腺癌患者和正常人以及乳腺良性疾病患者均抽取檢查者5mL靜脈血,為防止表皮細(xì)胞干擾,第一管1mL均棄用,換注射管后再抽5mL血,置入抗凝管,搖勻并除外溶血標(biāo)本。取血標(biāo)本加入淋巴細(xì)胞分離液放入15mL離心管,冰孵10~15min期間混勻二次,用冰凍離心機(jī)離心,棄去上清,再加入淋巴細(xì)胞分離液重復(fù)上述操作棄去上清后得到單核細(xì)胞。再用RNA抽提盒按說明書步驟進(jìn)行操作提取mRNA。提取的mRNA用0.5%瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像系統(tǒng)觀察,如存在18S、28S條帶說明提取mRNA成功。然后,在提取的mRNA中加入PCR試劑盒內(nèi)的試劑,并加入引物A和引物B,反應(yīng)體系為50μL,參照試劑盒說明書進(jìn)行CK-19mRNA RT-PCR第一次擴(kuò)增,采用雙退火溫度,退火溫度分別是56℃和72℃,擴(kuò)增產(chǎn)物為1071bp;取第一次擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二次擴(kuò)增,退火溫度為59℃和72℃,擴(kuò)增產(chǎn)物為746bp。取反應(yīng)物5μL進(jìn)行電泳,電泳條件為1xTBE緩沖液,1.5%瓊脂糖凝膠,電壓5V,時間30~40min。凝膠成像系統(tǒng)觀察,如在540bp處出現(xiàn)清晰條帶者可證實RNA無降解且反應(yīng)體系合適。如反應(yīng)物在462bp處出現(xiàn)清晰條帶則為該標(biāo)本CK-19mRNA陽性,否則為陰性。統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

不同研究對象及乳腺癌不同年齡、不同分期CK-19檢測結(jié)果見表1。

3 討論

細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK)是一類細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的總稱,根據(jù)相對分子質(zhì)量、等電點等不同可分為1~20種片段,CK-19是上皮細(xì)胞骨架的組成成分,也是上皮來源惡性腫瘤細(xì)胞中間絲的組成成分,在正常的外周血、骨髓及淋巴結(jié)中無表達(dá),是具有高度組織特異性和在乳腺癌細(xì)胞中廣泛表達(dá)的細(xì)胞角蛋白,是檢測乳腺癌微轉(zhuǎn)移最有價值的標(biāo)記物[2,3]。

3.1 檢測外周血CK-19的臨床意義

通過檢測外周血CK-19來判斷外周血里是否有上皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞的成分,以判斷是否有上皮來源的乳腺腫瘤細(xì)胞存在。本次觀察的對象中,乳腺癌組與對照組陽性率比較有顯著性差異(<0.01),因此,從本實驗的研究結(jié)果來看,用RT-PCR的方法檢測外周血CK-19協(xié)助診斷乳腺癌其特異性還是很高的。但也發(fā)現(xiàn)乳腺良性疾病組CK-19mRNA假陽性率達(dá)4.54%,有研究報道,造成假陽性表達(dá)的原因可能有上皮細(xì)胞的污染、假基因的干擾、外周血中CK-19mRNA的低水平表達(dá)等[4]。

3.2 外周血CK-19的陽性率與乳腺癌的多因素分析

目前研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌的預(yù)后的好壞由多種因素決定的,包括患者的年齡、腫瘤的分期等。本研究探討乳腺癌患者外周血CK-19陽性與這些預(yù)后因素間有否聯(lián)系。近來,研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌在女性40~50歲以及60~70歲有兩個高發(fā)年齡段,而在本研究中發(fā)現(xiàn)<40歲、40~50歲、50~60歲以及>60歲的CK-19陽性率相似,他們之間并無統(tǒng)計學(xué)差異。因此,CK-19的陽性率與年齡無關(guān)。

乳腺腫瘤的大小是乳腺癌分期的一個重要的指標(biāo),也是決定乳腺癌預(yù)后的因素之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)1997年乳腺癌分期:導(dǎo)管內(nèi)癌或濕疹樣癌為Tis,腫瘤<2cm為T1期,2cm<腫瘤<5cm為T2期,腫瘤>5cm為T3期,腫瘤侵犯皮膚或胸壁為T4期。本研究發(fā)現(xiàn)T1、T2期乳腺癌的CK-19陽性率無統(tǒng)計學(xué)意義,而T3的陽性率明顯高于前兩期,有統(tǒng)計學(xué)意義。由此說明隨著腫瘤數(shù)目的增多及體積的增大,其血行轉(zhuǎn)移的可能性就增加,特別是腫瘤大于5cm后,血行轉(zhuǎn)移明顯增加。同時也說明無論腫瘤有多大,都有可能出現(xiàn)血行播散(由于本研究中僅有4例導(dǎo)管內(nèi)癌,尚無法證明Tis的腫瘤是否會存在血行播散的可能,這還有待更多的病例進(jìn)行進(jìn)一步的研究,從而也說明了為何仍有部分早期的乳腺癌病人會出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Grunewald K,Haun M,Urbanek M,et al. Mammaglobin gene expression:a superior marker of breast cancer cells in peripheral blood in comparison to epidermal-growth-factor receptor and cytokeratin-19[J]. Lab Invest,2000,80(7):1071-1077.

[2] Schoenfeld A,Kruger KH,CommJ,et al. The detection of micrometastasis in the peripheral blood and bone marrow of patients with breast cancer using immunohistochemistry and reverse transcriptase polymerase chain reaction for keratin 19[J]. Eur J Cancer,1997,33(6):854-861.

[3] Zhang J,Shen K W,Liu G,et al. Antigenic profiles of disseminated breast tumor cells and microenvironment in bone marrow[J]. Eur J Surg Oncol,2003,29(2):121-126.

[4] Ko Y,Grunewald E,Totzke G,et al. High percentage of false-positive results of cytokeratin 19 RT-PCR in blood:a model for the analysis of illegitimate gene expression[J]. Oncology,2000,59(1):81-88.

(收稿日期:2009-02-23)