摘 要： "葉面噴硒是一種有效提高作物硒含量的農(nóng)藝強(qiáng)化手段。為探究硒在水稻葉片組分中的分布、積累特征及影響因子，以及提高葉施硒的利用效率，該研究利用葉片離體培養(yǎng)技術(shù)，比較了不同硒形態(tài)、濃度、處理時(shí)間及不同表面活性劑載體對水稻葉片亞細(xì)胞組分中硒的分布和累積的影響。結(jié)果表明：（1）硒主要分布在水稻葉片細(xì)胞壁中，其次是葉綠體和線粒體組分，細(xì)胞液最少。（2）葉施硒肥數(shù)小時(shí)內(nèi)葉片對亞硒酸鈉的吸收能力顯著高于納米硒、硒代蛋氨酸和酵母硒，分別高出1.25倍、1.32倍和5.43倍，遷移能力比其余三者高出約1.26倍。（3）水稻每片葉片的最佳施硒量為0.008 mg，此時(shí)葉綠體和線粒體中硒含量達(dá)到最大值。（4）葉施硒后3～7 h是葉片吸收轉(zhuǎn)運(yùn)硒的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。（5）相較于環(huán)糊精和烷基糖苷，在外源硒中添加濃度為30 mg·L-1的鼠李糖脂可更好地促進(jìn)水稻葉片對硒的吸收，吸收含量提高了80%。綜上認(rèn)為，該結(jié)果為后續(xù)了解硒在葉片中的遷移機(jī)制提供了理論參考，也為未來硒配方優(yōu)化、科學(xué)施硒制度建立以及降低硒生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞： 硒， 水稻， 亞細(xì)胞分布， 葉施， 表面活性劑

中圖分類號： "Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： "A

文章編號： "1000-3142（2024）11-2067-09

Effects of foliar-sprayed of selenium on distribution and

accumulation of selenium in subcellular

components of rice leaves

Abstract： "Foliar selenium spraying is an effective agronomic fortification to increase the selenium content of crops. In order to explore the distribution， accumulation characteristics and influencing factors of selenium in rice leaf fractions， and to improve the utilization efficiency of foliar selenium application， we compared the effects of different selenium forms， concentrations， treatment time and different surfactant carriers on the distribution and accumulation of selenium in the subcellular fractions of rice leaves using the leaf in vitro culture technique. The results were as follows： （1） Selenium was mainly distributed in the cell wall of rice leaves， followed by chloroplast and mitochondrial fractions， with the least in the cytosol. （2） The uptake capacity of sodium selenite in leaves within a few hours of leaf application of selenium fertilizer was significantly higher than that of nano-selenium， selenomethionine and yeast selenium， by 1.25-fold， 1.32-fold and 5.43-fold， respectively， and the migration capacity was about 1.26-fold higher than that of the remaining three. （3） The optimal amount of selenium applied to each leaf was 0.008 mg， and at that time the selenium content in chloroplasts and mitochondria reached the maximum value. （4） Three to seven hour after leaf application of selenium was the critical time point for selenium uptake and translocation in leaves. （5） Meanwhile， compared with cyclodextrin and alkyl glycoside， the addition of rhamnolipid to exogenous selenium at a concentration of 30 mg·L-1 promoted selenium uptake in rice leaves， and the content of the absorbed content increased by 80%. The above results provide the theoretical referecence for the subsequent understanding of selenium transport mechanisms in leaves， and also provide the support for the optimization of selenium formulations， the establishment of scientific selenium application systems， and the reduction of selenium ecological and environmental risks in the future.

Key words： selenium， rice， subcellular distribution， foliar spray， surfactant

硒是人類和動(dòng)物必需的微量元素，人體缺硒會(huì)導(dǎo)致心腦血管病、高血壓綜合征等40余種病高發(fā)，動(dòng)物缺硒會(huì)引起維生素E-硒缺乏癥（Rayman， 2000）。植物是人類攝取硒的主要來源，通過生產(chǎn)富硒水稻等作物來提高人體硒攝入量是防止人類硒營養(yǎng)缺乏的有效途徑（Wan et al.， 2019）。目前，常用的農(nóng)藝生物強(qiáng)化作物硒含量主要包括土壤添加硒肥和葉面噴施硒肥兩種手段。與土壤施硒相比，葉面施硒可以提高硒的利用效率。土壤中硒的生物有效性受土壤性質(zhì)如氧化還原電位、pH和有機(jī)質(zhì)等因素影響，并且亞硒酸鹽對土壤鐵氧化物、氫氧化物和有機(jī)質(zhì)都具有很高的親和力，從而導(dǎo)致硒在土壤中的生物利用度降低（Yang et al.， 2022）。此外，硒很容易通過土壤徑流浸出，污染地下水，造成潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)與硒資源浪費(fèi)（Lakin， 1972）。葉面施硒具有更高的生物利用度，可以使硒直接接觸植物葉片，通過葉角質(zhì)層/氣孔或水性孔隙后進(jìn)入葉片，并輸送至植物籽粒中（朱永官， 2003; 王冰， 2012），從而大大提高硒的生物利用率，降低硒污染環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)，因此葉面施硒在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

現(xiàn)階段，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面葉面噴硒的吸收效果較差。Emese等人指出，對胡蘿卜葉施100 μg·mL-1的硒肥，轉(zhuǎn)移到果實(shí)中硒的利用率僅在10%左右，多數(shù)都截留在根部（2%）或葉片部位（50%～80%）（Kápolna et al.， 2009）。鑒于此，要提高籽實(shí)里的硒含量，只有增加施硒量或借助其他元素的協(xié)同作用才能實(shí)現(xiàn)，但是這樣又可能會(huì)導(dǎo)致施硒過量造成的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。因此，探究硒的吸收與分布過程，對于實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)施硒，提高吸收效率，保證硒含量安全，具有重要意義。

目前，探究硒的吸收與分布的研究多數(shù)集中在水稻、小麥等糧食作物中且多用亞細(xì)胞分布的手段觀察硒在植物葉片的具體分布位置（Li et al.， 2018; Hu et al.， 2023）。但是，其中討論的元素略微單一，如只研究了硒形態(tài)（Ding et al.， 2015）、濃度（Wang et al.， 2021）及光照和溫度（張聯(lián)合等， 2012）等，并未將其進(jìn)行綜合分析，這難以為富硒水稻的生產(chǎn)提供充分的理論依據(jù)。濃度、元素形態(tài)和表面活性劑性質(zhì)與含量都是影響元素葉片吸收和亞細(xì)胞分布的關(guān)鍵因素。無機(jī)硒和有機(jī)硒的結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)不同，葉片對其吸收效果也不盡相同（Ebrahimi et al.， 2015）。同時(shí)，作為葉面肥的重要組分，表面活性劑通過增加水溶液與葉片的接觸面積實(shí)現(xiàn)葉面肥在葉片疏水蠟質(zhì)層表面黏附和滯留（Kovalchuk amp; Simmons， 2021），從而增加葉面肥被葉片吸收的機(jī)會(huì)。因此，有必要系統(tǒng)探究葉面施硒過程中不同硒形態(tài)、濃度、時(shí)間以及硒肥載體對硒在植物葉片亞細(xì)胞組分中的分布和累積的影響。

本研究采用離體葉片培養(yǎng)方式，通過對水稻葉片葉施硒，擬探討以下問題：（1）不同施硒形態(tài)、濃度和時(shí)間對水稻葉片亞細(xì)胞組分中硒分布和累積的影響；（2）不同載體對水稻葉片中硒吸收和積累的影響。以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中提高硒肥吸收效率、節(jié)約硒肥資源提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

水稻品種：香妃，粳型常規(guī)水稻，生育期156 d左右，株高100～105 cm，根系發(fā)達(dá)，莖稈堅(jiān)韌，高抗倒伏，不早衰，株型緊湊，分蘗力極強(qiáng)，抗病性強(qiáng)，高抗稻瘟病、稻曲病、紋枯病，千粒重26.2 g，米質(zhì)入口香甜，口感極佳。

試劑：亞硒酸鈉（Na2SeO3，廣州市華豫貿(mào)易有限公司）、硒代蛋氨酸（C5H11NO2Se，源葉生物科技有限公司）、納米硒（Se，西安瑞禧生物科技有限公司）、酵母硒（博爾森生物科技有限公司）、環(huán)糊精（C42H70O35，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、鼠李糖脂（C58H106O22，西安瑞捷生物科技有限公司）、烷基糖苷（C16H32O6，源葉生物科技有限公司）、EDTA（C10H16N2O8，BBI生命科學(xué)有限公司）、二硫蘇糖醇（C4H10O2S2，上海麥克林生化科技有限公司）、Tris（C4H11NO3，北京索萊寶科技有限公司）、蔗糖（C12H22O11，廣州市華豫貿(mào)易有限公司）。

1.2 水稻培養(yǎng)

將水稻種子在10%H2O2溶液中消毒30 min，用去離子水沖洗3～5次，放在28 ℃植物培養(yǎng)箱中催芽3～4 d后移栽至育苗盤中，25 ℃培育21 d，育苗盤中的土施加氮磷鉀肥（尿素91 mg·kg-1、過磷酸鈣200 mg·kg-1、氯化鉀40 mg·kg-1）保證充足的營養(yǎng)。待水稻幼苗生長21 d后，將充分展開的第三葉從葉基部剪下，用于葉片亞細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

水稻葉片離體實(shí)驗(yàn)可以將葉片作為一個(gè)獨(dú)立的整體，研究外源物質(zhì)的葉片吸收和遷移出葉片情況。因此，本文采用水稻葉片離體實(shí)驗(yàn)，將葉片沿葉舌剪下，放入EDTA 溶液中，EDTA溶液承接韌皮部滲出汁液，反映了葉片吸收硒后向其他器官遷移的情況。實(shí)驗(yàn)分別考慮施硒形態(tài)、濃度、時(shí)間及表面活性劑的影響。

1.3.1 施硒形態(tài)對硒葉片遷移積累的影響 選取水稻葉位一致、長勢相同的葉片（第三葉），將篩選葉片的剪切部位下表面浸入2 mL 25 mmol·L-1 EDTA溶液中，上表面暴露空氣中，暴露于空氣中的葉片在中間固定位置施加10 μL濃度為1 000 mg·L-1（以硒計(jì)） 亞硒酸鈉、硒代蛋氨酸、納米硒或酵母硒溶液，7 h取出葉片（預(yù)實(shí)驗(yàn)證明7 h已對葉施硒吸收完全），用6 mL水沖洗葉片施硒部位，沖洗水和EDTA溶液留下待用，整個(gè)過程在避光條件下完成（EDTA吸收韌皮部汁液須在黑暗處完成（Chen et al.， 2019）。所有處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.2 施硒濃度對硒葉片遷移積累的影響 為使溶液以液滴的形式，施加在葉片同一位置（苗期葉片葉寬較窄），以提高施硒濃度，降低施硒體積。預(yù)實(shí)驗(yàn)證明施加濃度體積較小時(shí)，較高濃度的硒不會(huì)對葉片造成損傷（圖1）。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為在葉片固定位置施加10 μL 濃度分別為0、200、400、600、800、1 000 mg·L-1 亞硒酸鈉溶液，其他同1.3.1。

1.3.3 施硒葉片硒的遷移積累特征 為使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)形成系統(tǒng)變化，采用呈指數(shù)形式增長的時(shí)間梯度，并且預(yù)實(shí)驗(yàn)中置于EDTA溶液中的葉片28 h不會(huì)失去生命體征。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為在葉片固定位置施加10 μL 1 000 mg·L-1 亞硒酸鈉溶液，在0、1、2、3、5、7、9、14、28 h時(shí)取出葉片，其他同1.3.1。

1.3.4 表面活性劑濃度和性質(zhì)對葉片硒遷移積累的影響 選擇的表面活性劑為常用且環(huán)境友好的環(huán)糊精、鼠李糖脂和烷基糖苷。根據(jù)表面活性劑的臨界膠束濃度（李果等，2011；張茜， 2020），分別配制環(huán)糊精濃度為20、40、60、80、100 mg·L-1，鼠李糖脂濃度為10、20、30、40、50 mg·L-1，烷基糖苷濃度為20、40、60、80、100 mg·L-1。將葉片放入2 mL 25 mmol·L-1 EDTA溶液中，在固定位置施加10 μL配制的含表面活性劑的亞硒酸鈉溶液（Se，800 mg·L-1），7 h取出葉片，用6 mL蒸餾水沖洗葉片施硒部位，保存沖洗水用于樣品分析。整個(gè)過程在避光條件下完成。所有處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4 樣品前處理和分析

葉片亞細(xì)胞組分分離方法：將沖洗干凈的葉片擦干水分，亞細(xì)胞分離處理參照Su等（2014）等的方法。具體步驟如下：葉片加入2 mL提取劑，在4 ℃條件下于瓷研缽中研磨，其中提取劑組成為蔗糖（0. 25 mol·L-1） + Tris-HCl（50 mmol·L-1 pH= 7.5 ）+ 二硫蘇糖醇（1. 0 mmol·L-1）；將研磨液移入10 mL離心管，用高速冷凍離心機(jī)600 ×g、離心10 min，沉淀物為細(xì)胞壁（F1）；將上清液移入10 mL離心管中，低溫高速離心1 000 ×g、離心20 min，沉淀物為葉綠體（F2）；將上清液移入10 mL離心管中，低溫高速離心10 000 ×g、離心20 min，沉淀物為線粒體（F3），上清液為細(xì)胞液（F4）。

樣品的消煮和測定方法：將實(shí)驗(yàn)中獲得的EDTA溶液和分離出的亞細(xì)胞組分（F1-F4）參照GB 5009.93-2017進(jìn)行消解。將稱重的EDTA、亞細(xì)胞組分移入坩堝中，加10 mL（9+1）濃硝酸+高氯酸，蓋上鍋蓋冷消化過夜。次日于電熱板上加熱，待黃煙散盡、溶液變?yōu)榍辶镣该鞑橛邪谉煯a(chǎn)生時(shí)，將電熱板升溫至180 ℃加熱至剩余體積為1～2 mL。冷卻，加5 mL 50%鹽酸溶液，繼續(xù)在80 ℃電熱板上加熱1 min，取下用1%檸檬酸定容至25 mL比色管中，靜置一夜，取上清液于10 mL離心管中待測。將1.3實(shí)驗(yàn)中獲得的沖洗水和上述待測液用原子熒光光譜儀（SK-2003A）測定。

質(zhì)量控制：消解過程中以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW10022蒜粉）和消解液空白作為對照，消解過程與樣品一致；測定過程中增加硒標(biāo)準(zhǔn)溶液測定的方法控制測樣質(zhì)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2016和SPSS20.0（IBM， USA）對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（one-way analysis of variances， ANOVA， LSD， Plt;0.05）；圖片采用GraphPad Prism 9（GraphPad Software，USA）進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硒形態(tài)對水稻葉片亞細(xì)胞組分中硒分布和累積的影響

由圖2可知，EDTA中的硒含量表明了硒從葉片向水稻其他器官的遷移能力，葉片沖洗水中的硒表明外源硒的葉片殘留，而F1-F4表示葉片中硒的亞細(xì)胞分布（以下部分相同）?？梢钥闯鑫螒B(tài)不影響其在葉片中的亞細(xì)胞分布特征，硒含量均呈現(xiàn)細(xì)胞壁＞細(xì)胞器＞細(xì)胞液。但是，不同硒形態(tài)間的亞細(xì)胞分布存在顯著差異：細(xì)胞壁中硒含量亞硒酸鈉＞納米硒＞硒代蛋氨酸＞酵母硒；在細(xì)胞器中亞硒酸鈉≈納米硒＞硒代蛋氨酸＞酵母硒，其中施用硒代蛋氨酸時(shí)細(xì)胞器中硒含量F2＞F3， 其他處理兩者無顯著差異；細(xì)胞液中硒含量亞硒酸鈉＞硒代蛋氨酸≈酵母硒＞納米硒。此外，亞硒酸鈉處理EDTA溶液中硒含量顯著高于其他3個(gè)處理，而其沖洗水中硒含量最少，酵母硒和納米硒含量最高，說明水稻葉片7 h已有相對較多的硒向其他器官遷移，水稻對亞硒酸鈉的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)效率最高。

2.2 不同亞硒酸鈉濃度對水稻葉片亞細(xì)胞組分中硒分布和累積的影響

由圖3可知，隨著濃度的增加，葉片中細(xì)胞壁的硒含量呈持續(xù)上升趨勢；每片葉片硒施加量為0～0.008 mg時(shí)，葉綠體和線粒體硒含量呈上升趨勢，而后未發(fā)生顯著變化；細(xì)胞液中硒濃度在0.004～0.008 mg時(shí)急速上升，而后上升緩慢。EDTA中硒含量隨著亞硒酸鈉施用量的增加也顯著上升，在0.006～0.008 mg之間變幅最大；細(xì)胞壁也呈持續(xù)上升趨勢，說明施加濃度越高，滯留在細(xì)胞壁內(nèi)的硒含量越多，并且向其他器官轉(zhuǎn)運(yùn)硒的速率相對穩(wěn)定，大致均呈現(xiàn)上升趨勢。葉表硒殘留在硒施加量為0.01 mg每葉時(shí)才開始出現(xiàn)。

2.3 不同處理時(shí)間下水稻葉片亞細(xì)胞組分中硒分布和累積的變化

由圖4可知，在實(shí)驗(yàn)濃度下，葉表面會(huì)出現(xiàn)硒殘留。水溶液殘留硒在施用后迅速下降，3 h后下降趨勢變緩，9 h后不再發(fā)生變化。EDTA中的硒3 h后開始迅速上升， 7 h后無顯著變化，說明7 h葉片表面已經(jīng)吸收完全，葉片內(nèi)部也完成硒元素的遷移以及輸送至其他器官的過程。在葉片內(nèi)部，硒主要分布在細(xì)胞壁上，其次是葉綠體和線粒體，可溶性組分中硒含量極少。隨著硒施用時(shí)間的增加，各亞細(xì)胞組分中硒含量均呈上升趨勢：在1～3 h中穩(wěn)定，3～7 h迅速上升，7 h后上升緩慢，9 h后趨于穩(wěn)定。

2.4 不同表面活性劑對水稻葉片亞細(xì)胞組分中硒分布和累積的影響

由圖5-7可知，表面活性劑的施用不會(huì)改變硒主要分布在細(xì)胞壁中，細(xì)胞液分布最少的特征。施加環(huán)糊精濃度增加，F(xiàn)4中硒含量顯著增加，F(xiàn)1未發(fā)生顯著變化，F(xiàn)2+F3中硒含量在20 mg·L-1和80 mg·L-1時(shí)取得最大值且20 mg·L-1時(shí)與其他濃度存在顯著差異，80 mg·L-1時(shí)與其他濃度無顯著變化（圖5）。隨著鼠李糖脂濃度的增加，F(xiàn)1和F2+F3組分均呈先上升后穩(wěn)定趨勢，均在30 mg·L-1時(shí)取得最大值；F4組分硒含量呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，在40 mg·L-1時(shí)取得最大值（圖6）。隨著烷基糖苷濃度的增加，F(xiàn)1中硒含量穩(wěn)定，未受影響，F(xiàn)4組分均呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢且趨勢大致相反；F2+F3組分硒含量在40 mg·L-1時(shí)取得最大值（圖7）。對比3種表面活性劑最佳施用濃度及葉片內(nèi)部硒含量，可以看出添加鼠李糖脂所用濃度較低、葉片內(nèi)部硒含量最高，為三者中的最優(yōu)選擇。

3 討論與結(jié)論

硒進(jìn)入葉片后，被植物吸收利用的效果，可以通過植物葉片上各亞細(xì)胞組分中硒的含量反映出來（Zhu et al.， 2020）。葉片亞細(xì)胞組分通過差速離心法提取，可分為細(xì)胞壁、葉綠體和線粒體以及細(xì)胞液。細(xì)胞壁是元素進(jìn)入葉片的第一道屏障，可通過跨膜運(yùn)動(dòng)將所需營養(yǎng)元素輸送到細(xì)胞器中。細(xì)胞器內(nèi)包含葉綠體、線粒體等多種作物進(jìn)行正常生理活動(dòng)的場所。在植物細(xì)胞中葉綠體和線粒體因其復(fù)雜的代謝聯(lián)系而被視為相互依賴的細(xì)胞器，如進(jìn)行新陳代謝、能量狀態(tài)和還原/氧化狀態(tài)時(shí)，葉綠體和線粒體起到了關(guān)鍵作用。存在于葉綠體和線粒體上的質(zhì)基因很大程度上會(huì)參與籽粒中營養(yǎng)元素的合成，如蛋白質(zhì)合成、酶激活、代謝物產(chǎn)生和電子傳遞鏈維護(hù)等（Li et al.， 2018）。由此可見，葉綠體和線粒體是營養(yǎng)元素進(jìn)入葉片后，轉(zhuǎn)化成籽?？捎贸煞值闹匾M分。細(xì)胞液則是葉片細(xì)胞內(nèi)的液態(tài)物質(zhì)，包含了細(xì)胞中多種溶質(zhì)和胞內(nèi)器官，可以填充細(xì)胞內(nèi)空間，為細(xì)胞器的功能提供支撐（Ceballos-Laita et al.， 2015）。

施硒形態(tài)不同會(huì)影響作物葉片硒含量。在亞硒酸鈉、硒酸鈉、亞硒酸鋅和硒代蛋氨酸4種硒形態(tài)中，水稻苗期葉片富集亞硒酸鈉效果最佳，硒代蛋氨酸效果最差（施柳， 2021）。然而，孕穗期水稻功能葉硒含量積累硒酸鈉＞亞硒酸鈉＞納米硒＞硒代蛋氨酸＞酵母硒（王亞萍， 2020）。本研究中，葉片施加硒肥數(shù)小時(shí)內(nèi)離體苗期水稻葉片硒積累量為亞硒酸鈉＞納米硒＞硒代蛋氨酸＞酵母硒，與前兩者結(jié)果相比，均表現(xiàn)為無機(jī)硒優(yōu)于有機(jī)硒。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，施加亞硒酸鈉和納米硒后葉片細(xì)胞器中積累的硒含量顯著高于硒代蛋氨酸和酵母硒，說明相比有機(jī)硒，無機(jī)硒和納米硒更易遷移至功能器官并被植物利用。這是因?yàn)闊o機(jī)硒和納米硒具有良好的結(jié)合蛋白質(zhì)或多糖的穩(wěn)定性，更易進(jìn)入葉片（Nie et al.， 2023）并為籽實(shí)所利用。從細(xì)胞液、EDTA和葉表面殘留的硒含量來看，葉片對亞硒酸鈉吸收和遷移能力顯著高于其他三者，說明施加亞硒酸鈉更易被水稻葉片吸收并輸送到其他器官。

外源硒濃度顯著影響亞細(xì)胞組分硒的積累。有研究表明，低濃度促進(jìn)線粒體和細(xì)胞質(zhì)中硒含量，高濃度則抑制；葉綠體中硒含量隨著濃度的升高呈波動(dòng)趨勢，細(xì)胞壁中硒含量則一直上升（Wang et al.， 2010； 樊俊等，2016），這與本研究結(jié)果有所區(qū)別。本實(shí)驗(yàn)中，雖施加了高濃度的硒，施加量為10 μL，但具體施加到葉片中的硒最高為0.01 mg每葉。隨著外源硒濃度的增加，各亞細(xì)胞組分硒含量呈上升趨勢，當(dāng)外源硒施加量高于0.008 mg每葉時(shí)，葉綠體和線粒體不發(fā)生顯著變化，說明每片葉子施加0.008 mg的亞硒酸鈉已達(dá)到該水稻葉片細(xì)胞器的吸收量。當(dāng)施加量為0.01 mg每葉時(shí)，沖洗水中檢測出0.18 mg·L-1的硒，是施加量減去葉片內(nèi)硒含量所殘留的硒，此時(shí)葉片吸收硒達(dá)到飽和，不再吸收。綜上所述，施加0.008 mg的亞硒酸鈉為每片水稻葉片的最優(yōu)施硒量，此時(shí)可最大程度地運(yùn)用于葉綠體和線粒體等細(xì)胞器，為籽粒提供最適合的外源硒。

硒葉施后在葉片組分的分配特征變化反映了硒在葉片吸收、轉(zhuǎn)化和遷移的規(guī)律。隨著施硒時(shí)間的增加，各組分中的硒含量于7 h趨于穩(wěn)定。EDTA中的硒含量表明硒向水稻其他器官的遷移能力，可以看到0～3 h未發(fā)生變化，從3 h后開始迅速上升，7 h后無顯著變化，說明葉施硒的前3 h，硒并未向其他部位遷移，而是集中在葉片內(nèi)部；3～7 h葉綠體、線粒體、細(xì)胞液以及EDTA中硒含量顯著增加，說明在此時(shí)硒在葉綠體和線粒體等細(xì)胞器中完成籽粒所需的合成與轉(zhuǎn)化，并開始向水稻其他部位遷移；7 h后趨于穩(wěn)定。這說明在3～7 h是葉片吸收轉(zhuǎn)化硒元素的最佳時(shí)間，這與已有結(jié)論（農(nóng)田里要求肥噴施6 h內(nèi)不能出現(xiàn)降雨，以免影響施肥效果）一致。沖洗水中硒殘留量同樣說明3～7 h是葉施的硒在葉片中轉(zhuǎn)化遷移的重要時(shí)期。

作為葉面肥的重要組分，表面活性劑屬性和濃度均顯著影響作物葉面肥的吸收效率。李曉莉等（2011）研究證實(shí)表面活性劑低濃度可顯著改變?nèi)~片表面性質(zhì)，克服植物角質(zhì)膜阻力，提高植物對葉面肥、生長調(diào)節(jié)劑、除草劑等滲透吸收利用率。因此，尋找一種低濃度又可以促進(jìn)葉片對元素吸收的表面活性劑有利于節(jié)約硒肥施用。本研究對比了3種環(huán)境友好的生物表面活性劑——環(huán)糊精、鼠李糖脂和烷基糖苷。從中可以看出，表面活性劑施加會(huì)使硒在細(xì)胞器內(nèi)的含量發(fā)生以下變化：環(huán)糊精和烷基糖苷均產(chǎn)生波動(dòng)變化，低濃度促進(jìn)，高濃度抑制；鼠李糖脂則在30 mg·L-1時(shí)取得最大值而后變化不明顯。這說明添加表面活性劑會(huì)促使硒元素向功能器官遷移，促進(jìn)葉片對硒的轉(zhuǎn)化。三者施加量分別在20、30、40 mg·L-1時(shí)實(shí)現(xiàn)硒的最高積累。對比3種表面活性劑在最佳濃度條件下的葉片硒含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，鼠李糖脂更易促進(jìn)外源硒進(jìn)入葉片內(nèi)部。這主要是因?yàn)樘砑颖砻婊钚詣?huì)使溶液增溶，使其更易滲透到葉片中。表面活性劑的CMC值（臨界膠束濃度）越低，形成的膠束基團(tuán)越多，膠束基團(tuán)的體積也就越大，這樣就會(huì)有更多的空間用于增溶（李果等， 2011）。因?yàn)槭罄钐侵腃MC值在30～50 mg·L-1之間，小于烷基糖苷和環(huán)糊精（CMC值為100 mg·L-1左右）的臨界膠束濃度，更易促進(jìn)外源硒進(jìn)入葉片，所以鼠李糖脂為三者中的最優(yōu)選擇。

硒作為人體必需元素，攝入過少和過多均會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)。因此，如何科學(xué)合理安全攝入有效的硒是社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。對于富硒農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)而言，在不產(chǎn)生作物和生態(tài)毒性的情況下，盡可能高效利用外源硒生產(chǎn)達(dá)標(biāo)農(nóng)產(chǎn)品是該領(lǐng)域工作的焦點(diǎn)。本研究揭示了葉施硒肥數(shù)小時(shí)內(nèi)水稻第三葉亞細(xì)胞分布積累和遷移特征：施加亞硒酸鈉葉片對硒的利用效果最優(yōu)，最佳施硒量為0.008" mg每葉，葉施硒后3～7 h是葉片合成籽粒所需硒的最佳時(shí)間，同時(shí)在外源硒中加入鼠李糖脂可以促進(jìn)硒的吸收，減少外源硒的施用量，節(jié)約了硒資源，降低了環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。上述結(jié)果為后續(xù)了解硒在葉片中的遷移機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，也為未來硒配方優(yōu)化、科學(xué)施硒制度建立以及降低硒生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供支撐。

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