摘 要：" 為探究器官鎘（Cd）積累對(duì)艾納香內(nèi)生菌的影響，該文采用16S rRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析，研究不同外源鎘處理（0、2.0 mg·kg-1）下艾納香根、莖、葉Cd積累對(duì)內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)特征的影響。結(jié)果表明：（1）與未添加外源Cd（0 mg·kg-1，Cd0）相比，Cd（2.0 mg·kg-1，Cd2）處理促進(jìn)了植株生長(zhǎng)，根、莖、葉中Cd積累量順序?yàn)槿~（16.75 mg·kg-1）gt;莖（11.99 mg·kg-1）gt;根（3.96 mg·kg-1）。（2）α多樣性分析表明，各器官內(nèi)生菌豐富度（Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)）和多樣性（Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)）均以根最高，莖次之，葉最低，并且Cd2處理各器官內(nèi)生菌豐富度和多樣性均高于Cd0處理。（3）在門水平上，兩個(gè)處理根、莖、葉內(nèi)生菌均以變形菌門、放線菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)菌群；在屬水平上，代爾夫特菌是Cd0和Cd2處理各器官的主要菌屬，相對(duì)豐度分別為53.0%～92.7%和57.1%～89.2%；艾納香根、莖、葉內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)有一定的相似性，Cd2處理提高了根、莖、葉共有內(nèi)生菌屬的比例及各器官（根除外）獨(dú)有內(nèi)生菌屬比例。（4）線性判別分析（LEfSe）表明，相同處理不同器官間及不同處理相同器官間內(nèi)生菌屬存在差異。（5）冗余分析（RDA）發(fā)現(xiàn)，根際土壤Cd含量、器官Cd含量與內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)組成有明顯的相關(guān)性。（6）共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，Cd積累使艾納香根、葉內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)變得復(fù)雜且增強(qiáng)了根、莖物種間的競(jìng)爭(zhēng)作用和葉物種間的協(xié)同共生作用。綜上認(rèn)為，外源Cd處理影響了艾納香各器官內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)及相互作用模式。

關(guān)鍵詞： 艾納香， 內(nèi)生菌， 鎘（Cd）， 16S rRNA， 共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)

中圖分類號(hào)：" Q938.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：" A

文章編號(hào)：" 1000-3142（2024）10-1878-16

收稿日期：" 2024-02-22

接受日期：" 2024-03-19

基金項(xiàng)目：" 國(guó)家自然科學(xué)基金（31960265）。

第一作者： 陳嬌嬌（1997—），碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境生物學(xué)，（E-mail）2681972430@qq.com。

*通信作者：" 王俊麗，博士，副教授，主要從事環(huán)境生物學(xué)相關(guān)研究，（E-mail）411395583@qq.com。

Effects of cadmium accumulation on the structure and

co-occurrence network of endophytic bacterial

community in Blumea balsamifera

CHEN Jiaojiao， REN Jianguo， WANG Junli*

（ Key Laboratory of Environmental Pollution Monitoring and Disease Control， Ministry of Education，

School of Public Health， Guizhou Medical University， Guiyang 561113， China ）

Abstract：" To probe into the impacts of organ cadmium accumulation on endophytic bacteria in Blumea balsamifera， the methods of high-throughput sequencing of 16S rRNA gene V3-V4 region and molecular ecological network analysis were employed to study the effects of Cd accumulation in root， stem and leaf of B. balsamifera on the community characteristics of endophytic bacteria under different exogenous cadmium treatments （0 and 2.0 mg·kg-1）. The results were as follows： （1） In comparison with the control group without exogenous cadmium addition （0 mg·kg-1， Cd0）， the treatment group with cadmium spiking （2.0 mg·kg-1， Cd2） in soils promoted plant growth and the cumulative Cd contents in root， stem and leaf， with the order of leaf （16.75 mg·kg-1） gt; stem （11.99 mg·kg-1） gt; root （3.96 mg·kg-1）. （2） α diversity analysis showed that the endophytic bacteria richness （Sobs， Ace and Chao1 indices） and diversity （Shannon and Simpson indices） for organs were the highest in root， followed by stem and leaf under Cd0 and Cd2 treatments. Additionally， the indices of richness and diversity of endophytic bacteria for each organ under Cd2 treatment were superior to those under Cd0. （3） At the phylum level， Proteobacteria， Actinobacteriota and Firmicutes were the dominant bacterial phyla in all the organs for both treatments; at the genus level， Delftia was the main bacterial genus with the relative abundance ranged from 53.0% to 92.7% and 57.1% to 89.2% in the plant organs of Cd0 and Cd2， respectively; certain similarities existed among the endophytic bacterial community structures of root， stem and leaf of B. balsamifera， and Cd2 increased the proportion of mutual endophytic bacterial genera in root， stem and leaf and that of unique endophytic ones in each organ （except for the root）. （4） Linear discriminant analysis Effect Size （LEfSe） analysis showed that there existed the differences on endophytic bacterial genera residing in different organs within the same treatment and also the same organ between treatments. （5） Redundancy analysis （RDA） showed that the contents of rhizosphere soil Cd and plant organ Cd were significantly correlated with the composition of endophytic bacterial community. （6） Co-occurrence network analysis clarified that cadmium accumulation in B. balsamifera complicated the interaction network of endophytic bacteria occurring in root and leaf， and enhanced the competition among endophytic bacterial species in root and stem， and the symbiosis in leaf. In summary， exogenous Cd treatment affected the community structure and interaction mode of endophytic bacteria in B. balsamifera organs.

Key words： Blumea balsamifera， endophytic bacteria， cadmium（Cd）， 16S rRNA， co-occurrence network

鎘（Cd）是我國(guó)農(nóng)田重金屬污染元素之一，是植物非必需元素。隨著工業(yè)化的發(fā)展，Cd通過(guò)汽車尾氣、水泥廠、農(nóng)用化肥和冶煉廠粉塵等途徑排放到環(huán)境中，造成環(huán)境污染（Zhou et al.， 2017；Lin et al.， 2022）。Cd污染導(dǎo)致植物營(yíng)養(yǎng)缺乏、光合強(qiáng)度降低、氧化應(yīng)激發(fā)生等，表現(xiàn)為植物生長(zhǎng)受抑制，嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致植物死亡（張星雨等，2021）。中藥材是中醫(yī)臨床防病治病的物質(zhì)基礎(chǔ)，在臨床治療中占有重要地位，其質(zhì)量好壞直接關(guān)系著臨床療效。已有研究表明，Cd在多種中藥材中有超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)，并且對(duì)中草藥生長(zhǎng)發(fā)育及活性成分積累均有抑制作用（蒲翔等，2019；張德林等，2019）。

植物內(nèi)生菌是一類存在于植物體內(nèi)，不對(duì)寄主植物產(chǎn)生傷害的微生物類群（Hardoim et al.， 2008）。在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，內(nèi)生菌與宿主植物形成了互利共生的友好關(guān)系，表現(xiàn)為宿主植物為內(nèi)生菌提供穩(wěn)定的生存環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而內(nèi)生菌則通過(guò)分泌代謝物調(diào)節(jié)宿主植物的生理活動(dòng)，進(jìn)而促進(jìn)植物從土壤環(huán)境中汲取養(yǎng)分（姚雨軒，2022）。當(dāng)寄主植物遭遇非生物（Cd2+）脅迫時(shí)，內(nèi)生菌主要通過(guò)激素調(diào)節(jié)（He et al.， 2017）、增強(qiáng)光合作用（Zhang et al.， 2023）、增加蛋白質(zhì)含量（Zhou et al.， 2021）、增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)（Kuramshina et al.， 2018）、強(qiáng)化根系細(xì)胞壁木質(zhì)素沉積（Maslennikova et al.， 2023）以及與宿主協(xié)同作用（Xie et al.， 2023）等方式緩解重金屬脅迫；或通過(guò)胞內(nèi)積累、胞外固定等將有毒重金屬轉(zhuǎn)化成低毒或無(wú)毒形式（Long et al.， 2021）；還可通過(guò)分泌鐵載體（Nakamoto et al.， 2021）、有機(jī)酸（Li et al.， 2017）、氨基酸（Latif et al.， 2016）和提高土壤pH （Wang et al.， 2022）等降低重金屬的植物有效性；也可通過(guò)調(diào)節(jié)植物對(duì)重金屬吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)，從而降低或增強(qiáng)植物對(duì)重金屬的積累（Cheng et al.， 2021；Qian et al.， 2022）。

已有研究表明，超積累植物不同器官或組織內(nèi)細(xì)菌群落組成與其重金屬積累量密切相關(guān)（羅繼鵬等，2018）。Cd積累會(huì)對(duì)原有內(nèi)生菌產(chǎn)生選擇性壓力，導(dǎo)致一些不能適應(yīng)Cd脅迫的內(nèi)生菌群落數(shù)量減少或消失（鄒淑華等，2019）。姚雨軒（2022）研究指出，重金屬污染水平是影響刺槐（Robinia pseudoacacia）內(nèi)生菌群落組成差異的關(guān)鍵因子之一，隨著重金屬含量增加，內(nèi)生菌群落多樣性（Shannon指數(shù)）降低，而豐富度（Chao1指數(shù)）增加，同時(shí)，內(nèi)生菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)模塊的平均度、聚類系數(shù)、網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)密度和連接邊數(shù)均隨重金屬含量增加而減少。Cu-Cd礦區(qū)和良田蓖麻（Ricinus communis）內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性和豐富度研究結(jié)果表明，無(wú)Cd區(qū)蓖麻內(nèi)生細(xì)菌群落的多樣性和豐富度均大于Cd污染區(qū)（Li et al.， 2023）。在鄒淑華等（2019）研究中，耐Cd型（HE）東南景天（Sedum alfredii）葉片內(nèi)生細(xì)菌的豐富度在Cd0（未添加Cd）土壤上最大，而莖和根系內(nèi)生細(xì)菌的豐富度在Cd5（土壤Cd添加水平為5 mg·kg-1）土壤上最大。另外，器官內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受重金屬的積累量影響，如刺槐根中因積累了大量的Cd2+，導(dǎo)致其根部共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較地上部簡(jiǎn)單（姚雨軒，2022）。但在不同Zn污染水平上，東南景天莖和葉不僅積累大量的Zn，而且其內(nèi)生菌豐富度大多高于根部（陸麗婷，2018）。

艾納香（Blumea balsamifera）是貴州省道地藥材，可用于治療鼻竇炎、絞痛、咳嗽、腎結(jié)石、流感等疾?。╓idhiantara amp; Jawi， 2021）。艾納香對(duì)Cd具有富集作用，富集系數(shù)為2.5～15.8，各器官Cd積累量表現(xiàn)為葉gt;莖gt;根（梁娟等，2016；陳子涵等，2022），由于定殖于植物器官、組織中與植物生長(zhǎng)、生理密切相關(guān)的內(nèi)生菌通常具有耐重金屬性（Mufti et al.， 2015），因此有必要探究不同器官Cd積累量對(duì)其內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)的影響，為從內(nèi)生菌角度探討不同器官耐Cd差異性提供新思路。因此，本研究設(shè)置了2個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組（Cd0和Cd2），利用16S rRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行艾納香根、莖、葉內(nèi)生菌群落組成分析，并結(jié)合內(nèi)生菌分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析，以了解Cd積累對(duì)內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)特征變化的影響，以及與器官Cd積累密切相關(guān)的內(nèi)生細(xì)菌種類，為今后開發(fā)利用功能內(nèi)生菌治理Cd污染土壤提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 艾納香植株培育

試驗(yàn)幼苗選自貴州省羅甸縣艾納香種植基地2～3個(gè)月幼苗，試驗(yàn)土壤選自貴州醫(yī)科大學(xué)南校區(qū)農(nóng)用土壤，基本理化性質(zhì)為pH=7.54，速效氮4.15 mg·kg-1，有機(jī)磷0.74 mg·kg-1，速效鉀87.40 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)1.31 mg·kg-1，土壤Cd的背景值為0.031 mg·kg-1。本試驗(yàn)采用盆栽培養(yǎng)，設(shè)置兩個(gè)處理 ［無(wú)Cd處理組（Cd0，種植土壤無(wú)外源Cd添加）和Cd處理組（Cd2，種植土壤Cd添加濃度為2.0 mg·kg-1）］，每個(gè)處理組6個(gè)重復(fù)，每盆分裝5 kg試驗(yàn)土，種植大小一致的幼苗一株，共12株。

1.2 樣本采集

盆栽培養(yǎng)170 d后，每處理組各采收3株生長(zhǎng)健康的艾納香（無(wú)菌斑、蟲咬缺口和機(jī)械損傷）植株連同土壤一并帶回實(shí)驗(yàn)室，用軟毛刷收集植物根際土壤，并保存于-80 ℃。用自來(lái)水沖洗艾納香植株完畢后，室溫晾干，并將根、莖、葉分別稱其鮮重。一部分根、莖、葉樣品烘干至恒重、磨碎、過(guò)60目尼龍篩，儲(chǔ)存于干燥器中用于各器官Cd含量測(cè)定；一部分樣品進(jìn)行表面消毒后用于內(nèi)生菌DNA提取。

1.3 植株和土壤樣品的化學(xué)分析

參考陳子涵等（2022）的方法，分別稱取0.1 g植物樣品（根、莖、葉）及土樣，加入7 mL HNO3-H2O2（體積比V∶V=5∶2）酸泡過(guò)夜，再置于電熱板上150 ℃消解，消解至體積不足1 mL（呈澄清或淡黃色），冷卻、定容，用石墨爐原子吸收光譜儀（contrAA 700）測(cè)定Cd含量，進(jìn)而計(jì)算各器官Cd質(zhì)量分?jǐn)?shù)。根際土壤Cd的測(cè)定參考《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（夏家淇等，1995）。根據(jù)公式（1）、（2）計(jì)算轉(zhuǎn)移系數(shù)和富集系數(shù)。

富集系數(shù)=艾納香體內(nèi)Cd含量/土壤中Cd含量（1）

轉(zhuǎn)移系數(shù)=艾納香地上部Cd含量/根部Cd含量（2）

1.4 樣本表面消毒

將采集的根、莖、葉樣品剪成大段（長(zhǎng)約5 cm），無(wú)菌水徹底清洗后，先用75%酒精表面消毒（根1 min、莖和葉10 s），無(wú)菌蒸餾水漂洗1次，再用1.0% NaClO消毒3 min，然后用無(wú)菌水清洗3次，收集最后1次無(wú)菌水沖洗液，吸取100 μL涂布至LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，瓊脂15g·L-1）平板恒溫（28 ℃）培養(yǎng)2～3 d，以檢查組織表面消毒是否徹底。將表面消毒徹底的樣本轉(zhuǎn)移到無(wú)菌研缽中，加入液氮研磨成粉狀，無(wú)菌轉(zhuǎn)移至滅菌EP管內(nèi)。各處理組根、莖和葉樣品分別準(zhǔn)備3份。

1.5 DNA提取和高通量測(cè)序

DNA提取采用FastDNA Spin Kit for Soil試劑盒（MP Biomedicals， USA），按照說(shuō)明書的提取步驟進(jìn)行，將提取得到的總DNA通過(guò)微量分光光度計(jì)（NanoDrop2 000，Thermo Fisher Scientific，USA）測(cè)定DNA濃度和純度。

采用引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGC

AG-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′對(duì)16S rRNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol·L-1 dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol·L-1） 0.8 μL，下游引物（5 μmol·L-1） 0.8 μL，F(xiàn)astPfu DNA Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，基因組DNA 10 ng，補(bǔ)ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)體系：預(yù)變性95 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)（變性95 ℃ 30 min，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s），穩(wěn)定延伸72 ℃ 10 min，10 ℃保存直至反應(yīng)結(jié)束。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，使用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit純化PCR產(chǎn)物，測(cè)序工作交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.6 高通量數(shù)據(jù)處理及分析

使用Fastp軟件和FLASH軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控及拼接，過(guò)濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基，允許overlap區(qū)最大錯(cuò)配比率為0.2，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，去除所有樣本中注釋到的葉綠體和線粒體序列，將所有樣本序列抽平至2 000，利用RDP classifier分類網(wǎng)站和Silva 16 rRNA基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行OTU物種分類學(xué)注釋，置信度閾值為70%。計(jì)算α多樣性（Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)），并采用Wilxocon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行α多樣性組間差異分析。用線性判別分析（Linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）確定同一處理不同器官間或不同處理組間相同器官屬水平差異顯著的內(nèi)生細(xì)菌類群（LDA值gt;2）。使用基于歐氏距離的冗余分析（redundancy analysis， RDA）探討土壤Cd和器官Cd對(duì)艾納香細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。對(duì)各器官中所有屬（genus）間進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，得到相關(guān)系數(shù)矩陣和P值矩陣，并采用Benjamini and Hochberg 1 discovery rate （FDR）方法矯正上述計(jì)算中所得到的P值，根據(jù)屬間Spearman相關(guān)系數(shù)（｜r｜gt;0.7）和Plt;0.001作為閾值進(jìn)行物種間共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建。利用Gephi軟件（0.10.1）構(gòu)建分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)（molecular ecological networks， MENs），并計(jì)算包括網(wǎng)絡(luò)平均連通度、網(wǎng)絡(luò)直徑、網(wǎng)絡(luò)密度、平均聚類系數(shù)、模塊化、模塊個(gè)數(shù)等在內(nèi)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩浴?/p>

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 26.0和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理分析和繪圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。服從正態(tài)分布和滿足方差齊性時(shí)，采用t檢驗(yàn)、方差分析（ANOVA）法分析數(shù)據(jù)差異，不滿足正態(tài)分布和方差齊性時(shí)采用非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)及Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾納香器官生物量及Cd含量

由圖1：a可知，與Cd0處理相比，Cd2處理下艾納香各器官生物量均增加且莖的生物量增加明顯（Plt;0.01），由此可見，2.0 mg·kg-1Cd處理對(duì)艾納香生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，進(jìn)而說(shuō)明艾納香對(duì)一定量的Cd有耐受性。

Cd含量測(cè)定結(jié)果（圖1：b）表明，艾納香各器官Cd積累量大小表現(xiàn)為葉gt;莖gt;根，并且Cd2處理下各器官Cd含量顯著高于Cd0處理（Plt;0.001）。此外，由圖1：c可知，艾納香對(duì)外源Cd的轉(zhuǎn)移系數(shù)達(dá)到15.82，富集系數(shù)達(dá)到7.39，說(shuō)明艾納香對(duì)Cd具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移和富集能力。

2.2 Cd對(duì)艾納香內(nèi)生細(xì)菌α多樣性影響

使用Fastp、FLASH軟件對(duì)18個(gè)樣本的原始測(cè)序結(jié)果進(jìn)行過(guò)濾、拼接、篩選等后續(xù)處理，共獲得969 532條優(yōu)化序列，其中Cd0處理樣本平均獲得159 421條優(yōu)化序列，Cd2處理樣本平均獲得149 711條優(yōu)化序列。在97%相似度下，序列被注釋得到1 421個(gè)OTUs，Cd0和Cd2處理分別得到616個(gè)和805個(gè)OTUs（表1）。為驗(yàn)證艾納香樣本的測(cè)序深度能否充分反映艾納香實(shí)驗(yàn)樣本的內(nèi)生菌多樣性，本實(shí)驗(yàn)繪制了Chao1指數(shù)的稀釋曲線，如圖2所示，稀釋曲線持續(xù)增高后呈平穩(wěn)狀態(tài)，說(shuō)明測(cè)序量充足，支持后續(xù)的分析。

艾納香根、莖、葉內(nèi)生菌α多樣性分析結(jié)果見表1。相同處理?xiàng)l件下， 不同器官內(nèi)生菌豐富度（Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)）和多樣性（Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)）存在一定差異，具體表現(xiàn)為根中內(nèi)生菌豐富度及多樣性明顯高于莖和葉（Plt;0.05），而莖、葉中內(nèi)生菌多樣性及豐富度無(wú)顯著差異。總的來(lái)看，艾納香各器官內(nèi)生菌α多樣性呈現(xiàn)為根gt;莖gt;葉。

組間α多樣性結(jié)果（表1）表明，Cd2處理下艾納香各器官內(nèi)生菌多樣性及豐富度均高于Cd0處理，特別是莖中內(nèi)生菌豐富度（Plt;0.05），由此可見外源Cd添加（2.0 mg·kg-1）提高了艾納香內(nèi)生菌α多樣性，也進(jìn)一步說(shuō)明了宿主器官Cd積累會(huì)使植株‘招募’更多種類內(nèi)生菌以使其適應(yīng)體內(nèi)不同微環(huán)境的變化。

2.3 Cd對(duì)艾納香內(nèi)生菌群落組成的影響

基于門水平的內(nèi)生菌群落相對(duì)豐度分析表明，外源Cd處理會(huì)影響艾納香各器官內(nèi)生菌群落組成（圖3：a）。變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）和厚壁菌門（Firmicutes）等在各器官中占絕對(duì)數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)。Cd2處理下，根、莖、葉中放線菌門、厚壁菌門、酸桿菌門（Acidobacteria）相對(duì)豐度分別為10.6%、1.6%、0.4%，2.5%、9.8%、0.5%和1.1%、3.9%、0.1%，高于Cd0處理相應(yīng)器官——根（3.9%、0.9%、0.0%）、莖（0.9%、1.7%、0.1%）、葉（1.1%、1.7%、0.0%）3個(gè)門水平的細(xì)菌數(shù)量；Cd2處理下，根、莖、葉中變形菌門相對(duì)豐度（84.8%、85.6%、93.9%）低于Cd0處理相應(yīng)器官變形菌門數(shù)量（93.9%、96.2%、96.4%）。Cd0和Cd2處理葉中擬桿菌門（Bacteroidota）相對(duì)豐度無(wú)差異，但在根和莖中擬桿菌門數(shù)量有差異，表現(xiàn)為莖中Cd0gt;Cd2、根中Cd0lt;Cd2。

在屬水平上，各處理器官以代爾夫特菌屬（Delftia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）為主要菌屬，代爾夫特菌屬在各樣本中的相對(duì)豐度范圍為22%～92.7%（圖3：b）。Cd0處理的莖、葉中代爾夫特菌屬相對(duì)豐度均大于92%，其數(shù)量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，此外Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、鞘氨醇菌屬（Sphingobium）主要存在于根中。Cd2處理下，根中鞘氨醇菌屬，莖中假單胞菌屬、乳桿菌屬，葉中芽孢桿菌屬相對(duì)豐度均高于Cd0處理，但根中假單胞菌屬、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium，莖和葉中代爾夫特菌屬相對(duì)豐度低于Cd0處理，該結(jié)果表明鞘氨醇菌屬、假單胞菌屬、乳桿菌屬、芽孢桿菌屬等內(nèi)生菌具有耐Cd能力。

韋恩圖分析（屬水平）（圖4）結(jié)果表明：Cd0處理下，根中獨(dú)有菌屬62個(gè)（20.9%），莖中獨(dú)有菌屬16個(gè)（5.4%），葉中獨(dú)有菌屬10個(gè)（3.4%），根、莖、葉中共有菌屬132個(gè)（44.4%）；Cd2處理下，根中獨(dú)有菌屬31個(gè)（10.1%），莖中獨(dú)有菌屬18個(gè)（5.8%），葉中獨(dú)有菌屬5個(gè)（1.6%），根、莖、葉中共有菌屬175個(gè)（56.8%）。綜上表明，各處理下艾納香根、莖、葉中內(nèi)生細(xì)菌的群落組成具有一定的相似性，但不同處理間相同器官內(nèi)生菌組成的變化間接反映了內(nèi)生菌對(duì)各器官不同化學(xué)組成環(huán)境適應(yīng)的改變。此外，與Cd0處理相比，Cd2處理的莖和葉中擁有更多的內(nèi)生菌屬（圖4），表明更多種屬細(xì)菌參與宿主對(duì)高積累Cd脅迫的抵抗。

通過(guò)冗余分析（RDA）識(shí)別內(nèi)生菌群落與根際土壤Cd和器官Cd含量之間的關(guān)系。由圖5可知，在艾納香根、莖、葉前20種物種中，Cd2處理各器官多數(shù)內(nèi)生菌豐度與根際土壤Cd、器官Cd含量呈正相關(guān)，包括根中芽孢桿菌屬、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）、unclassified_f Comamonadaceae、塔希桿菌屬（Tahibacter）、代爾夫特菌屬等，莖中分枝桿菌屬、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、游動(dòng)放線菌屬（Actinoplanes）、芽孢桿菌屬、短小桿菌屬（Curtobacterium）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、假單胞菌屬等，葉中芽孢桿菌屬、短小桿菌屬、鞘氨醇菌屬、食酸菌屬（Acidovorax）、塔希桿菌屬、unclassified_f Enterobacteriaceae、馬賽菌屬（Massilia）等；僅有少數(shù)內(nèi)生菌與之呈負(fù)相關(guān)，如根中Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、假單胞菌屬、食酸菌屬、馬賽菌屬、鞘氨醇菌屬，莖中食酸菌屬、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、馬賽菌屬、代爾夫特菌屬，葉中慢生根瘤菌屬、代爾夫特菌屬、紅微菌屬（Rhodomicrobium）、unclassified_f Comamonadaceae、類諾卡氏菌屬等。而Cd0處理各器官內(nèi)生菌豐度與根際土壤Cd、器官Cd含量的關(guān)系與Cd2處理的結(jié)果相反。上述結(jié)果說(shuō)明Cd處理下內(nèi)生菌組成和結(jié)構(gòu)的變化對(duì)艾納香Cd富集作用有著重要的影響。

2.4 Cd對(duì)艾納香內(nèi)生菌物種差異的影響

以內(nèi)生細(xì)菌類群為研究對(duì)象，利用線性判別分析（LEfSe）區(qū)分同一處理組內(nèi)不同器官間及不同處理組相同器官之間的主要差異物種。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cd0處理下，與莖、葉相比，根中的差異物種類較多，主要有Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizo-bium-Rhizobium、假單胞菌屬、鞘氨醇菌屬、食酸菌屬、馬賽菌屬、游動(dòng)放線菌屬、塔希桿菌屬、Rhizobacter、纖維單胞菌屬（Cellulomonas）、Novosphingobium、Caulobacter、Bosea、鞘氨醇單胞菌屬、Methylobacillus等物種；與根相比，莖、葉中主要差異物種有代爾夫特菌屬和芽孢桿菌屬；此外，葉中芽孢桿菌屬、Bosea、乳桿菌屬、Gaiella、Arenimonas、假諾卡氏菌屬、Deinococcus等數(shù)量明顯高于莖（圖6：a）。

同樣在Cd2處理下，與莖、葉相比，根中存在更多的差異物種，主要有鞘氨醇菌屬、塔希桿菌屬、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、游動(dòng)放線菌屬、假諾卡氏菌屬、分枝桿菌屬、慢生根瘤菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、紅微菌屬、食酸菌屬、馬賽菌屬等物種；與根相比，莖中主要差異物種有乳桿菌屬、水稻土菌屬（Oryzihumus）、Acidothermus，葉中主要有代爾夫特菌屬、芽孢桿菌屬、Tsukamurella、Nakamurella；另外，莖中的差異物種較葉中多，主要有乳桿菌屬、Sulfuritalea、纖維單胞菌屬、Klenkia、Desulfocapsa、Iamia等物種（圖6：b）。

不同處理相同器官比較發(fā)現(xiàn)（圖7），Cd2處理各器官存在更多差異物種，根中主要有分枝桿菌屬、假諾卡氏菌屬、類諾卡氏菌屬、慢生根瘤菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽孢桿菌屬、Devosia、Acidibacter、Lechevalieria等物種，莖中主要有乳桿菌屬、纖維單胞菌屬、假諾卡氏菌屬、Sulfuritalea、水稻土菌屬、Ahniella、Desulfocapsa等物種，葉中主要有芽孢桿菌屬、Bosea、Pseudorhodoplanes、Mesorhizobium、Rhizobacter等物種；Cd0處理根中主要有假單胞菌屬、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、食酸菌屬等物種，莖中主要有代爾夫特菌屬、Novosphingobium等物種，葉中主要有Brevundimonas、Candidatus_Microthrix等物種。綜上表明，Cd積累不但影響各器官內(nèi)生菌物種組成，還有促使各器官‘招募’更多差異內(nèi)生菌的趨向，這或許在艾納香對(duì)Cd積累的適應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。

2.5 Cd對(duì)艾納香內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)的影響

共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)總體拓?fù)湫再|(zhì)分析結(jié)果見表2。Cd0處理下根、莖、葉共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)分別為162、117、114，邊分別為1 558、1 250、1 347，平均連通度分別為19.235、21.368、23.632，網(wǎng)絡(luò)密度分別為0.119、0.184、0.209；Cd2處理下根、莖、葉共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)分別為254、140、152，邊分別為7 200、998、3 139，平均連通度分別為28.346、14.257、41.303，網(wǎng)絡(luò)密度分別為0.112、0.103、0.274。上述結(jié)果表明，Cd2處理下根和葉內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)規(guī)模趨向大而復(fù)雜，莖則表現(xiàn)出相反效果。Cd0處理下根、莖、葉各器官內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)模塊性數(shù)值分別為0.591、0.672、0.517，模塊數(shù)分別為29、15、14，Cd2處理下各器官共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)模塊性數(shù)值分別為0.654、0.693、0.346，模塊數(shù)分別為68、28、17。該結(jié)果表明Cd2處理下根、莖和葉共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)內(nèi)生菌功能單元均有所增加，各器官共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)模塊表現(xiàn)（模塊性）以葉網(wǎng)絡(luò)模塊間連接較多且緊密，莖次之。此外，各處理樣本內(nèi)生菌群落均以正相關(guān)為主，但隨著Cd的施加，根、莖中共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)正相關(guān)連線比例減少（特別是根），而葉中正相關(guān)連線比例則有所增加，表明Cd處理改變了各器官內(nèi)生菌物種間的相互作用，具體表現(xiàn)為葉中協(xié)同共生關(guān)系的加強(qiáng)和根、莖中物種間競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的增強(qiáng)。

對(duì)物種進(jìn)行相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)互作分析，由內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)組成（圖8）可知：Cd0處理下，根中邊數(shù)較大的物種為Pseudoxanthobacter（42）、Dokdonella（42）、Novispirillum（42）、Bryobacter（42）、Occallatibacter（42）、Gemmatimonas（42）、Azovibrio（42）、Cryomorpha（42）、Zymobacter（42）、Romboutsia（42）等，莖中邊數(shù)較大的物種為Planococcus（31）、Aquaspirillum（31）、Turicibacter（31）、Dactylosporangium（31）、Devosia（31）、Thauera（31）、Haematobacter（31）、Garicola（31）、Agromyces（31）、Altererythrobacter（31）等，葉中邊數(shù)較大的物種為Planococcus（41）、Bdellovibrio（41）、Dokdonella（41）、Ahniella（41）、Hyphomicrobium（41）、Luteimonas（41）、Cellulomonas（41）、Photobacterium（41）、Pseudarthrobacter（41）、Reyranella（41）等；Cd2處理下，根中邊數(shù)較大的物種為Sporacetigenium（81）、乳桿菌屬（81）、Novispirillum（81）、Truepera（81）、Altererythrobacter（81）、 Romboutsia（81）、 Reyranella （81）、Gordonia（81）、Brevundimonas（81）、Dongia（81）等，莖中邊數(shù)較大的物種為Planifilum（28）、Luteimonas（28）、Dactylosporangium（28）、Thauera（28）、Streptococcus（28）、Ohtaekwangia（28）、Agromyces（28）、Zymobacter（28）、Microvirga（28）、Rubrobacter（28）等，葉中邊數(shù)較大的物種為Deinococcus（70）、Pseudoxanthobacter（70）、Pedomicrobium（70）、Planococcus（70）、Rhodoplanes（70）、Planifilum（70）、Lechevalieria（70）、Aquaspirillum（70）、Nonomuraea（70）、Dokdonella（70）等。由此可見，器官Cd積累會(huì)影響各器官內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和物種間的互作關(guān)系。

3 討論

3.1 Cd積累對(duì)艾納香器官內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)的影響

植物內(nèi)生菌群落易受非生物和生物因子所調(diào)節(jié)（Hallmann et al.， 1997；Fuentes-Ramirez et al.， 1999；Seghers et al.， 2004；Liang et al.， 2021）。相關(guān)研究普遍認(rèn)為Cd污染導(dǎo)致植物內(nèi)生菌多樣性下降（亓文鈺，2021；Li et al.， 2023），但在黑麥草（Lolium perenne） （Liang et al.， 2021）、超積累型東南景天等（鄒淑華等，2019）相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，金屬Cd污染導(dǎo)致內(nèi)生菌多樣性增加，同樣在本研究中，艾納香Cd脅迫積累不僅能促進(jìn)植株生長(zhǎng)，還能提高各器官內(nèi)生細(xì)菌多樣性和豐富度，該現(xiàn)象的發(fā)生與一些研究者指出的內(nèi)生菌多樣性越高，宿主植物對(duì)環(huán)境脅迫的適宜性越強(qiáng)結(jié)果相符（Sánchez-López et al.， 2018）。另外，本研究Cd0和Cd2處理下，艾納香根中內(nèi)生細(xì)菌多樣性和豐富度均顯著高于莖和葉，這與三七（Panax notoginseng）內(nèi)生菌分布結(jié)果相似（Liu et al.， 2020），可能與根內(nèi)生菌主要來(lái)源于土壤有關(guān)（Gao amp; Shi， 2018）。

本研究中艾納香內(nèi)生菌群落由變形菌門、放線菌門和厚壁菌門等組成，其中變形菌門占主要地位，這與甘松（Nardostachys jatamansi） （李瑩等，2022）、冰川棘豆（Oxytropis glacialis） （許國(guó)琪等，2021）等植物內(nèi)生菌組成的研究結(jié)果一致，說(shuō)明植物內(nèi)生菌在較大分類單元下基本一致。在本研究中，與Cd0處理相比，Cd2處理根、莖、葉中變形菌門的相對(duì)豐度降低，而放線菌門、厚壁菌門、酸桿菌門的相對(duì)豐度升高，這與Liang等（2021）和鄒淑華等（2019）的研究結(jié)果一致。從屬水平上來(lái)看，Cd積累導(dǎo)致艾納香根、莖、葉中優(yōu)勢(shì)菌屬增加，如根中的代爾夫特菌屬、鞘氨醇菌屬，莖中的假單胞菌屬、乳桿菌屬以及葉中的芽孢桿菌屬，RDA分析結(jié)果也表明上述菌屬與器官Cd含量和土壤Cd含量的密切相關(guān)性。各器官不同程度的Cd積累導(dǎo)致內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)不同也體現(xiàn)在東南景天上（鄒淑華等，2019），如超積累型東南景天（HE）莖中Alphaproteobacteria，葉片中Gammaproteobacteria、Negativicutes和Clostridia 4個(gè)綱內(nèi)生菌的相對(duì)豐度隨Cd2+積累的增多顯著增加。與根部相比，超積累植物Thlaspi caerulescens subsp. calaminaria地上部?jī)?nèi)生菌不僅有耐高濃度Cd2+、Zn2+等特點(diǎn)，還存在器官特定優(yōu)勢(shì)菌屬，如Methylobacterium （Lodewyckx et al.， 2002），由此可見，內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)受宿主植物和土壤環(huán)境的影響。

相關(guān)研究指出，在Cd脅迫下，植物能夠‘招募’特定的內(nèi)生菌種群，從而實(shí)現(xiàn)高Cd抗性和植物生長(zhǎng)促進(jìn)特性（臺(tái)喜生等，2021；Liang et al.， 2021）。一般來(lái)說(shuō)，‘招募’的特定內(nèi)生菌種群往往具有較強(qiáng)的耐Cd性，如東南景天從根際土壤中‘招募’大量耐Cd/Zn內(nèi)生菌，包括Burkholderia、芽孢桿菌屬、Novosphingobium等來(lái)強(qiáng)化其對(duì)重金屬脅迫的抵抗（Wu et al.， 2020）。本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cd處理艾納香根、莖、葉中存在大量的差異優(yōu)勢(shì)物種，如芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、乳桿菌屬等。Maslennikova等（2023）研究指出，芽孢桿菌屬能夠強(qiáng)化根系細(xì)胞壁木質(zhì)素的沉積，進(jìn)而阻止Cd向地上部轉(zhuǎn)移，以減輕其毒害作用。假單胞菌屬可通過(guò)調(diào)節(jié)東南景天重金屬ATPase（HMA）、天然抗性相關(guān)巨噬蛋白（NRAMP）、ZRT/IRT-like蛋白（ZIP）等基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)Cd轉(zhuǎn)移的調(diào)控和耐性（Chen et al.， 2017）。乳桿菌屬的胞外多糖通過(guò)改變水稻根Cd亞細(xì)胞分布和Cd化學(xué)形態(tài)形式來(lái)減少Cd向地上部籽粒的轉(zhuǎn)移和減輕Cd毒害（Li KT et al.， 2022）。由此可見，艾納香各器官中更多差異內(nèi)生菌可能參與艾納香生長(zhǎng)及Cd2+的吸收、積累和解毒生理代謝過(guò)程。

3.2 Cd積累對(duì)艾納香內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響

在生態(tài)系統(tǒng)中，微生物通常以復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)共存和相互作用，構(gòu)建微生物共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)為探究微生物群落內(nèi)潛在的相互作用提供了技術(shù)支撐（Chu et al.， 2021）。一般來(lái)說(shuō)，網(wǎng)絡(luò)越復(fù)雜，群落結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定（Li H et al.， 2022）。艾納香各器官內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，無(wú)論是Cd0處理，還是Cd2處理，根部?jī)?nèi)生菌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)都比莖、葉復(fù)雜且物種間以正相關(guān)為主，這與Zhang等（2022）的研究結(jié)果一致，即在兩種農(nóng)業(yè)種植模式中，均表現(xiàn)為番茄根中內(nèi)生細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)比莖中復(fù)雜。兩處理組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Cd2處理下根、葉內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)比Cd0更復(fù)雜（表現(xiàn)為更多的邊數(shù)和較大的平均連通度和網(wǎng)絡(luò)密度數(shù)值），并且增加了根、莖中內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)負(fù)相關(guān)邊比例和葉中正相關(guān)邊比例，進(jìn)而說(shuō)明Cd積累導(dǎo)致各器官內(nèi)生菌之間的相互作用關(guān)系有所改變，即在根、莖中物種間競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的增強(qiáng)，而在葉中則為物種間共生關(guān)系的增強(qiáng)，但從總體而言，各器官物種間的共生關(guān)系占主導(dǎo)地位。同樣在He等（2021）研究中，高鎘污染提高鴨跖草（Commelina communis）內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性且物種間主要以正相關(guān)關(guān)系存在，而超積累植物刺槐（Robinia pseudoacacia）在鎘、銅、鉛等污染狀態(tài)下，器官內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)趨向于簡(jiǎn)單，物種間的關(guān)系并不以正相關(guān)作用為主，從各器官內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)模塊特性來(lái)看，葉內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)比根更復(fù)雜（姚雨軒，2022），這與本研究中Cd2處理下器官內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)特點(diǎn)表現(xiàn)基本一致。鎘污染下水稻器官內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)分析表明，與地上部（模塊性為0.537）相比，根部（模塊性為0.277）積累更多Cd的同時(shí)其內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為更復(fù)雜化（Zheng et al.， 2022），這與Berry和Widder（2014）闡述的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)能更好應(yīng)對(duì)環(huán)境變化觀點(diǎn)相一致。在本研究中，Cd積累下艾納香器官葉的模塊性遠(yuǎn)低于莖和根，說(shuō)明葉部?jī)?nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)模塊間聯(lián)系緊密且不同物種分布于不同的模塊，有利于形成特定生態(tài)位相對(duì)穩(wěn)定的共生內(nèi)生菌群落以適應(yīng)Cd積累脅迫。因此，在本研究中，Cd污染可能通過(guò)誘導(dǎo)艾納香建立更加復(fù)雜的內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)和增強(qiáng)物種間的正向關(guān)聯(lián)強(qiáng)度來(lái)應(yīng)對(duì)Cd積累的影響。值得注意的是，本文并未設(shè)置Cd對(duì)艾納香生長(zhǎng)的抑制濃度且研究樣本量有限，存在不足之處。因此，在后續(xù)的研究中將進(jìn)一步改進(jìn)研究方案，使其變得更加深入、合理。

4 結(jié)論

（1）MiSeq測(cè)序表明，Cd積累提高了艾納香各器官內(nèi)生菌α多樣性，各器官α多樣性總體表現(xiàn)為根gt;莖gt;葉。（2）RDA分析表明，艾納香器官內(nèi)生菌群落組成與植株器官Cd含量和根際土壤Cd含量密切相關(guān)，并且大多數(shù)內(nèi)生菌與植株體Cd含量和根際土壤Cd含量呈正相關(guān)。（3）線性判別分析（LEfSe）表明，艾納香根中內(nèi)生菌差異物種較莖和葉豐富。此外，Cd積累顯著增加了根、莖和葉中的分枝桿菌屬、類諾卡氏菌屬、慢性根瘤菌屬、鞘氨醇單細(xì)胞菌屬、乳桿菌屬、纖維單胞菌屬、芽孢桿菌屬、Mesorhizobium、Rhizobacter等屬的耐Cd內(nèi)生菌數(shù)量。（4）共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)分析表明，艾納香根和葉中Cd積累使內(nèi)生菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)變得更加復(fù)雜。器官Cd積累增強(qiáng)了根、莖物種間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系和葉物種間的共生關(guān)系。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）