關(guān)鍵詞：芝麻；耐熱性；SiHsjB-2b基因；基因克隆；定量表達(dá)分析；亞細(xì)胞定位

芝麻（Sesamum indicum L．）起源于非洲熱帶地區(qū)，喜熱，耐干旱耐瘠薄，是重要的優(yōu)質(zhì)油料作物。然而在實(shí)際生產(chǎn)中，現(xiàn)有芝麻品種對(duì)極端高溫環(huán)境較為敏感，在持續(xù)性高溫條件下，落蕾、落花、落蒴嚴(yán)重，最終致使產(chǎn)量大幅度降低。尤其近年來隨著全球氣候不斷變暖，我國黃淮等產(chǎn)區(qū)極端高溫災(zāi)害性天氣頻發(fā)，高溫?zé)岷σ殉蔀橹萍s芝麻生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一。因此，深入開展芝麻耐高溫調(diào)控的分子機(jī)制研究，克隆調(diào)控芝麻耐熱性相關(guān)基因，系統(tǒng)闡明芝麻耐高溫遺傳機(jī)制和開展分子輔助育種，對(duì)推進(jìn)芝麻抗逆遺傳改良和高效生產(chǎn)具有極其重要的意義。

多項(xiàng)研究報(bào)道，熱脅迫誘導(dǎo)作物產(chǎn)生大量熱休克蛋白，并誘導(dǎo)參與次生代謝物合成的相關(guān)基因表達(dá)。熱休克蛋白的產(chǎn)生及次生代謝物合成基因的表達(dá)均受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。截至目前，一些響應(yīng)逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄因子，如HSF、MYB、WRKY、AP2等，已被證實(shí)參與作物響應(yīng)熱脅迫的重要過程。熱激轉(zhuǎn)錄因子（HSFs）是作物耐熱機(jī)制中最重要的一類轉(zhuǎn)錄因子，是熱激信號(hào)傳遞途徑中非常重要的參與者，可誘導(dǎo)熱激蛋白產(chǎn)生，進(jìn)而提升作物對(duì)高溫的耐受性。目前已在水稻、大豆、小麥、玉米、煙草、擬南芥中發(fā)現(xiàn)了數(shù)十個(gè)響應(yīng)高溫脅迫的HSFs。HSFs在結(jié)構(gòu)上具有相似性，主要包含5大結(jié)構(gòu)域，根據(jù)結(jié)構(gòu)域的獨(dú)特性，可將HSFs家族分為A、B、C三類，其中，研究較為清楚的A類HSFs是熱脅迫主要調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)抗逆基因表達(dá)；B類HSFs相關(guān)研究報(bào)道較少，由于缺少C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（CTAD），前期研究認(rèn)為B類HSFs負(fù)調(diào)控作物耐熱性，抑制熱響應(yīng)基因的表達(dá)，但近幾年的研究發(fā)現(xiàn)其屬于熱誘導(dǎo)型，熱脅迫下可誘導(dǎo)耐熱基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而在植物耐熱性防御方面發(fā)揮重要的作用。如對(duì)擬南芥幼苗的熱激和恢復(fù)試驗(yàn)證實(shí)，B類HSFB2b基因是植物獲得耐熱性所必需的：在擬南芥中過表達(dá)鷹嘴豆OsllsfB2b能夠顯著提高其耐熱性。

目前，關(guān)于芝麻HSFs的研究尚未見報(bào)道，對(duì)其家族基因及個(gè)體特性和功能了解甚少。我們前期通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序篩選鑒定出在熱脅迫下高豐度表達(dá)的基因SIN_1015574，編碼B類HsfB-2b蛋白。在此基礎(chǔ)上，本研究從白芝麻材料中克隆獲得SillsfB-2b基因，采用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的氨基酸序列、同源比對(duì)和基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析，同時(shí)分析其在熱脅迫響應(yīng)過程中的組織表達(dá)特異性，并對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位，以期為進(jìn)一步解析SillsfB-2b的生物學(xué)功能及作用機(jī)制提供理論依據(jù)，也為芝麻耐熱性遺傳改良挖掘優(yōu)異基因資源。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用鄭太芝3號(hào)白芝麻品種，種子由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心提供。試驗(yàn)于2022年8月-2023年5月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心人工氣候箱中進(jìn)行。選取籽粒飽滿、大小均一的種子，采用1%次氯酸鈉溶液浸泡15min后，用純凈水反復(fù)沖洗干凈，播種在塑料盆（直徑16cm，高度14cm）中，所用培養(yǎng)基質(zhì)為營養(yǎng)土和珍珠巖（配比為3：1）的混合物，放置于人工氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：光周期為14h光照/10h黑暗，光強(qiáng)為350umol/（m2·s），溫度設(shè)置為30℃，相對(duì)濕度為70%。

1.2熱脅迫處理

待芝麻幼苗長至2對(duì)真葉時(shí)，選取長勢一致的植株，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在41℃高溫條件下進(jìn)行熱脅迫處理，其他培養(yǎng)條件不變。分別在處理0、2、4、6、8d后采集根、莖和葉片樣品，在液氮中速凍后保存于-80 0C超低溫冰箱中，備用。

1.3SiHsfB-2b基因克隆

以芝麻幼苗組織混合樣品為試驗(yàn)材料，采用CTAB法提取基因組DNA;根據(jù)前期研究鑒定到的SIN_1015574基因，通過NCBI網(wǎng)站獲得該基因序列，利用DNAMAN6.0軟件，設(shè)計(jì)特異性克隆引物（F：5'-CCGTAGTCCTTCGGACACCT-3';R：5'-GGCGTTAGTAATGGGAATTGTG-3'），并用高保真酶Pyrobest（TaKaRa，上海）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：Pyrobest DNA Polymerase 0.25uL，10×Pyrobest BufferⅡ5uL，F(xiàn)、R引物各2uL，DNA 1uL， dNTP Mixture（2.5mmol/L）4uL， ddH2035.75uL。反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性10min;98℃10s，59℃ 30s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃完全延伸5min。利用膠回收試劑盒（莊盟，北京）回收目的片段，將回收產(chǎn)物利用pEasy-Blunt Sim-ple Cloning試劑盒（TransGen Biotech）連接T載體后，由生工生物工程（上海）有限公司測序。

1.4 SiHsfB-2b基因生物信息學(xué)分析

通過NCBI網(wǎng)站獲得SiHsfB-2b基因的編碼區(qū)、外顯子和內(nèi)含子序列，利用GSDS軟件（ht-tp：//gsds.gao-lab.org/）分析SiHsfB-2b基因結(jié)構(gòu)；使用ProtParam對(duì)SiHsfB-2b蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，利用SMART軟件預(yù)測其功能結(jié)構(gòu)域：使用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析，利用MEGA5.1軟件構(gòu)建13個(gè)物種的HsfB-2b氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)計(jì)算次數(shù)設(shè)為1000次；使用Phytozome13網(wǎng)站獲得SiHsfB-2b基因起始密碼子ATG上游2000bp區(qū)域堿基序列，利用PlantCARE（http//bioinforrnatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合元件進(jìn)行分析。

1.5RT-qPCR分析

熱脅迫處理不同時(shí)間的芝麻根、莖、葉樣品，用RNArose Reagent Systems試劑盒（上海華舜生物工程公司，上海）提取RNA，然后使用HiScriptⅡlst Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒（Vazyme，南京）合成cDNA第一鏈；SillsfB -26的轉(zhuǎn)錄水平用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法測定，使用AceQ Universal SYBR qPCR MasterMix熒光定量試劑盒（Vazyme，南京）進(jìn)行檢測，使用ABI ONE STEP PCR System進(jìn)行熒光定量分析。設(shè)計(jì)SiHsfB-2b的RT-qPCR特異引物（F：5'-TTCTCCAGTTTTGTTCGTCAAC-3'：R：5'-CTCGCCTCTTCTAAAACAATCG-3'），以及內(nèi)參基因SiTUB的引物（F：5'-GCACACGTGCTTTG-CAGATAAG-3'; R：5'-GCCCTCAAGCTCAAC-CATAACT-3'）。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序見說明書。采用2法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。每組試驗(yàn)至少進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。

1.6SiHsfB-2b的亞細(xì)胞定位分析

采用同源重組的方法，使用植物雙元表達(dá)載體pcambia1302-GFP進(jìn)行SillsfB-2b重組載體構(gòu)建。設(shè)計(jì)組裝引物GFP-HSF-F（caaatcgactctag-aaagcttATGAGCGGCGAAGGCACA）和GFP-HSF-R（gcccttgctcaccatggtaccTTTATCAAGCCTAGGAGG-TTCCTC）。使用上海東洋紡KOD One PCR Mas-ter Mix進(jìn)行SiHsfB-2b的合成；使用Hieff CloneUniversaiⅡOne Step Cloning Kit（翊圣，上海）進(jìn)行同源重組；使用大腸桿菌DH5ca感受態(tài)（擎科，北京）進(jìn)行重組產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化并測序，將測序正確的菌體在-80℃保存。

將含有重組載體35S：SiHsfB-2b-GFP的大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃、220r/min培養(yǎng)至OD600值于1左右，使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（天根，北京）提取質(zhì)粒，最終質(zhì)粒的濃度至少為1ug/uL。將35S：Maker-mCherry質(zhì)粒作為細(xì)胞核標(biāo)記物共轉(zhuǎn)移到玉米原生質(zhì)體中，空的35S：GFP質(zhì)粒作為細(xì)胞內(nèi)靶向?qū)φ?。培養(yǎng)一定時(shí)間后，在共聚焦激光掃描顯微鏡（尼康C2-ER，日本）下觀察轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體。GFP用488nm的激光激發(fā)，并在525nm處進(jìn)行監(jiān)測；mCherry用561nm激光激發(fā)，用580nm長通濾波器監(jiān)測。

2結(jié)果與分析

2.1SiHsfB-2b基因克隆及編碼蛋白理化性質(zhì)分析

以芝麻幼苗根、莖、葉的混合樣提取基因組DNA，根據(jù)公布的芝麻基因組序列，設(shè)計(jì)SiHsfB-26同源克隆引物，擴(kuò)增獲得SiHsfB-2b基因，經(jīng)測序鑒定，擴(kuò)增序列與公布的序列完全一致。SiHs-fB-2b基因序列全長為3090bp（圖1），含有2個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，CDS序列為936bp，編碼311個(gè)氨基酸，編碼蛋白分子量為34.27kDa，等電點(diǎn)為6.08，為酸性蛋白。SiHsfB-2b蛋白序列包含一個(gè)保守的HSF類DNA結(jié)合域（HSF-typeDNA-binding domain）（圖2），可以特異性地結(jié)合熱休克蛋白啟動(dòng)子，但無核定位信號(hào)序列（NLS）。

2.2SiHsfB-2b同源比對(duì)和進(jìn)化樹分析

為明確SiHsfB-2b的親緣關(guān)系．利用SiHsfB-2b蛋白氨基酸序列查詢擬南芥、咖啡和煙草等植物的同源蛋白，獲得與其親緣關(guān)系較近的蛋白，包括擬南芥的HsfB-2b（Q9TOD3）、煙草的HsfB-2b（AOAIS3XXH5）、山豆麻屬的Hsf（AOA2P5CBB9）等13種同源蛋白，利用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），可以看出，與SiHsfB-2b同源關(guān)系最近的是松蒿的HsfB-2b（AOA830CUN7）和獨(dú)腳金的HsfB-2b（AOA5A7PCT3），其次為銹鱗木樨欖的HsfB-2b（AOA8SOQHL8）。為鑒定SiHsfB-2b與其同源蛋白的相似性，將SiHsfB-2b與其同源關(guān)系較近的蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析，結(jié)果如圖4所示，SiHsfB-2b與煙草的HsfB-2b（AOAIS3XXH5）、山豆麻屬的Hsf（AOA2P5CBB9）、獨(dú)腳金的HsfB-2b（AOA5A7PCT3）、咖啡屬的HsfB-2b-like（AOA6P6TPE8）、銹鱗木樨欖的HsfB-2b（AOA8 SOQHL8）和松蒿的HsfB-2b（AOA830CUN7）的相似性系數(shù)分別為56.21%、60.79%、61.49%、60.68%、59.55%、63.23%。

2.3Si%sfB-2b啟動(dòng)子順式作用元件分析

為了探究Si%sfB-2b基因潛在的生物學(xué)功能，對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)13類元件（表1），包括與脅迫、光、激素響應(yīng)相關(guān)的元件以及植物生長發(fā)育相關(guān)元件，其中與脅迫響應(yīng)和激素響應(yīng)相關(guān)的元件各有3類，分別為MYC、ARE、STRE和TGACG-motif、ERE、CGTCA-motif。

2.4熱脅迫下SiHsfB-2b在芝麻不同器官中的表達(dá)模式分析

利用RT-qPCR分析熱脅迫下SiHsfB-2b基因在芝麻不同器官中的表達(dá)模式，結(jié)果如圖5所示。熱脅迫可誘導(dǎo)SiHsfB-26基因在芝麻根、莖和葉中上調(diào)表達(dá)。隨著脅迫時(shí)間的延長，莖和葉中的相對(duì)表達(dá)量整體呈現(xiàn)逐漸增加趨勢，均在脅迫第8天達(dá)到最高值，分別為處理0d的1.66倍和13.88倍：而在根中，該基因的相對(duì)表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在脅迫處理第4天達(dá)到峰值，為處理0d時(shí)的2.23倍。

2.5SiHsfB-2b的亞細(xì)胞定位分析

為了確定SiHsfB-2b的亞細(xì)胞位點(diǎn)，首先利用數(shù)據(jù)庫獲得SiHsfB-2b的CDS序列，設(shè)計(jì)特異性引物，利用高保真酶進(jìn)行全長序列的擴(kuò)增，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)無突變后，利用同源重組的方法構(gòu)建35S：SiHsfB-2b-GFP載體，利用PEG介導(dǎo)的玉米原生質(zhì)體的瞬日寸轉(zhuǎn)化體系和PEG-Ca的轉(zhuǎn)化方法，將重組載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)入玉米原生質(zhì)體中，在黑暗、室溫條件下培養(yǎng)16h后，通過激光共聚焦顯微鏡（尼康C2-ER，日本）進(jìn)行觀察，以偶聯(lián)mCherry熒光蛋白的已知位于細(xì)胞核的擬南芥蛋白IMP4作為對(duì)照（Marker-mCherry）o結(jié)果如圖6所示，SiHs-fB-2b的GFP熒光與Maker-mCherry的位置重合，表明SiHsfB-2b蛋白位于細(xì)胞核中。

3討論

高溫?zé)岷κ墙陙硎澜绺鞯囟喟l(fā)的自然災(zāi)害之一，能夠引起植株萎蔫、落花落果和生殖系統(tǒng)發(fā)育異常等，顯著抑制植物的生長發(fā)育，進(jìn)而影響產(chǎn)量和品質(zhì)。關(guān)于植物耐熱性的分子機(jī)制研究中，轉(zhuǎn)錄因子在基因表達(dá)調(diào)控中扮演重要角色，其中HSFs是植物基因在轉(zhuǎn)錄水平上響應(yīng)熱脅迫的中心調(diào)控因子，在植物熱脅迫應(yīng)激響應(yīng)中起著關(guān)鍵性的作用。

HSFs廣泛存在于所有真核生物中，已發(fā)現(xiàn)在擬南芥、小麥、水稻和大豆等多種植物中存在著大量HSFs。由于A類HSFs存在AHA（轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域）．能在響應(yīng)熱脅迫時(shí)激活下游耐熱相關(guān)基因，目前的研究報(bào)道主要集中于該類HS-Fs，而有關(guān)B類和C類HSFs的研究報(bào)道卻相對(duì)較少。本研究在前期通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)SiHsfB-26受高溫脅迫顯著誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上，從芝麻根、莖和葉的混合樣品中克隆獲得SiHsfB-2b基因，該基因序列長3090bp，CDS序列為936bp，編碼311個(gè)氨基酸殘基。結(jié)構(gòu)分析表明SiHsfB-2b蛋白含有保守的N端DNA結(jié)合域（HSF-type DNA-binding domain），進(jìn)一步通過對(duì)不同物種HsfB-2b蛋白序列同源性比對(duì)和進(jìn)化樹分析顯示，SiHsfB-2b與松蒿屬的HsfB-2b蛋白同源性最高，與獨(dú)腳金、咖啡屬和山豆麻屬等的同源性也比較高，表明不同物種間HsfB-2b蛋白非常相似，推測其在不同物種中可能具有相似的功能。

順勢作用元件是一類能被特定轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別和結(jié)合、參與調(diào)控基因特異性表達(dá)的DNA序列，包含熱激應(yīng)答元件、激素應(yīng)答元件等，在植物非生物脅迫響應(yīng)中扮演著重要角色。本研究通過對(duì)SiHsfB-2b基因啟動(dòng)子上游2000bp區(qū)域的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，該基因啟動(dòng)子區(qū)包含多個(gè)與芝麻逆境脅迫響應(yīng)、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光反應(yīng)以及植物生長發(fā)育識(shí)別有關(guān)的位點(diǎn)，推測該基因可能通過這些作用元件參與芝麻對(duì)熱脅迫信號(hào)的響應(yīng)，在芝麻耐熱過程中發(fā)揮作用。前人研究也表明，B類HSFs轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到茉莉酸和水楊酸調(diào)控，在植物熱脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。

亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，SiHsfB-2b定位在細(xì)胞核上，這與大多數(shù)B類HSFs的定位結(jié)果一致，例如有研究報(bào)道擬南芥的AtHsfB-2b定位于細(xì)胞核中。轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核大多借助核定位信號(hào)，然而本研究對(duì)SiHsfB-2b基因進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)該基因無核定位信號(hào)序列（NLS），因此我們推測SiHsfB-2b可能與具有NLS的蛋白存在互作，輔助其進(jìn)入細(xì)胞核，具體還需后續(xù)進(jìn)一步研究。

早期研究認(rèn)為，在正常生長條件下．B類熱激轉(zhuǎn)錄因子可抑制耐熱基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如抑制HsfA2和HsfA7a的表達(dá)。隨著研究的深入，較多研究發(fā)現(xiàn)B類HSF家族基因受熱等逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，通過與某些性性較弱的A類HSFs協(xié)同作用，參與植株脅迫響應(yīng)及生長發(fā)育過程，如HsfB1和HSFB2b在調(diào)控?cái)M南芥獲得性耐熱方面是必不可少的。前人研究表明，在擬南芥中，37℃高溫能夠顯著誘導(dǎo)HSFB2a和HSFB2b的轉(zhuǎn)錄表達(dá)：過表達(dá)HSFs B2亞家族的基因TaHSF3可明顯提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)42℃極端高溫的耐受性，而且高溫、低溫和干旱等脅迫均可誘導(dǎo)該基因在麥穗等器官中上調(diào)表達(dá)。本研究結(jié)果也表明，高溫脅迫可誘導(dǎo)SiHsfB-2b基因在芝麻根、莖和葉中不同程度地上調(diào)表達(dá)，在葉中表達(dá)量較高，且在高溫脅迫后期被誘導(dǎo)大量表達(dá)。因此，我們推測SiHsfB-2b基因可能是熱激反應(yīng)后期的關(guān)鍵調(diào)控因子，從而維持芝麻持久的耐熱性。

4結(jié)論

芝麻B族熱激轉(zhuǎn)錄因子SiHsfB-2b的基因序列全長為3090bp，CDS序列長936bp，編碼311個(gè)氨基酸殘基，蛋白質(zhì)序列中含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。SiHsfB-2b與松蒿屬的AOA830CUN7蛋白相似性最高，相似性系數(shù)達(dá)63.23%。由啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析結(jié)果推測SillsfB-2b可能通過參與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和光反應(yīng)響應(yīng)熱脅迫。SiHsfB-26在芝麻根、莖、葉中受熱脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，尤其在熱脅迫后期表達(dá)量顯著上升，推測其主要在芝麻熱脅迫響應(yīng)中后期起重要調(diào)控作用。這些結(jié)果可為在分子水平研究芝麻耐熱機(jī)制及開展基因工程育種研究提供理論依據(jù)。