關鍵詞：丹參；SmREM1.2基因：基因克?。簧镄畔W分析；表達分析；亞細胞定位

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）是唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)大宗類中藥材之一，臨床上廣泛應用于心腦血管疾病等的治療，經(jīng)濟價值高，市場需求大，在我國栽培廣泛。隨著全球變暖和環(huán)境污染等問題的加重，丹參生長發(fā)育受到多種逆境脅迫（干旱脅迫、鹽脅迫等）的影響，阻礙了丹參種植業(yè)的發(fā)展。因此，研究丹參應對逆境脅迫的調(diào)控機制，開發(fā)耐逆基因資源，對于培育丹參耐逆品種至關重要。

Remorin蛋白是一類與質(zhì)膜脂筏相連的蛋白，介導脂筏微區(qū)的形成：它分布廣泛，在苔蘚植物、裸子植物及被子植物中都有存在。Remorin蛋白N末端結構差異大，為可變結構域，含有介導Remorin蛋白與多種蛋白互作的保守的脯氨酸富集區(qū)域，決定了Remorin蛋白的功能多樣性：C末端包含疏水的coiled - coil區(qū)域，結構高度保守，被認為是Remorin蛋白的標志性區(qū)域。Re-morln蛋白可以聚合形成寡聚體，組裝成絲狀纖維結構發(fā)揮功能。Remorin蛋白在細胞內(nèi)存在多樣的翻譯后修飾作用，其C末端可以發(fā)生棕櫚酰基化、豆蔻?；弱；揎椬饔?，以調(diào)節(jié)其膜定位：還可以發(fā)生磷酸化修飾，磷酸化位點分布在N端可變區(qū)，研究表明CDPK3磷酸化Re-morln可影響其促進質(zhì)膜微區(qū)組裝的功能，調(diào)節(jié)病菌等在細胞間的傳遞與侵染。

越來越多的研究表明Remorin基因的表達受激素、逆境脅迫等多種信號刺激的誘導，參與植物免疫應答、生長發(fā)育調(diào)控及逆境響應等多種信號轉導通路，具有廣泛的生物學功能。在生物脅迫方面，Remorin蛋白參與植物免疫應答過程，響應水楊酸的信號刺激，介導調(diào)節(jié)質(zhì)膜脂筏的組裝，調(diào)控胞間連絲的開閉，通過降低胞間連絲通透性來阻止病毒在宿主植物細胞間的擴散；也有研究表明，當細胞受到病毒入侵時，體內(nèi)的Re-morln蛋白可以加快細胞自噬的進程，進而提高生物體的抗病性：同時，Remorin蛋白可以通過組裝聚集影響微絲結合蛋白formin的聚合，從而改變微絲重排，調(diào)節(jié)植物的免疫應答。在非生物脅迫方面．Badawi等發(fā)現(xiàn)小麥的耐寒性與Re-morln基因的高表達具有相關性，多個耐寒小麥品種中Remorin基因表達明顯升高；Zhang等發(fā)現(xiàn)Remorin蛋白可顯著提高胡楊質(zhì)膜囊泡的H+-ATP水解酶活性和H+轉運活性，進而顯著提高了植株的耐鹽性：Yue等發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過表達谷子的SiREM6基因可以促進鹽脅迫下種子萌發(fā)率的升高，增強植物的耐鹽能力。

目前關于丹參中Remorin蛋白功能的研究還較少。本研究基于丹參轉錄組及基因組數(shù)據(jù)庫信息，克隆丹參SmREM1.2基因，并對其進行生物信息學分析，明確SmREM1.2蛋白的理化特性，構建GFP標簽融合表達載體，分析其亞細胞定位，并檢測鹽脅迫處理下SmREM1.2的表達水平，以探討SmREM1.2的功能，為Remorin蛋白在植物中的應用開拓新的思路，并為丹參耐逆調(diào)控機制的深入研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料培養(yǎng)及處理

本研究使用的丹參材料為紫花丹參，種子由中國中醫(yī)科學院中藥資源中心贈與，保存于山東師范大學生命科學學院趙雙雙實驗室。2021年1月將丹參種子經(jīng)由次氯酸鈉消毒液（NaClO濃度為20%，TritonX-100濃度為0.1%）滅菌后，置于濕潤的濾紙上，待萌發(fā)后轉移至培養(yǎng)土（營養(yǎng)土和蛭石按體積比1：1配制）中，在人工氣候室（溫度23℃，濕度70%，光照16h/黑暗8h）培養(yǎng)，正常生長2個月后，選取長勢相同的丹參幼苗，使用250mmol/L NaCl采用澆灌法進行鹽脅迫處理，分別在處理0、3、6、12h取樣，液氮冷凍后于-80℃保存。

本研究所用煙草為本生煙（Nicotiana bentha-miana），種子由山東師范大學生命科學學院趙雙雙實驗室保存。2021年8月，將煙草種子經(jīng)由次氯酸鈉消毒液滅菌后，于MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，生長10天后，將煙草幼苗轉移至培養(yǎng)土（營養(yǎng)土和蛭石的體積比為1：1）中，于人工氣候室（溫度23℃，濕度70%，光照16h/黑暗8h）培養(yǎng)4～6周。

1.2總RNA的提取及cDNA合成

使用RNA提取試劑盒（購自諾唯贊公司）提取丹參樣品總RNA．用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用超微量紫外分光光度計NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer（Thermo Scientific）對所提取的總RNA進行定量分析，然后使用反轉錄試劑盒（購自全式金公司）進行反轉錄，獲得cDNA，存于-20℃。

1.3SmREM1.2基因克隆

利用擬南芥基因組網(wǎng)站（https：//www. arabi-dopsis.org/）下載擬南芥REM家族成員AtREM1.2的蛋白序列，以其為探針，在丹參基因組數(shù)據(jù)庫中比對，鑒定得到SmREM1.2基因（SMil_00007417）的序列信息。用Clone Manager軟件設計該基因特異性引物，上游引物序列為5'-GCGTCGACATGGCGGAGGAGCAAGTGAAA-3'．下游引物序列為5'-GCGGTACCTCAGAAACAGC-CAAGTAGTTTCTTT-3'．并由生工生物工程（上海）有限公司合成。以丹參cDNA為模板運用Toyobo公司KOD高保真DNA聚合酶進行PCR擴增。PCR反應條件：98℃預變性2min;98℃變性30s，57℃退火30s，68℃延伸30s，35個循環(huán)；68℃終延伸5min。用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，并切膠回收目的產(chǎn)物，使用諾唯贊DNA回收試劑盒對膠回收產(chǎn)物進行純化。用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sal I對PCR產(chǎn)物進行酶切，并連接至克隆載體pCAMBIA1300-GFP，轉化至大腸桿菌DH5ca感受態(tài)細胞中，挑取單克隆菌落，進行PCR檢測，將陽性克隆送至北京擎科生物科技有限公司青島分公司測序分析。

1.4生物信息學分析

運用在線數(shù)據(jù)庫ExPASy（https：//web. expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）預測SmREM1.2蛋白的等電點、分子質(zhì)量等理化特性；運用ProtScale（http：//web. expasy. org/protscale/）進行蛋白親疏水性預測；運用TMHMM Server 2.0（ http：//www.cbs.dtu.dk/servlces/TMHMM/）對SmREM1.2蛋白進行跨膜結構域預測；運用SignalP 6.0 Server（ht-tps： //services.healthtech.dtu.dk/servlces/SignalP-6.0/）對SmREM1.2蛋白進行信號肽序列預測：運用SOPMA（http：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl？ page=npsa_sopma.html）在線數(shù)據(jù)庫進行蛋白二級結構預測；運用CDD（http：//www.ncbi．nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）對SmREM1.2蛋白進行保守結構域分析。

運用TAIR數(shù)據(jù)庫（http：//www. Arabidopsis.org）檢索擬南芥Remorin家族蛋白氨基酸序列信息，使用Clone Manager軟件將SmREM1.2與4個擬南芥REM成員進行氨基酸多重序列比對分析。

運用NCBI數(shù)據(jù)庫，根據(jù)SmREM1.2蛋白的氨基酸序列，通過Blast分析（http：//blast. ncbi.nlm.nihgov/Blast.cgi）篩選其他植物中SmREM1.2的同源序列，運用MEGA11.0軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）將SmREM1.2與擬南芥、玉米、水稻等的REM家族成員構建進化樹，將booststrap設置為1000。

1.5亞細胞定位分析

通過液氮一熱激法分別將1.3中獲得的重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-SmREM/.2-GFP及質(zhì)膜標記pCAMBIA1300-AtCBLl-mCherry轉化至農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)中，PCR篩選鑒定陽性菌落，擴大培養(yǎng)，收集菌體，于滲透液[10mmol/L MES（pH 5.7），10mmol/L MgCl2，100umol/L乙酰丁香酮]中共孵育2h；運用針管將農(nóng)桿菌注射進煙草葉片細胞中，于人工氣候室培養(yǎng)72h，取共表達pCAMBIA1300-SmREM/.2-GFP及質(zhì)膜標記pCAMBIA1300-AtCB//-mCherry的煙草葉片，在Leica Sp8共聚焦顯微鏡下進行觀察，用波長488nm和561nm的激發(fā)光檢測GFP和mCherry通道熒光信號。

1.6基因表達分析

采用實時熒光定量PCR法進行測定。使用Primer Premier 5.0軟件對克隆的SmREMl.2基因CDS序列設計特異引物（SmREMl.2 F：5'-AG-CAAGTGAAAACGGTCGAG-3';SmREMl.2 R：5'-GGAGGGCTCCGTAAACAGAG-3'）。選用TaKa-Ra生物技術有限公司的熒光定量試劑盒（SYBRGreen）進行實驗。反應體系：2xSYBR Green ProTaq Premix 5.0uL，cDNA 2.0uL，上、下游引物各0.2uL，用ddH20補足至10.0uL。運行程序：95℃預變性2min；95℃變性Ss，60℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環(huán)。熔解曲線測定程序設置為95℃變性5s．60℃退火1min．95℃持續(xù)5s，50℃保溫30s。實驗收集的數(shù)據(jù)以丹參Actin基因為內(nèi)參基因進行均一化處理（引物為SmActinF：5'-GCCCTCGACTATGAACAAGAGC-3'：SmAc-tin R：5'-GATGGAGTTGTAGGTGGTTTCGTG-3'）。每個基因3次重復，依據(jù)2-△△法計算SmREM1.2的相對表達量。

2結果與分析

2.1SmREM1.2基因的克隆與鑒定

擬南芥包含16個Remorin蛋白家族成員，分為6個亞家族（REMl-REM6），其中REMI在植物體內(nèi)表達豐度高，分布廣泛，功能多樣，調(diào)節(jié)下胚軸及根的伸長，調(diào)控植物對病原菌的抵御能力。本研究以擬南芥AtREMl.2蛋白序列為探針，依據(jù)丹參基因組數(shù)據(jù)庫，鑒定獲得與AtREM1.2同源性較高的SmREM1.2序列，以丹參cDNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增，克隆到目的條帶（圖1），測序得知SmREM1.2基因CDS序列全長為585 bp，編碼194個氨基酸。

2.2SmREM1.2的生物信息學分析

2.2.1SmREM1.2蛋白理化性質(zhì)及親疏水性分析

ProtParam預測結果顯示，SmREM1.2蛋白的分子式為C944 H1563 N255 0295 S5，分子量為21365.63Da，脂肪系數(shù)為75.57，理論等電點為6.69，不穩(wěn)定指數(shù)達59.75，為不穩(wěn)定的弱酸性蛋白。SmREM1.2蛋白的194個氨基酸中包含酸性氨基酸殘基（Asp+Glu）及堿性氨基酸殘基（Arg+Lys）各37個。利用ProtScale預測SmREM1.2蛋白的親／疏水性，結果（圖2）顯示，蛋白序列中第38位脯氨酸（Pro）處具有親水性最大值，達1.553，第103位賴氨酸（Lys）處具有親水性最小值（-1.254），親水性平均值為-0.818，表明該蛋白主要表現(xiàn)親水性。

2.2.2SmREM1.2蛋白跨膜結構及信號肽預測利用TMHMM對SmREM1.2的跨膜區(qū)進行預測，經(jīng)分析SmREM1.2蛋白的氨基酸序列不存在跨膜結構。

運用SignalP 6.0對SmREM1.2蛋白進行信號肽序列預測，未預測到信號肽裂解位點，表明SmREMl.2蛋白不具有信號肽，該蛋白屬于非分泌型蛋白。

2.2.3SmREM1.2蛋白保守結構域預測

利用NCBI的CDD（Conserved

Domain

Database）數(shù)據(jù)庫分析SmREM1.2蛋白序列中的保守結構域，結果（圖3）顯示，該蛋白中存在Remorin家族保守的Remorin_N和Remorin_C結構域，表明其屬于Re-monn基因家族。

2.2.4SmREM1.2蛋白二級結構SOPMA預測分析結果（圖4）顯示，SmREM1.2蛋白的二級結構中存在由116個氨基酸組成的a螺旋、由59個氨基酸組成的無規(guī)則卷曲、由14個氨基酸組成的延伸鏈、由5個氨基酸組成的I3轉角，分別占比59.79%、30.41%、7.22%、2.58%。

2.2.5SmREM1.2蛋白的同源性分析

將SmREM1.2蛋白序列與AtREM1亞家族的4條蛋白序列進行多重比對，結果（圖5）發(fā)現(xiàn)，SmREM1.2與擬南芥AtREM1亞家族蛋白的同源性均達到90%，且C端都具有高度保守的coiled-coil模體，屬于典型的REM蛋白。

2.2.6SmREM1.2的系統(tǒng)進化分析

以SmREM1.2蛋白序列為目的序列，通過NCBI數(shù)據(jù)庫檢索鑒定出9個不同物種的同源序列，進行比對分析并構建進化樹，結果（圖6）發(fā)現(xiàn)，SmREM1.2與同屬物種芡歐鼠尾草的REM蛋白同源性較高，聚類關系最近。

2.3SmREM1.2的亞細胞定位分析

蛋白亞細胞定位分析可以反映目的基因編碼的蛋白在細胞內(nèi)的定位及空間分布，而由基因的空間分布可知基因發(fā)揮功能的場所，從而為基因功能的研究提供線索。為了進一步分析SmREM1.2在細胞內(nèi)的生物學功能，本研究構建了pCAMBIA1300-SmREM1.2-GFP重組載體（以下簡稱SmREM1.2-CFP），并以AtCBL1-mCherry作細胞質(zhì)膜標記，將其轉化進農(nóng)桿菌中，用農(nóng)桿菌注射煙草葉片，使其在煙草葉片細胞中表達，取SmREM1.2-GFP和AtCBL1-mCherry共表達的煙草葉片，運用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，對SmREM1.2進行亞細胞定位分析，結果（圖7）顯不SmREM1.2-GFP與質(zhì)膜定位的AtCBL1蛋白具有明顯共定位，表明SmREM1.2定位于細胞膜上，是質(zhì)膜結構相關蛋白。

2.4SmREM1.2基因在鹽脅迫下的表達分析

已有報道表明REM蛋白是植物逆境脅迫應答相關蛋白，參與植物耐鹽脅迫調(diào)控過程。為了探索SmREM1.2對鹽脅迫的響應情況，本研究對丹參幼苗進行鹽脅迫（250 mmol/L NaCl）處理，測定處理0、3、6、12h的SmREM1.2相對表達量，結果（圖8）顯示，鹽脅迫使SmREM1.2基因顯著上調(diào)表達，處理6h的相對表達量最高，約為0h的5.1倍，之后該基因的表達量又顯著下降。

3討論與結論

Remorin蛋白是陸生植物特有的蛋白之一，可與細胞質(zhì)膜上的脂筏相連，調(diào)控脂筏微區(qū)的形成，改變膜的流動性，影響胼胝體的積累，控制胞間連絲的關閉，調(diào)節(jié)植物對病原菌侵染的抵御能力及對逆境脅迫的響應過程。Remorin蛋白通常以聚集形式發(fā)揮功能，可以組裝成纖維狀聚合體，但這種聚集會影響Remorin蛋白被招募上膜的過程。Remorin蛋白包含N端可變區(qū)、中央盤繞（coiled-coil，CC）結構域及C端的膜錨定區(qū)（C-terminal anchor，CA）。其中，CC結構域參與Remorin蛋白多聚體的組裝．CA影響其錨定上膜的過程。本研究通過氨基酸序列比對分析，確定SmREMI.2包含Remorin蛋白家族特征性CC結構域，初步證明了SmREM1.2屬于Remorin蛋白家族成員，推測其也具備形成多聚體的理化特性。

系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，SmREM1.2蛋白與多種植物Remorin蛋白的同源性都較高，說明Remorin蛋白進化較穩(wěn)定，在多物種間具有普遍功能，對于植物細胞內(nèi)生命活動具有重要意義。進一步的生物信息學預測發(fā)現(xiàn)SmREM1.2蛋白是親水性蛋白，無明顯的信號肽切割點，不是分泌蛋白，這與已報道的Remorin蛋白的性質(zhì)相似。二級結構預測表明SmREM1.2蛋白存在大量的a螺旋和無規(guī)則卷曲，僅含有極少量的延伸鏈及轉角，這間接證實了SmREM1.2蛋白包含CC結構域，是Remorin蛋白家族的成員。跨膜結構域預測表明Remorin蛋白不包含明顯的跨膜結構，不是典型的跨膜蛋白。本研究將SmREM1.2克隆到GFP融合表達載體上，并進行亞細胞定位分析，發(fā)現(xiàn)其定位于細胞膜上，這為探索該蛋白的細胞膜功能提供了依據(jù)。

研究表明，Remorin蛋白參與植物對逆境脅迫的應答過程，可增強植物對干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫等的抵御能力。本研究利用qRT-PCR法分析發(fā)現(xiàn)SrnREM1.2基因受到鹽脅迫的誘導顯著上調(diào)表達，表明其可能參與調(diào)控丹參對鹽脅迫的應答。

本研究結果為探索SmREM1.2在丹參耐逆調(diào)控上的功能奠定了理論基礎，也為研究丹參中Remorin蛋白的作用模式提供了新思路。