摘要： 為提高抗生素在病灶感染處的滲透與富集能力，減少單一抗生素在臨床上的使用劑量，進(jìn)一步降低細(xì)菌耐藥性的風(fēng)險，采用化學(xué)偶聯(lián)法合成聚乳酸羥基乙酸-透明質(zhì)酸的兩親性嵌段共聚物用于封裝抗生素。該共聚物在水中可自組裝為內(nèi)部疏水、外部親水的膠束（Micelles， MS），以透析法將疏水藥物環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin， CIP）和利福平（Rifampicin， RFP）封裝在MS中，構(gòu)建了CIP@MS的單一載藥膠束及CIP/RFP@MS的雙載藥膠束；對合成物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、形貌、臨界膠束濃度以及載藥率進(jìn)行測試與表征，將MS、CIP@MS、CIP/RFP@MS與金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， S.aureus）和大腸埃希菌（Escherichia coli， E.coli）共培養(yǎng)以探索載藥膠束的體外抗菌作用，與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)以評估載藥膠束的體外細(xì)胞毒性。結(jié)果表明：聚乳酸羥基乙酸-透明質(zhì)酸聚合物在水中可自組裝約為142 nm大小的球形膠束，載藥后粒徑增大約為194 nm；CIP在CIP@MS中的載藥率為1.42%，CIP和RFP在CIP/RFP@MS中的載藥率分別為1.09%和1.41%；CIP@MS對S.aureus和E.coli的抗菌率分別為27.7%和99.9%，CIP/RFP@MS對S.aureus和E.coli的抗菌率分別達(dá)到85.4%和100.0%。該研究為雙載藥膠束的制備方法及抗菌方面的應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 聚乳酸羥基乙酸；透明質(zhì)酸；膠束；環(huán)丙沙星；利福平；抗菌

中圖分類號： TB324文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號： 1673-3851 （2024）09-0579-09

引文格式：何清玲，陳柳婷，孫澤月，等. 負(fù)載環(huán)丙沙星及利福平的聚合物膠束制備及其抗菌性能分析［J］. 浙江理工大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)），2024，51（5）：579-587.

Reference Format： HE Qingling， CHEN Liuting， SUN Zeyue， et al. Preparation and antibacterial activity analysis of ciprofloxacin and rifampicin-loaded polymer micelles［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2024，51（5）：579-587.Preparation and antibacterial activity analysis of ciprofloxacin

and rifampicin-loaded polymer micelles

HE Qingling CHEN Liuting SUN Zeyue LIU Fei LU Jiaju KONG Xiangdong

（1.School of Materials Science amp; Engineering， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China;

2.Zhejiang Hospital of lntegrated Traditional Chinese and Western Medicine， Hangzhou 310003， China）Abstract：" To improve the penetration and accumulation ability of antibiotics in treating infected lesions， reduce the clinical while minimizing dosage of single antibiotics， and further lowerreducing the risk of bacterial resistance， chemically conjugatedan amphiphilic block copolymer ofcomprising poly（lactic acid-co-glycolic acid） and hyaluronic acid was synthesized via chemical conjugation for the encapsulation of antibiotics. This copolymer can self-assemble into internal hydrophobic and external hydrophilic micellesforms self-assembling micelles （MS） in water， featuring a hydrophobic core and a hydrophobic shell. Hydrophobic drugs， such as ciprofloxacin （CIP） and rifampicin （RFP） were encapsulated in MSwithin these micelles by using dialysis method， resulting inconstructing ciprofloxacin-loaded micelles （CIP@MS） and ciprofloxacin/rifampicin-loaded micelles （CIP/RFP@MS）. The synthesized materials were tested and characterized for structure， morphology， critical micelle concentration， and drug loading efficiency of the . In vitro studies involved co-culturing MS， CIP@MS， and CIP/RFP@MS were co-cultured with Staphylococcus aureus （S.aureus） and Escherichia coli （E.coli） to explore theaccess antibacterial effects， in as well as evaluating cytotoxicity vitro， and co-cultured with human umbilical vein endothelial cells to evaluate the cytotoxicity in vitro. The results showed that the copolymer of poly（lactic-co-glycolic acid）-hyaluronic acid could self-assemble into uniform spherical micelles in water with a size of aboutapproximately 142 nm， and its particle size increasedincreasing to 194 nm post-drugapproximately after drug loading. The drug loading efficiency of CIP in CIP@MS was 1.42%， and the drug loading efficiency of CIP and RFPwhile for in CIP/RFP@MS， it was 1.09% for CIP and 1.41% for RFP， respectively. The antibacterial rates of CIP@MS against S.aureus and E.coli were 27.7% and 99.9%， respectively， while the antibacterial rates offor CIP/RFP@MS， rates against S.aureus and E.coli reached 85.4% and 100.0%， respectively. This study providesestablishes an experimental basis and theoretical basis for the preparation method of and the application of dual drug-loaded micelles in antibacterial aspects in some degree.

Key words： poly（d，l-lactide-coglycolide）; hyaluronic acid; micelles; ciprofloxacin; rifampicin; antibacterial

0引言

環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin， CIP）是一種喹諾酮類廣譜抗生素，通過干擾阻止DNA合成和復(fù)制來抑制細(xì)菌生長，廣泛用于治療各種感染和細(xì)菌源性疾?。?］。但CIP的溶解度和滲透性較差，靜脈注射單一高劑量的CIP可能會引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)并誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性［2-5］。聯(lián)合使用具有協(xié)同效應(yīng)的2種或2種以上抗生素可以覆蓋更為廣泛的抗菌譜，顯著提高抗生素的抑菌作用，從而降低使用高劑量抗生素產(chǎn)生的不良反應(yīng)和耐藥性風(fēng)險［6-9］。利福平（Rifampicin， RFP）是一種聚酮類藥物，通過抑制細(xì)菌RNA的合成達(dá)到抗菌作用，在抗結(jié)核菌一線用藥中占有重要地位［8］。喹諾酮類藥物聯(lián)合RFP可顯著提高抗菌效果，降低細(xì)菌耐藥風(fēng)險［10-12］。然而，因血液供應(yīng)不足以及抗生素在感染部位的積累不足等原因，CIP聯(lián)合RFP的抗菌療效仍然有限［12-13］。

近年來，聚合物膠束因其具有被動菌靶向、副作用小、藥溶性增強(qiáng)和藥代動力學(xué)改善等突出優(yōu)勢，在抗菌材料領(lǐng)域得到了廣泛的研究與開發(fā)［14］。載藥膠束的納米尺寸性質(zhì)有利于其在炎癥部位的內(nèi)皮外泄及在病灶感染處有效積累，并且納米載體具有較高的表面積，能夠解決藥物因溶解度低而遇到的遞送障礙問題［15-16］。另外，膠束可以保護(hù)藥物免受酶的降解，增加半衰期和穩(wěn)定性，最大限度地減少藥物副作用，將抗生素藥物封裝到載體中可以增強(qiáng)抗生素的生物利用度和有效性［17-18］。Chen等［19］制備了負(fù)載槲皮素和RFP的聚（ε-己內(nèi)酯）-單甲氧基聚乙二醇膠束（QRMs），評價了其對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)QRMs可以有效地穿透和去除耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的生物膜，加速細(xì)菌中活性氧的積累以達(dá)到持續(xù)的抗菌效果。

聚乳酸羥基乙酸（Poly （d，l-lactide-coglycolide）， PLGA）是一種人工合成的可生物降解共聚物，已被批準(zhǔn)用于藥物遞送；此外，透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid， HA）是一種親水性的天然多糖，具有無毒、無免疫原性和可生物降解等優(yōu)點(diǎn)［20］。在各種藥物遞送系統(tǒng)中，基于PLGA的藥物載體已被深入研究，例如：Gheffar等［21］使用納米沉淀法合成負(fù)載CIP的PLGA聚合物基納米粒子用于金黃色葡萄球菌的抗菌活性研究；Wu等［22］使用乳化溶劑蒸發(fā)法將親水性HA與含有多黏菌素B（PMB）的PLGA結(jié)合形成HA@PLGA-PMB納米粒子用于霧化治療肺部感染；Hlaing等［23］將姜黃素封裝于HA偶聯(lián)的PLGA納米顆粒中用于治療潰瘍性結(jié)腸炎。盡管將HA和PLGA結(jié)合的納米粒子作為抗菌劑的藥物遞送系統(tǒng)已進(jìn)行了大量研究，但將它們結(jié)合形成膠束并負(fù)載雙抗生素抗菌的研究報道較少。

本文利用具有良好生物相容性的材料PLGA和HA，通過還原胺化法將HA連接于PLGA上合成PLGA-b-HA的兩親性嵌段共聚物，PLGA-b-HA在水中可自組裝為內(nèi)部疏水、外部親水的膠束（Micelles， MS），并以透析法將疏水藥物CIP及RFP封裝在MS中，構(gòu)建了CIP@MS的單一載藥膠束及CIP/RFP@MS的雙載藥膠束，評價了膠束的形態(tài)、粒徑分布、載藥率、包封率、抗菌性能及其對細(xì)胞的毒性，并探討了單一載藥及雙載藥膠束的抗菌性能，為雙載藥膠束的制備方法及抗菌方面的應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1實(shí)驗部分

1.1實(shí)驗材料及儀器實(shí)驗材料：PLGA購自上海源葉生物科技有限公司；HA（分子量7 kDa）、氰基硼氫化鈉和N-N二異丙基乙胺均購自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；丁二胺購自上海麥克林生化科技股份有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-（3二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCL）、RFP和CIP均購自阿拉丁試劑有限公司；透析袋（截留分子量8 kDa）購自上海億欣生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， S.aureus）來源于CICC庫10384菌株，大腸埃希菌（Escherichia coli， E.coli）來源于CICC庫10389菌株。

實(shí)驗儀器：傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolte 5700， 美國）；核磁共振波譜儀（Avance AV 400MHz， 瑞士）；動態(tài)光散射儀（Zetasizer Nano ZS， 英國）；透射電子顯微鏡（JEM-2100， 日本）；掃描電子顯微鏡（ZEISS Gemini 500， 德國）；紫外-可見光分光光度計（P7 Double Beam Spectrophotometer， 上海美譜達(dá)儀器有限公司）；熒光分光光度計（Fluoromax， 美國）。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1PLGA-b-HA嵌段共聚物的制備PLGA-b-HA制備方法參考文獻(xiàn)［24］，具體方法如下：

a）HA-NH2合成。取2.0 g HA溶解于60 mL乙酸鹽緩沖液（pH值為5.6），在磁力攪拌下將2 mL的丁二胺添加到HA溶液中，在50 ℃下攪拌24 h形成亞胺，并加入1.2 g氰基硼氫化鈉攪拌72 h；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)溶液裝入透析袋中，在去離子水中透析3 d，每6 h更換一次透析液，透析結(jié)束后將袋內(nèi)溶液凍干待用。

b）PLGA-NHS合成。取1.0 g的PLGA溶解于10 mL的二氯甲烷中，分別加入48 mg的NHS和80 mg的EDC·HCL，在室溫下密封并磁力攪拌24 h，反應(yīng)結(jié)束后用冰冷的乙醚析出沉淀產(chǎn)物，再用冰冷的乙醚/甲醇（50/50， v/v）混合液洗滌3次以去除過量的NHS和EDC·HCL，最后將純化后的產(chǎn)物真空干燥待用。

c）PLGA-b-HA合成。取0.5 g的PLGA-NHS和0.5 g的HA-NH2，分散到20 mL的DMSO中，再加入20 μL的N，N-二異丙基乙胺，在50 ℃下磁力攪拌48 h。反應(yīng)結(jié)束后將該溶液裝入透析袋中，在去離子水中透析3 d以純化產(chǎn)物，平均每6 h更換一次透析液，透析結(jié)束后將袋內(nèi)溶液凍干待用。

1.2.2MS制備將10 mg PLGA-b-HA溶解于1 mL的DMSO中攪拌15 min，緩慢滴加3 mL的去離子水，再攪拌15 min后，將溶液裝入透析袋在去離子水中透析6 h除去多余的有機(jī)溶劑，最終加去離子水定容至5 mL，獲得質(zhì)量濃度為2 mg/mL的MS。

1.2.3CIP@MS制備將CIP溶于HAc中配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的CIP溶液，在燒杯中加入10 mg的PLGA-b-HA和1.0 mL的DMSO，磁力攪拌下緩慢滴加0.5 mL的CIP溶液和1.0 mL的去離子水于燒杯中繼續(xù)攪拌15 min，轉(zhuǎn)入透析袋中透析6 h制備的膠束過0.45 μm的濾膜除去未包載的CIP，然后加去離子水定容至5.0 mL得到質(zhì)量濃度為2 mg/mL的CIP@MS。凍干后備用

1.2.4CIP/RFP@MS制備將CIP和RFP分別溶于HAc和DMSO中配成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的CIP和RFP溶液，各取0.5 mL得到1.0 mL的混合溶液。在燒杯中加入10 mg的PLGA-b-HA和1.0 mL的DMSO，磁力攪拌下緩慢滴加1.0 mL的混合溶液和1.0 mL的去離子水于燒杯中繼續(xù)攪拌15 min，后續(xù)操作與CIP@MS載藥膠束的制備方法相一致，PLGA-b-HA載藥示意圖如圖1所示。

1.3測試與表征

1.3.1核磁共振氫譜測試將HA溶于DMSO-d₆，PLGA-b-HA分別溶于DMSO-d₆和D₂O中，使用核磁共振波譜儀進(jìn)行核磁共振氫譜（1H Nuclear magnetic resonance spectra，1H NMR）測試。

1.3.2傅里葉變換紅外光譜測試使用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜（Attenuated total internal reflectance fourier transform infrared spectroscopy， ATR-FTIR）儀對HA-NH2、PLGA-NHS、PLGA-b-HA材料進(jìn)行測試，設(shè)置波長范圍為4000～500 cm-1。

1.3.3臨界膠束濃度測試采用芘熒光探針法測定PLGA-b-HA嵌段共聚物的臨界膠束濃度（Critical micelle concentration， CMC），熒光分光光度計的激發(fā)光譜測定條件為：固定發(fā)射波長390 nm，檢測激發(fā)波長300～360 nm。將聚合物質(zhì)量濃度分別調(diào)制為：5×10^-5、1×10^-4、5×10^-4、1×10^-3、2×10^-3、5×10^-3、8×10^-3、1×10^-2、2×10^-2、5×10^-2 mg/mL和10×10^-2 mg/mL進(jìn)行測試。以芘在336 nm和334 nm處的熒光強(qiáng)度比值（I336/I334）對LogC作圖，突變點(diǎn)的計算采用Origin進(jìn)行分段線性模擬，2條直線的交點(diǎn)處即為PLGA-b-HA的CMC。

1.3.4粒徑及電位測試使用動態(tài)光散射儀（Dynamic light scattering， DLS）測定膠束載藥前后的粒徑及電位變化。

1.3.5透射電子顯微鏡表征使用透射電子顯微鏡（Transmission electron microscope， TEM）觀察經(jīng)過磷鎢酸負(fù)染色液處理后的膠束微觀形貌。

1.3.6紫外-可見光分光光度計測試分別配制質(zhì)量濃度為10 μg/mL的CIP溶液和100 μg/mL的RFP溶液，梯度稀釋后分別測量CIP在波長為280 nm處的吸光度和RFP在344 nm處的吸光度，繪制CIP和RFP的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。將凍干后的PLGA-b-HA嵌段共聚物、負(fù)載CIP的PLGA-b-HA嵌段共聚物以及負(fù)載CIP/RFP的PLGA-b-HA嵌段共聚物溶于DMSO中進(jìn)行紫外吸收光譜曲線測量，參照CIP和RFP的標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)式（1）和式（2）計算包封率和載藥率：

X/%=m₁/m₂×100 （1）

其中：X為膠束中藥物的包封率，%；m1為載入膠束b的藥物質(zhì)量，g；m2為投入的藥物總質(zhì)量，g。

Y/%=m₁/m×100 （2）

其中：Y為膠束中藥物的載藥率，%；m1為載入膠束的藥物質(zhì)量，g；m為載入膠束的藥物質(zhì)量與膠束載體質(zhì)量之和，g。

1.3.7抗菌性能測試抗菌測試方法參考文獻(xiàn)［10］和文獻(xiàn)［25］，將S.aureus和E.coli分別接種于Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)液中，置于37 ℃震蕩培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)過夜，用紫外-可見光分光光度計調(diào)整菌液吸光度（OD600）為0.1，并用LB稀釋至1×10⁶個/mL的濃度備用。取100 μL質(zhì)量濃度均為20 μg/mL的MS、CIP@MS和CIP/RFP@MS分別與100 μL的S.aureus和E.coli于96孔板中共培養(yǎng)4 h后進(jìn)行SEM表征；繼續(xù)共培養(yǎng)24 h后，分別稀釋105和104倍進(jìn)行平板涂布測試，將細(xì)菌與磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer saline， PBS）共培養(yǎng)設(shè)置為空白對照組，最終使用圖像處理軟件（ImageJ， NIH， USA）進(jìn)行平板菌落計數(shù)，并計算抗菌率。

1.3.8細(xì)胞毒性測試以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cell， HUVEC）為細(xì)胞模型，將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞以104個/孔的密度接種于96孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁；將不同質(zhì)量濃度的MS、CIP@MS和CIP/RFP@MS與HUVEC共培養(yǎng)24 h，使用MTT法評估材料對細(xì)胞的毒性。

2結(jié)果與討論

2.1PLGA-b-HA嵌段共聚物的表征與分析圖2（a）為HA溶于DMSO-d₆、PLGA-b-HA分別溶于DMSO-d₆和D₂O中的1H NMR圖。圖2（a）顯示：圖譜中0為DMSO-d₆溶劑峰，1～3為PLGA中的特征峰，4和5為HA的特征峰，6為D₂O溶劑峰；當(dāng)PLGA-b-HA溶解在DMSO-d₆中時，同時出現(xiàn)PLGA和HA的特征峰，而當(dāng)其溶解到D₂O中時PLGA的特征峰消失，出現(xiàn)HA的特征峰，這是由于PLGA-b-HA在重水中形成了核-殼結(jié)構(gòu)的納米粒，PLGA的疏水核心被HA外殼所屏蔽［24］，1H NMR結(jié)果初步證明PLGA-b-HA嵌段共聚物的合成。為進(jìn)一步驗證PLGA-b-HA的結(jié)構(gòu)，對PLGA-NHS、HA-NH2和PLGA-b-HA進(jìn)行ATR-FTIR測試，結(jié)果如圖2（b）所示。由圖2（b）可知：HA-NH2在3353 cm^-1和2888 cm-1處出現(xiàn)寬峰，對應(yīng)于O—H伸縮振動峰和C—H伸縮振動峰，PLGA-NHS在1742 cm^-1處出現(xiàn)明顯的尖峰，對應(yīng)于CO伸縮振動峰。合成的PLGA-b-HA在圖中表現(xiàn)為HA-NH2和PLGA-NHS的混合光譜，在1742 cm-1處的羰基伸縮振動峰與3353 cm-1處的羥基伸縮振動峰在圖譜中同時出現(xiàn)，且羥基伸縮振動峰相較于PLGA的明顯增強(qiáng)，在1084 cm-1處對應(yīng)于C—O—C的伸縮振動峰相較于HA的明顯增強(qiáng)［26-27］。以上結(jié)果表明成功合成PLGA-b-HA嵌段共聚物。

2.2膠束的合成表征及分析圖3（a）為PLGA-b-HA質(zhì)量濃度對I₃₃₆/I₃₃₄的關(guān)系圖，隨著PLGA-b-HA質(zhì)量濃度的增大，芘熒光激發(fā)波長從334 nm紅移到336 nm，兩條直線交點(diǎn)處為CMC的值：0.2 mg/L，低CMC值表明PLGA-b-HA在較低的質(zhì)量濃度下可形成膠束并保持良好的穩(wěn)定性，具備成為載藥聚合物膠束的潛質(zhì)。圖3（b）為MS、CIP@MS、CIP/RFP@MS的粒徑圖，MS的平均粒徑為142 nm，負(fù)載CIP后的膠束平均粒徑增大為190 nm，共同負(fù)載CIP和RFP后的膠束平均粒徑為194 nm，載藥后的膠束粒徑逐漸增大，但大部分的膠束粒徑小于200 nm，有利于膠束在感染病灶處的滲透富集。圖3（c）顯示CIP、RFP、MS、CIP@MS、CIP/RFP@MS的Zeta電位依次為：-7.8、-2.5、-28.7、-30.0 mV和-29.0 mV，膠束在載藥前后的電位變化不明顯，其原因可能是藥物含量較低，對膠束的電位影響較小。

從圖4可以看出：3種膠束均具有球狀形貌和明顯的雙層結(jié)構(gòu)，大小均在200 nm以內(nèi)；MS的分散性較好，CIP@MS的大小較均一，CIP/RFP@MS的粒徑較大，其差異的原因可能是在載藥過程中，藥物、溶劑和載體之間形成了一定的相互作用；膠束的形成及穩(wěn)定可以通過丁達(dá)爾效應(yīng)側(cè)面印證，當(dāng)光束通過含有納米顆粒的膠體分散體系時，從垂直入射光方向可以觀察到體系中出現(xiàn)一條光亮的“通路”，該現(xiàn)象被稱為丁達(dá)爾效應(yīng)［28］。圖4的右上方插圖分別為MS、CIP@MS、CIP/RFP@MS丁達(dá)爾效應(yīng)示意圖，在3個體系中均出現(xiàn)明顯的光通路，進(jìn)一步說明MS、CIP@MS、CIP/RFP@MS體系中均形成膠束，且具有良好的穩(wěn)定性。

2.3藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線及膠束載藥率測定通過紫外-可見光分光光度計測試獲得了CIP和RFP的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及凍干后負(fù)載藥物聚合物的紫外吸收光譜圖，結(jié)果如圖5所示。圖5（a）和圖5（b）顯示：CIP和RFP在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。由圖5（c）紫外吸收峰的變化可知：藥物成功負(fù)載，CIP在CIP@MS中的載藥率為1.42%，包封率為28.30%；CIP和RFP在CIP/RFP@MS中的載藥率分別為1.09%和1.41%，包封率分別為21.80%和28.10%。

2.4抗菌測試表征及分析圖6為S.aureus和E.coli分別與不同載藥膠束共培養(yǎng)4 h的SEM圖，其中紅色箭頭標(biāo)識為被破壞的細(xì)菌。與圖6（a）PBS組相比，圖6（b）MS組中2種細(xì)菌的形貌基本沒有發(fā)生變化，均具有獨(dú)立、完整的形貌結(jié)構(gòu)，MS未表現(xiàn)出對細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞；圖6（c）CIP@MS組中大多數(shù)S.aureus形貌仍保持為原來的球形完整結(jié)構(gòu)，小部分S.aureus的膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了破損現(xiàn)象，部分E.coli細(xì)胞膜出現(xiàn)融合現(xiàn)象，其膜結(jié)構(gòu)界限不再清晰分明；圖6（d）CIP/RFP@MS組中可以明顯的觀察到S.aureus和E.coli的形貌和結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)了嚴(yán)重破損，大量的S.aureus已不具有完整的球型結(jié)構(gòu)，大量的E.coli出現(xiàn)了更為嚴(yán)重的膜融合現(xiàn)象，細(xì)菌結(jié)構(gòu)坍塌；相對于CIP@MS，CIP/RFP@MS對2種細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)的破壞作用更為顯著，表現(xiàn)出顯著的殺菌作用。E.coli對CIP較為敏感，CIP通過靶向細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶，抑制細(xì)菌DNA的合成，達(dá)到抗菌效果；S.aureus對RFP較為敏感，RFP通過與細(xì)菌的RNA聚合酶結(jié)合抑制細(xì)菌生長［29-31］。在本文的載藥體系中，藥物封裝于膠束內(nèi)部，膠束與細(xì)菌共培養(yǎng)時，藥物從膠束中釋放并作用于細(xì)菌，抑制細(xì)菌DNA或RNA合成，促使細(xì)胞膜破裂，最終實(shí)現(xiàn)抗菌作用。

為進(jìn)一步分析載藥膠束的抗菌性能，將載藥膠束與細(xì)菌繼續(xù)共培養(yǎng)24 h后進(jìn)行平板涂布測試，結(jié)果如圖7和表1所示。與圖7（a）PBS組相比，圖7（b）MS組中S.aureus和E.coli的菌落個數(shù)與PBS組的菌落個數(shù)相差都較小，幾乎沒有表現(xiàn)出抗菌效果；在載藥膠束中，圖7（c）CIP@MS組對S.aureus具有一定的抗菌效果，抗菌率達(dá)到27.7%，對E.coli表現(xiàn)出顯著的殺菌效果，抗菌率達(dá)到99.9%；圖7（d）CIP/RFP@MS組的抗菌效率較為明顯，對S.aureus的抗菌率達(dá)到85.4%，對E.coli的抗菌率達(dá)到了100.0%。CIP@MS對E.coli的抗菌率明顯高于對S.aureus的抗菌率，而CIP/RFP@MS對2種細(xì)菌的抗菌效果優(yōu)于CIP@MS，載藥膠束中CIP與RFP表現(xiàn)出協(xié)同作用。由圖6和圖7的結(jié)果可知，當(dāng)S.aureus和E.coli分別與不同載藥膠束共培養(yǎng)4 h和24 h時，MS、CIP@MS、CIP/RFP@MS在對細(xì)菌的破壞作用上具有一致性，S.aureus對RFP較為敏感，E.coli對CIP較為敏感，2種藥物共同負(fù)載于膠束載體中，可拓寬抗生素譜，減少單一藥物劑量。

2.5細(xì)胞毒性測試表征及分析將不同質(zhì)量濃度的MS、CIP@MS、CIP/RFP@MS與HUVEC共培養(yǎng)24 h，測定細(xì)胞活性，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知：隨著MS、CIP@MS、CIP/RFP@MS質(zhì)量濃度的不斷增加，MS組的細(xì)胞存活率無明顯下降，質(zhì)量濃度增加到200 μg/mL時，CIP@MS組和CIP/RFP@MS組細(xì)胞存活率略有下降，但均保持在95%以上，表明3種膠束對HUVEC的細(xì)胞毒性較小，具有潛在的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

3結(jié)論

本文將PLGA和HA改性后通過縮聚反應(yīng)合成了PLGA-b-HA兩親性嵌段共聚物，制備了可同時負(fù)載CIP和RFP的載藥納米膠束，探討了MS、CIP@MS和CIP/RFP@MS對S.aureus和E. col的抗菌性能，并評估了膠束對HUVEC的體外細(xì)胞毒性，所得結(jié)論如下：

a）PLGA-b-HA嵌段共聚物在水溶液中自組裝形成膠束的CMC較低，膠束呈圓球狀形貌，表面具有一定負(fù)電荷，粒徑分布于100～200 nm之間，具有良好的分散性和穩(wěn)定性；

b）雙載藥膠束對S.aureus的抗菌率達(dá)到85%以上，對E.coli的抗菌性能達(dá)到100%，載藥膠束中CIP與RFP表現(xiàn)出協(xié)同抗菌作用；

c）MS、CIP@MS和CIP/RFP@MS對HUVEC的體外細(xì)胞毒性較小，具有潛在的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

［1］史玉敏， 嚴(yán)恒， 王俊， 等. 氟喹諾酮類雜合體的抗耐藥菌活性［J］. 中國抗生素雜志， 2023， 48（11）：1273-1280.

［2］Zhang L L， Bao M， Liu B， et al. Effect of andrographolide and its analogs on bacterial infection： A review［J］. Pharmacology， 2020， 105（3/4）： 123-134.

［3］Gao W W， Thamphiwatana S， Angsantikul P， et al. Nanoparticle approaches against bacterial infections［J］. Nanomedicine and Nanobiotechnology， 2014， 6（6）： 532-547.

［4］Lu C B， Xiao Y， Liu Y Y， et al. Hyaluronic acid-based levofloxacin nanomicelles for nitric oxide-triggered drug delivery to treat bacterial infections［J］. Carbohydrate Polymers， 2020， 229： 115479.

［5］Douafer H， Andrieu V， Phanstiel O， et al. Antibiotic adjuvants： Make antibiotics great again?。跩］. Journal of Medicinal Chemistry， 2019， 62（19）： 8665-8681.

［6］Coates A R M， Hu Y， Holt J， et al. Antibiotic combination therapy against resistant bacterial infections： Synergy， rejuvenation and resistance reduction［J］. Expert Review of Anti-infective Therapy， 2020， 18（1）： 5-15.

［7］Sullivan G J， Delgado N N， Maharjan R， et al. How antibiotics work together： Molecular mechanisms behind combination therapy［J］. Current Opinion in Microbiology， 2020， 57： 31-40.

［8］Hardie K R， Fenn S J. JMM profile： Rifampicin： A broad-spectrum antibiotic［J］. Journal of Medical Microbiology， 2022， 71（8）：1566-1571.

［9］Qiao Z W， Yuan Z， Zhang W P， et al. Preparation， in vitro release and antibacterial activity evaluation of rifampicin and moxifloxacin-loaded poly（d，l-lactide-co-glycolide）microspheres［J］. Artificial Cells Nanomedicine and Biotechnology， 2019， 47（1）： 790-798.

［10］Kang Y R， Chung D R， Ko J H， et al. Comparing the synergistic and antagonistic interactions of ciprofloxacin and levofloxacin combined with rifampin against drug-resistant staphylococcus aureus： A time-kill assay［J］. Antibiotics， 2023， 12（4）： 711-723.

［11］Miranda C L， Yus C， Remirez D G C， et al. Combinatorial wound dressings loaded with synergistic antibiotics in the treatment of chronic infected wounds［J］. Chemical Engineering Journal， 2023， 476： 146679.

［12］Yeh Y C， Huang T H， Yang S C， et al. Nano-based drug delivery or targeting to eadicate bacteria for infection mitigation： A review of recent advances［J］. Frontiers in Chemistry， 2020， 8： 286-308.

［13］Yang X， Domalaon R， Lyu Y F， et al. Tobramycin-linked efflux pump inhibitor conjugates synergize fluoroquinolones， rifampicin and fosfomycin against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa［J］. Journal of Clinical Medicine， 2018， 7（7）： 158-170.

［14］Wang S T， Gao Y F， Jin Q， et al. Emerging antibacterial nanomedicine for enhanced antibiotic therapy［J］. Biomaterials Science， 2020， 8（24）： 6825-6839.

［15］Walvekar P， Gannimani R， Govender T. Combination drug therapy via nanocarriers against infectious diseases［J］. European Journal of Pharmaceutical Sciences， 2019， 127： 121-141.

［16］Nwabuife J C， Omolo C A， Govender T. Nano delivery systems to the rescue of ciprofloxacin against resistant bacteria “E." coli; P." aeruginosa; Saureus; and MRSA” and their infections［J］. Journal of Controlled Release， 2022， 349： 338-353.

［17］Wassif R K， Elkayal M， Shamma R N， et al. Recent advances in the local antibiotics delivery systems for management of osteomyelitis［J］. Drug Delivery， 2021， 28（1）： 2392-2414.

［18］Baptista P V， McCusker M P， Carvalho A， et al. Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria-“a battle of the titans”［J］. Frontiers in Microbiology， 2018， 9： 1441-1467.

［19］Chen Y X， Zhao Q， Han J H， et al. Dual drug loaded pH-sensitive micelles for efficient bacterial infection treatment［J］. Pharmaceutical Research， 2022， 39（6）： 1165-1180.

［20］Klodzinska S N， Wan F， Jumaa H， et al. Utilizing nanoparticles for improving anti-biofilm effects of azithromycin： A head-to-head comparison of modified hyaluronic acid nanogels and coated poly （lactic-co-glycolic acid）nanoparticles［J］. Journal of Colloid and Interface Science， 2019， 555： 595-606.

［21］Gheffar C， Le H， Jouenne T， et al. Antibacterial activity of ciprofloxacin-loaded poly （lactic-o-glycolic acid）-nanoparticles against Staphylococcus aureus［J］. Particle amp; Particle Systems Characterization， 2021， 38（1）： 2000253.

［22］Wu J， Zhai T S， Sun J， et al. Mucus-permeable polymyxin B-hyaluronic acid/poly （lactic-co-glycolic acid）nanoparticle platform for the nebulized treatment of lung infections［J］. Journal of Colloid and Interface Science， 2022， 624： 307-319.

［23］Hlaing S P， Cao J， Lee J， et al. Hyaluronic acid-conjugated PLGA nanoparticles alleviate ulcerative colitis via CD44-mediated dual targeting to inflamed colitis tissue and macrophages［J］. Pharmaceutics， 2022， 14（10）： 2118-2136.

［24］Huang J B， Zhang H， Yu Y， et al. Biodegradable self-assembled nanoparticles of poly （d，l-lactide-co-glycolide）/hyaluronic acid block copolymers for target delivery of docetaxel to breast cancer［J］. Biomaterials， 2014， 35（1）： 550-566.

［25］Maurya D K. Colonycountj： A user-friendly image j add-on program for quantification of different colony parameters in clonogenic assay［J］. Journal of Clinical Toxicology， 2017， 7（5）： 1-4.

［26］Lee H， Ahn C H， Park T G. Poly ［lactic-co-（glycolic acid）］-grafted hyaluronic acid copolymer micelle nanoparticles for target-specific delivery of doxorubicin［J］. Macromolecular Bioscience， 2009， 9（4）： 336-342.

［27］Albano C， Gonzalez G， Palacios J， et al. PLLA-HA vs. PLGA-HA characterization and comparative analysis［J］. Polymer Composites， 2013， 34（9）： 1433-1442.

［28］Ghomi A R G， Mohammadi-Khanaposhti M， Vahidi H， et al. Fungus-mediated extracellular biosynthesis and characterization of zirconium nanoparticles using standard penicillium species and their preliminary bactericidal potential： A novel biological approach to nanoparticle synthesis［J］. Iranian Journal of Pharmaceutical Research， 2019， 18（4）： 2101-2110.

［29］Robertson G T， Bonventre E J， Doyle T B， et al. In vitro evaluation of CBR-2092， a novel rifamycin-quinolone hybrid antibiotic： Studies of the mode of action in Staphylococcus aureus［J］. Antimicrobial Agents and Chemotherapy， 2008， 52（7）： 2313-2323.

［30］Piddock L J V， Jin Y F， Ricci V， et al. Quinolone accumulation by Pseudomonas aeruginosa， Staphylococcus aureus and Escherichia coli［J］. Journal of Antimicrobial Chemotherapy， 1999， 43（1）： 61-70.

［31］Weinstein M P， Deeter R G， Swanson K A， et al. Crossover assessment of serum bactericidal activity and pharmacokinetics of ciprofloxacin alone and in combination in healthy elderly volunteers［J］. Antimicrobial Agents and Chemotherapy， 1991， 35（11）： 2352-2358.

（責(zé)任編輯：廖乾生）