摘 要：【目的】研究不同甜瓜品種遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的建立與基因編輯植株的快速獲取。

【方法】選用巴吾頓、老漢瓜、其里甘、新密雜11號（86-1）4個甜瓜品種的子葉為外植體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染甜瓜子葉，采用組織培養(yǎng)法建立老漢瓜的遺傳轉(zhuǎn)化再生體系，運用PCR法檢測獲取基因編輯植株。

【結(jié)果】從4個甜瓜品種中篩選出老漢瓜為優(yōu)勢品種作為外植體，在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)2 d和共培養(yǎng)3 d，在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+潮霉素5 mg/L+頭孢霉素250 mg/L篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)7 d，在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+潮霉素5 mg/L+頭孢霉素250 mg/L的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)1～2周可見長出的小芽，將誘導(dǎo)芽分別放置于不加潮霉素和加潮霉素的芽伸長培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽在不加潮霉素的芽伸長培養(yǎng)基上的生長速度比加潮霉素的培養(yǎng)基生長快，可使芽生長至2葉苗期縮短3周，在無菌環(huán)境下剪去一個芽提取DNA ，并采用RT-PCR方法檢測獲得21株轉(zhuǎn)化植株。

【結(jié)論】篩選出基因編輯植株嫩芽，不加潮霉素的芽伸長培養(yǎng)基可將獲得基因編輯植株周期縮短3周。

關(guān)鍵詞：甜瓜; 農(nóng)桿菌介導(dǎo); 遺傳轉(zhuǎn)化；基因編輯植株

中圖分類號：S652"" 文獻標(biāo)志碼：A"" 文章編號：1001-4330（2024）07-1666-07

0 引 言

【研究意義】甜瓜（Cucumis melo L.）屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）［1］，屬一年生匍匐或攀援草本植物［2］。甜瓜具有獨特的芳香味道和多種形狀［3］。我國新疆厚皮甜瓜種植面積較大［4］。分子生物學(xué)技術(shù)在品種改良方面應(yīng)用廣泛［5-6］。甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化上存在效率低和周期較長等問題 ［7］。因此，研究不同甜瓜品種遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的建立，對基因編輯植株的快速獲取有實際意義?！厩叭搜芯窟M展】農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為眾多植物提供了高效的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)［8］。Fang等［9］在20世紀(jì)80年代利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將含NPT II基因Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，于菌株LBA4404接種甜瓜子葉外植體，并獲得了抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因甜瓜植株。田紅梅等［10］通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，獲得了抗卡那霉素的抗性苗。王雪［11］也利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法進行甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了3株抗性苗。【本研究切入點】選育抗逆甜瓜品種有助于提高甜瓜產(chǎn)量及品質(zhì)［12］。雖然目前甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系較為普遍，但是不同甜瓜品種的遺傳轉(zhuǎn)化體系尚不成熟，不同甜瓜品種的轉(zhuǎn)化效率在0%～12.5%，遺傳轉(zhuǎn)化效率差異較大［13］。【擬解決的關(guān)鍵問題】以巴吾頓、老漢瓜、其里甘、新密雜11號（86-1）等4個甜瓜品種的子葉為外植體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，設(shè)置潮霉素抗性基因編輯植株的試驗，選取遺傳轉(zhuǎn)化再生體系較好的甜瓜品種，縮短基因編輯植株的獲得周期，為快速獲取基因編輯植株提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

選用巴吾頓、老漢瓜、其里甘和新密雜11號4個甜瓜品種，其中巴吾頓和老漢瓜品種由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所提供，其里甘和新密雜11號品種由昌吉益豐公司提供。6-BA（6-芐氨基嘌呤）購自上海源葉生物有限公司，MS改良培養(yǎng)基和瓊脂粉購自北京酷來搏科技有限公司，硫酸卡那霉素（kan）、潮霉素、利福平（Rifampicin）、NAA（萘乙酸）、GA3（赤霉素）和IBA購自索萊寶生物公司。所需試劑配制為母液后過濾，使用5 mL的注射器和0.22 μm的過濾器，在-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。農(nóng)桿菌SG10592、SG10594、SG10610和pP1C.4線性化載體由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 農(nóng)桿菌的活化與侵染液體的制備

將-80℃冰箱保存的農(nóng)桿菌活化后，采用分區(qū)劃線法劃線至均含有100 mg/L的利福平和卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基，28℃的培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)24～48 h，單菌落長出之后，挑取SG10592、SG10594和SG10610的單菌落分別放置于均含有100 mg/L的卡那霉素（kan）和利福平（Rif）1 mL的YEB培養(yǎng)基，在28℃恒溫搖床中，黑暗條件下培養(yǎng)24 h。吸取100 μL的24 h搖的農(nóng)桿菌菌液，加入到50 mL YEB（含有100 mg/L 的卡那霉素（kan）和100 mg/L利福平（Rif）），黑暗條件下培養(yǎng)至OD值0.5～0.6 時即可［14］。

1.2.2 外植體的獲取

選取新鮮粒大飽滿并成熟的甜瓜種子，將胚胎從種皮中剝出來，分別在75%的酒精處理40 s，期間用無菌鑷子不停地攪拌。將種子分別放在5%的次氯酸鈉（NaClO）消毒20 min［14］，用無菌鑷子不斷攪拌。取出種子用無菌水清洗５～６遍，置于無菌濾紙上至水分完全吸干，接種到不含任何激素的培養(yǎng)基的錐形瓶中，每個處理15粒種子，放置于光照/黑暗=16 h/8 h，溫度為28℃，光強為15 000 lx的培養(yǎng)條件下7 d進行無菌苗培養(yǎng)。

1.2.3 預(yù)培養(yǎng)

在超凈工作臺中，將無菌培養(yǎng)7 d后的子葉取出放置于無菌濾紙上，分別切去子葉近胚軸端和遠胚軸端2～3 mm，取中間段，沿子葉主脈切成2份，將子葉外植體接入到含不同激素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的平板中，每個平板10個外植體。將外植體放置在28℃、光強為15 000 lx，光照／黑暗＝16 h/8 h的條件MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2 d［15］。

1.2.4 農(nóng)桿菌侵染外植體

（1）將預(yù)培養(yǎng)后甜瓜子葉，置于100 mL的無菌組培瓶中。

（2）向每個放入預(yù)培養(yǎng)處理甜瓜子葉的組培瓶中加入50 mL的農(nóng)桿菌侵染菌液，置于28℃，160 r/min恒溫搖床中，黑暗條件下震蕩培養(yǎng)15 min。

1.2.5 共培養(yǎng)

將侵染的子葉取出倒入無菌的培養(yǎng)皿里，用無菌蒸餾水清洗6～7次，置于無菌濾紙上將水分充分吸干，放置于MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L共培養(yǎng)基中，28℃黑暗條件下共培養(yǎng)3 d［15］。

1.2.6 篩選培養(yǎng)

在黑暗條件下，將共培養(yǎng)之后的子葉置于MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+潮霉素5 mg/L+頭孢霉素250 mg/L篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每個平板放置于10片侵染子葉，培養(yǎng)7 d后，從篩選培養(yǎng)及上選取綠色的子葉，棄黃色并枯死的子葉，用滅菌過的蒸餾水清洗5次后，換置于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.7 基因編輯植株不定芽誘導(dǎo)

在篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)之后的子葉置于MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+潮霉素5 mg/L+頭孢霉素250 mg/L的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，每個平板放置于10片侵染子葉，14 d之后統(tǒng)計生長狀況。

1.2.8 不定芽伸長

在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d之后的外植體放置于芽伸長培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d。

1.2.9 快速獲取基因編輯植株

在芽伸長培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d之后的抗潮霉素芽的一部分在加潮霉素的芽伸長培養(yǎng)基（MS+6-BA 0.05 mg/L+GA3 0.15 mg/L+潮霉素5 mg/L+頭孢霉素250 mg/L）上培養(yǎng)，另一部分不加潮霉素的芽伸長培養(yǎng)基（MS+6-BA 0.05 mg/L+GA3 0.15 mg/L頭孢霉素250 mg/L）上培養(yǎng)，14 d之后觀察芽伸長狀況。

1.2.10 生根培養(yǎng)基

芽伸長大概3～4 cm時置于MS+IBA（0.5）mg/L+潮霉素5 mg/L+頭孢霉素250 mg/L的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d左右。

1.2.11 移苗或煉苗

根部生長2周之后，用無菌水清洗根部的培養(yǎng)基殘留，移至無菌土的營養(yǎng)缽上，在人工氣候箱內(nèi)放5～7 d，放置于人工氣候室培養(yǎng)。

1.2.12 提取基因編輯植株的葉片DNA

采用多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒，抗性植株有3～4片子葉時可提取子葉的DNA，操作步驟按照使用說明書進行。

1.2.13 引物設(shè)計

從eIF4E基因的合適位點選擇sgRNA的靶向序列，針對該基因設(shè)計sgRNA的靶向序列引物（上海生工生物工程股份有限公司）。表1

1.2.14 PCR檢測

以獲得的DNA為模板，HPT-1F ，HPT-1R為上下游引物，進行RT-PCR，反應(yīng)條件：94℃ 4 min預(yù)變性，94℃ 30 s變性，55℃ 30 s退火，72℃ 35 s延伸，共35個循環(huán)，反應(yīng)體系。表2

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜不同品種出愈率、不定芽誘導(dǎo)率及芽伸長率之間的差異

研究表明，在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+潮霉素5 mg/L+頭孢霉素250 mg/L的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，巴吾頓、老漢瓜、其里甘和新密雜11號4個品種的出愈率分別為70%、86.19%、84.04%和70%，其中出愈率最佳的為老漢瓜，出愈率最低的是巴吾頓和新密雜11號，為70%。巴吾頓、老漢瓜、其里甘和新密雜11號4個品種的芽誘導(dǎo)率分別為2.14%、8.57%、0%和4.04%，其中芽誘導(dǎo)率最佳的是老漢瓜。表3

2.2 甜瓜不同品種的褐化率和不定芽伸長上的差異

研究表明，在MS+6-BA 0.05 mg/L+GA3 0.15 mg/L+潮霉素 5 mg/L+頭孢霉素250 mg/L的芽伸長培養(yǎng)基上，巴吾頓、老漢瓜、其里甘和新密雜11號4個品種的褐化率分別為57.85%，47.61%，61.90%和52.38%。褐化率最高的為其里甘，最低為老漢瓜。巴吾頓、老漢瓜、其里甘和新密雜11號4個品種不定芽伸長率分別為0.23%、1.90%、0%和0.23%，芽伸長率最高的老漢瓜為1.90%，最低的巴吾頓為0.23%。表4

2.3 基因編輯芽的快速獲取

研究表明，在芽伸長培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周后的外植體切去周圍多余的愈傷組織，放置于加潮霉素的芽伸長培養(yǎng)基（MS+6-BA 0.05 mg/L+GA3 0.15 mg/L+潮霉素 5 mg/L+頭孢霉素250 mg/L），培養(yǎng)2周之后芽伸長較慢，甚至無明顯的伸長。放置于不加潮霉素的芽伸長培養(yǎng)基（MS+6-BA 0.05 mg/L+GA3 0.15 mg/L頭孢霉素250 mg/L）上的芽明顯伸長較快。圖1

2.4 抗性基因編輯芽的基因組提取DNA

研究表明，1～21號的DNA提取較好，條帶清晰，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，提取得DNA可以進行后續(xù)PCR檢測。提取的DNA在-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩D2，圖3

2.5 抗性基因編輯苗的 PCR檢測

研究表明，潮霉素篩選獲得植株共21株，陽性苗18株，其中SG10592和SG10610轉(zhuǎn)化的陽性苗分別為7株和11株。1～4號、7～14號和16～21號基因編輯植株均擴增出目的片段，5號、6號和15號獲取的甜瓜基因編輯植株未擴增出來目的片段，出現(xiàn)假陽性。圖4，圖5

3 討 論

3.1

基因編輯技術(shù)已被眾多植物的基因工程和基因表達廣泛應(yīng)用［16］。在甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的研究中，甜瓜離體再生作為前提和重要部分［17］。不同甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化體系和轉(zhuǎn)化率不同［18］，試驗結(jié)果表明，老漢瓜的芽誘導(dǎo)率，芽伸長率和轉(zhuǎn)化率最高。

3.2

在確定抗生素的濃度時，需要即對外植體的危害性低，又能夠篩選出抗性植株，抗生素的濃度過高將導(dǎo)致外植體的快速褐化，甚至導(dǎo)致植物組織的迅速死亡［19］。顏雪等［20］的試驗預(yù)培養(yǎng)3 d，李建勇等［15］的試驗結(jié)果表明，預(yù)培養(yǎng)2 d和共培養(yǎng)3 d的轉(zhuǎn)化率高，試驗的結(jié)果表明預(yù)培養(yǎng)3 d的效果最佳，與顏雪等［20］、李建勇等［15］的試驗效果一致。夏雪琴［21］的試驗結(jié)果表明，共培養(yǎng)時間超過3 d時抗性芽的分化率下降，共培養(yǎng)為3 d的時間有利于芽的分化，試驗利用相同的共培養(yǎng)時間為3 d時，芽的分化率最佳。常尚連［22］的試驗結(jié)果顯示，最合適的侵染時間為15 min，試驗中外植體侵染時間為15 min時試驗效果最佳。王爽［23］的研究結(jié)果表明，頭孢濃度250mg/L是抑制菌的效果最好，試驗進一步驗證了使用250 mg/L的頭孢效果最佳。

4 結(jié) 論

采用RT-PCR方法檢測獲得21株轉(zhuǎn)化植株。老漢瓜品種的芽誘導(dǎo)率和芽伸長率與其他3個品種相對較好，4個品種中老漢瓜作為農(nóng)桿菌侵染的優(yōu)勢品種。

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Establishment of genetic transformation and regeneration

systems for different melon varieties and rapid acquisition

of gene edited plants

Kadierayi Maimaiti1，ZHOU Tingting1，HAN Sheng1，

Meilikehan Rexiti2，Yushanjiang Maimaiti1

（1. Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northwestern Oasis，Ministry of Agriculture and Rural Affairs， P . R. China / Institute of Plant Protection，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091， China; 2. Hami Agricultural Machinery Technology Promotion Service Center， Hami Xinjiang 839000，China）

Abstract：【Objective】 Study on establishment of genetic transformation and regeneration systems for different melon varieties and rapid acquisition of gene edited plants.

【Methods】 The cotyledons of four melon varieties， including Bawudun， Laohangua， Qiligan， and Xinmiza No. 11 （86-1）.The sweet melon cotyledons were infected by Agrobacterium tumefaciens mediated method， and a genetic transformation and regeneration system of Laohan melon was established by tissue culture method and then genetically edited plants were obtained through PCR detection.

【Results】" The results showed that Laohan melon was selected as the dominant variety from four melon varieties as the explants. It was pre-cultured on MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L medium for 2 days and co-cultured for 3 days， then it was further cultured on MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+hygromycin 5 mg/L+cephalosporin 250 mg/L screened medium for 7 days， after that， small buds were seen growing on MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+hygromycin 5 mg/L+cephalosporin 250 mg/L adventitious bud induction medium for 1-2 weeks. The induced buds were placed on both non hygromycin and hygromycin added bud elongation medium for cultivation. It was found that the growth rate of the induced buds on the non hygromycin added bud elongation medium was faster than that on the hygromycin added medium， which shortened the growth of the buds to the two leaf seedling stage by 3 weeks. One bud DNA was cut off in a sterile environment and 21 transformed plants were examined by RT-PCR.

【Conclusion】"" Gene edited plant buds were successfully selected on a shoot elongation medium with added hygromycin. The use of a shoot elongation medium without added hygromycin can shorten the time for obtaining gene edited plants by 3 weeks.

Key words：muskmelon; Agrobacterium mediated; genetic transformation;genome edited plant

Fund projects：The Regional Science Foundation project of the National Natural Science Foundation of China \"Study on Polyvirus Disease Based on Crispr / Cas 9 Technology\" （31760511）

Correspondence author： Yushanjiang Maimaiti（1978-），male，from Xinjiang，doctor，professor，master supervisor ，research direction：melon crop pest" control，（E-mail）yusanjan418@163.com

收稿日期（Received）：

2023-11-15

基金項目：

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目“基于CRISPR/Cas9技術(shù)的哈密瓜抗多病毒病非轉(zhuǎn)基因材料創(chuàng)制研究”（31760511）

作者簡介：

卡地爾阿依·買買提（1996-），女，新疆人，碩士研究生，研究方向為植物病蟲害防治，（E-mail）2432443698@qq.com

通訊作者：

玉山江·麥麥提（1978-），男，新疆人，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向為瓜類作物病蟲害防治，（E-mail）yusanjan418@163.com