摘 要：富硒食品的開(kāi)發(fā)為人們補(bǔ)硒提供了有效途徑，而準(zhǔn)確測(cè)定食品中硒形態(tài)及其含量是評(píng)價(jià)富硒食品生物功能和安全性的關(guān)鍵。本文系統(tǒng)闡述高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS）應(yīng)用于食品硒形態(tài)分析中的研究進(jìn)展，以期為開(kāi)發(fā)高效、便捷、推廣性強(qiáng)的硒形態(tài)分析方法提供參考。

關(guān)鍵詞：食品；硒形態(tài)；高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLC-ICP-MS）

Research on the the Application of HPLC-ICP-MS in the Morphological Analysis of Selenium in Food

Abstract： The development of selenium-enrich foods provides an effective way for people to supplement selenium， and the accurate determination of selenium form and content in food is the key to evaluate the biological function and safety of selenium-rich foods. In this paper， the research progress of the application of high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry （HPLC-ICP-MS） in the morphological analysis of selenium in food is systematically reviewed， in order to provide reference for the development of an efficient， convenient and widely used method for selenium morphology analysis.

Keywords： food; form of selenium; high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry （HPLC-ICP-MS）

硒是人和動(dòng)物生命活動(dòng)中必需的微量元素，是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶等的活性成分，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、清除自由基、防癌抗癌、保護(hù)肝臟等方面發(fā)揮著重要作用[1]。人體長(zhǎng)期硒攝入不足會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，誘發(fā)克山病、大骨節(jié)病、癌癥和糖尿病等多種疾病[2]。中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦正常成人的硒攝入量為60～250 μg·d-1[3]。然而，我國(guó)居民人均硒攝入量不足40 μg·d-1[4]。富硒食品的開(kāi)發(fā)為人們補(bǔ)硒提供了便捷有效的途徑。硒在食品中分為無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒兩類(lèi)，無(wú)機(jī)硒包括硒酸根、亞硒酸根和單質(zhì)硒，有機(jī)硒包括硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代乙硫氨酸和硒脲等小分子硒化物以及硒蛋白、硒多糖等。有機(jī)硒生物活性高、安全無(wú)毒，是人體補(bǔ)充硒的主要來(lái)源。因此，全面、準(zhǔn)確分析食品中硒的賦存形態(tài)，對(duì)于富硒食品的開(kāi)發(fā)和人們科學(xué)補(bǔ)硒具有重要意義。

1 食品中硒形態(tài)的測(cè)定

硒的賦存形態(tài)及其含量在很大程度上決定著富硒食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和安全性。食品基質(zhì)復(fù)雜，硒形態(tài)種類(lèi)多樣且總體上含量較低，而且不同硒形態(tài)之間極易發(fā)生轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致食品中硒形態(tài)的分析具有一定挑戰(zhàn)性，至今尚未形成同時(shí)測(cè)定食品中多種硒形態(tài)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

食品中硒形態(tài)的檢測(cè)分析主要包括待測(cè)樣品中硒化合物的提取、不同硒形態(tài)的分離富集以及各組分的定性定量檢測(cè)等環(huán)節(jié)。色譜分離與光譜/質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用，已成為硒形態(tài)研究的常用手段，如高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS）聯(lián)用技術(shù)、高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜（High Performance Liquid Chromatography-Hydride Generation-Atomic Fluorescence Spectrometry，HPLC-HG-AFS）聯(lián)用技術(shù)等[5]。其中，HPLC-ICP-MS檢出限較低、分離能力較好以及靈敏度較高，是現(xiàn)階段硒形態(tài)分析中應(yīng)用最廣泛的方法。例如，梁志森等[6]采用HPLC-ICP-MS測(cè)定植物性富硒食品中硒酸根、亞硒酸根、硒代胱氨酸、L-硒甲基硒代半胱氨酸、L-硒代蛋氨酸、甲基亞硒酸及硒代乙硫氨酸7種硒形態(tài)的含量；孟莉等[7]采用HPLC-ICP-MS研究谷類(lèi)食品中硒代胱氨酸、亞硒酸根、硒代蛋氨酸和硒酸根4種硒形態(tài)；李乾玉[8]采用HPLC-ICP-MS研究畜肉中硒酸根、亞硒酸根、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸5種硒形態(tài)。

2 食品中硒形態(tài)提取方法研究

采用高效的前處理方法提取食品中與大分子物質(zhì)結(jié)合的硒，是硒形態(tài)定量分析的前提。常用的提取方法有水提法、緩沖鹽（Tris-HCl）提取法、酸提法、堿提法和酶提法。其中，酶提法因反應(yīng)條件溫和、硒化合物的結(jié)構(gòu)不易被破壞，在食品中硒形態(tài)的提取方面應(yīng)用最為廣泛[9-11]。采用酶提法時(shí)，需要優(yōu)化酶的種類(lèi)、用量、酶解時(shí)間、溶液pH值等條件。常用于硒形態(tài)提取的酶主要有蛋白酶XIV、蛋白酶K、胰蛋白酶、纖維素酶等，多種酶混合使用已成為硒形態(tài)提取的一種趨勢(shì)[12]。為兼顧硒形態(tài)的提取效率和穩(wěn)定性，提取時(shí)間大多都控制在3 h以?xún)?nèi)[13]。另外，超聲、微波等常用的輔助提取技術(shù)，在提高硒形態(tài)提取率、縮短提取時(shí)間方面有積極的作用[9]。

3 HPLC-ICP-MS應(yīng)用于硒形態(tài)檢測(cè)的研究

儀器條件（色譜條件和ICP-MS工作條件）決定了所建立方法的精密度、準(zhǔn)確性和檢測(cè)效率。因此，采用HPLC-ICP-MS測(cè)定硒形態(tài)時(shí)，需要綜合考慮色譜條件和ICP-MS工作條件的優(yōu)化。

3.1 色譜條件的優(yōu)化

采用HPLC-ICP-MS對(duì)硒元素形態(tài)進(jìn)行分析時(shí)，色譜條件的優(yōu)化主要涉及色譜柱的選擇、流動(dòng)相的組成及濃度、洗脫方式、流動(dòng)相流速等方面。

3.1.1 色譜柱的選擇

常用的色譜柱主要分為陰離子交換色譜柱和反相色譜柱。Hamilton PRP-X100陰離子交換色譜柱能夠有效分離5種硒形態(tài)，特別適用于無(wú)機(jī)硒和小分子硒代氨基酸的分離，分離度較好，峰形對(duì)稱(chēng)，是目前硒形態(tài)分析最常用的色譜柱。但通常使用該色譜柱時(shí)個(gè)別硒形態(tài)出峰時(shí)間較長(zhǎng)，靈敏度低，色譜柱的使用壽命易受到影響[14]。反相色譜柱可分離的硒形態(tài)種類(lèi)更多，且分析時(shí)間短、峰形尖銳、靈敏度高，對(duì)大分子有機(jī)硒化合物分離效果較好，其在硒形態(tài)分析中的應(yīng)用日益受到關(guān)注[15-16]。常用的反相色譜柱有安捷倫ZORBAX SB-Aq C18柱、Athena C18柱、Hypersil GOLD C8柱等，其中以ZORBAX SB-Aq C18柱應(yīng)用最為廣泛。盧鑫等[9]比較了Hamilton PRP-X100柱和C18色譜柱對(duì)5種硒代氨基酸的分離能力，結(jié)果顯示C18色譜柱能夠完全分離5種硒代氨基酸，且峰形較好。陸奕娜等[17]對(duì)比了Hamilton PRP-X100陰離子分析柱、安捷倫ZORBAX SB-Aq C18柱、安捷倫TC-C18柱等6種色譜柱對(duì)硒形態(tài)的分離效果，結(jié)果顯示Hamilton PRP-X100柱能分離出5種硒形態(tài)，安捷倫ZORBAX SB-Aq C18柱能有效分離出7種硒形態(tài)，其他4種色譜柱均出現(xiàn)色譜峰重疊的現(xiàn)象。

3.1.2 流動(dòng)相的選擇

采用Hamilton PRP-X100陰離子柱進(jìn)行硒形態(tài)分離時(shí)，流動(dòng)相常選擇磷酸鹽或檸檬酸。檸檬酸能夠增加色譜柱與硒化合物之間的作用力，從而增強(qiáng)分離效果、降低檢出限[18]。磷酸鹽具有較好的緩沖效果，能夠改善峰形、提高定量分析的準(zhǔn)確性。采用反相色譜柱進(jìn)行硒形態(tài)分離時(shí)，所用流動(dòng)相主體為高水相，同時(shí)會(huì)加入緩沖液、離子對(duì)試劑和少量的極性有機(jī)溶劑，以改善不同硒形態(tài)的分離效果。常用的離子對(duì)試劑有烷基磺酸鹽類(lèi)、四丁基銨鹽類(lèi)和七氟丁酸等全氟羧酸類(lèi)。少量的甲醇等有機(jī)溶劑能夠提高流動(dòng)相的洗脫能力，增強(qiáng)檢測(cè)器的信號(hào)強(qiáng)度?，F(xiàn)有研究中流動(dòng)相以檸檬酸+己烷磺酸鈉+甲醇、磷酸氫二銨+四丁基溴化銨+甲醇兩種組合最為常見(jiàn)[13，19]。張珂等[20]以ZORBAX SB -Aq C18柱為分離色譜柱，以加入己烷磺酸鈉的檸檬酸體系為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)所測(cè)硒形態(tài)可以在8 min內(nèi)有效分離，且各硒形態(tài)具有較高的靈敏度。王賢波等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在磷酸氫二銨體系中加入0%～2.0%的甲醇能夠明顯增加硒形態(tài)的信號(hào)強(qiáng)度，且信號(hào)強(qiáng)度隨著甲醇濃度的升高而增大。

3.1.3 流動(dòng)相的濃度

流動(dòng)相的濃度與色譜分離效果和保留時(shí)間密切相關(guān)。流動(dòng)相濃度越大，保留時(shí)間越短；但流動(dòng)相濃度過(guò)大時(shí)，會(huì)導(dǎo)致硒形態(tài)分離不徹底，色譜峰重疊。盧鑫等[9]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)磷酸氫二銨溶液（pH值為6.5）為25 mmol·L-1時(shí)，5種硒代氨基酸分離效果較好且分析時(shí)間較短。姚真真等[21]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)檸檬酸濃度為5 mmol·L-1時(shí)，5種硒形態(tài)在15 min內(nèi)能夠較好地分離；增加檸檬酸濃度，保留時(shí)間縮短，但峰形有重疊和拖尾現(xiàn)象。

3.1.4 流動(dòng)相pH值

流動(dòng)相的pH值對(duì)色譜峰的峰形、檢測(cè)靈敏度、保留時(shí)間影響較大。流動(dòng)相的pH值不僅決定著硒在流動(dòng)相中的不同離子形態(tài)，還會(huì)影響檸檬酸的質(zhì)子化反應(yīng)，改變不同形態(tài)硒與流動(dòng)相之間的相互作用。李乾玉等[8]研究發(fā)現(xiàn)，以10 mmol·L-1檸檬酸及5 mmol·L-1己烷磺酸鈉（含1%甲醇）為流動(dòng)相，在pH值為4.0時(shí)分離畜肉中的5種硒形態(tài)效果較好。李倩等[10]以25 mmol·L-1的檸檬酸為流動(dòng)相，對(duì)比不同pH值對(duì)硒形態(tài)的分離效果，發(fā)現(xiàn)pH值為6.0時(shí)各硒形態(tài)分離度最好。

3.1.5 流動(dòng)相流速

流動(dòng)相的流速主要影響出峰時(shí)間和峰形。流速較小時(shí)，洗脫能力較弱，出峰延遲，峰形較寬；流速越大，峰形越窄，出峰時(shí)間越短。但流速過(guò)快會(huì)導(dǎo)致色譜峰重疊，常用的流速為0.8～1.2 mL·min-1。魏琴芳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，30 mmol·L-1磷酸氫二銨（pH值為6.0）在流速為1.0 mL·min-1時(shí)，對(duì)大豆中5種硒形態(tài)的分離效果較好。陳思伊等[18]研究發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相流速為1.0 mL·min-1時(shí)，色譜柱呈現(xiàn)出最佳的柱效，其對(duì)食品中5種硒形態(tài)的分離效果最優(yōu)。

3.1.6 洗脫方式

不同的洗脫方式對(duì)硒形態(tài)的分析時(shí)間和分離效果都有影響。等度洗脫在硒形態(tài)分離中最為常見(jiàn)，但通常保留時(shí)間較長(zhǎng)；梯度洗脫能有效縮短分析時(shí)間，在硒形態(tài)研究中的應(yīng)用越來(lái)越受重視。陳貴宇等[16]以含5%的10 mmol·L-1檸檬酸的水溶液為流動(dòng)相分離茶葉中的5種硒形態(tài)，采用等度洗脫時(shí)5種硒化合物的分離時(shí)間達(dá)到22 min，而梯度洗脫能夠?qū)⒎蛛x時(shí)間縮短至15 min內(nèi)。陳思伊等[18]以不同濃度的磷酸氫二銨體系進(jìn)行梯度洗脫，使5種硒形態(tài)的分析時(shí)間由原來(lái)的16.0 min左右縮短至8.5 min左右。

3.2 ICP-MS工作條件的優(yōu)化

ICP-MS工作條件包括高頻入射功率、載氣流量、等離子體氣流量、檢測(cè)同位素、碰撞模式及蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速等。其中，檢測(cè)同位素?cái)?shù)和碰撞模式的優(yōu)化在現(xiàn)有研究中有報(bào)道，其他指標(biāo)主要依靠ICP-MS調(diào)諧和優(yōu)化來(lái)實(shí)現(xiàn)。

3.2.1 檢測(cè)同位素

硒的同位素常見(jiàn)有74Se、76Se、77Se、78Se、80Se和82Se，其自然豐度分別為0.87%、9.02%、7.48%、23.52%、49.82%和9.19%。80Se的自然豐度最高，其受到的干擾也最大，通常很少使用；78Se的自然豐度次之，常作為質(zhì)譜檢測(cè)硒元素的定量離子[7-8]；其他各同位素的豐度都不超過(guò)10%，因此使用較少。王賢波等[11]以78Se作為監(jiān)測(cè)同位素，采用H2-He碰撞池模式并調(diào)節(jié)碰撞氣流量，從而消除了40Ar38Ar+和38Ar40Ca+等對(duì)78Se的質(zhì)譜干擾。曾鳳澤等[15]分別考察了6種同位素作為檢測(cè)質(zhì)量數(shù)時(shí)各種硒形態(tài)在ICP-MS中的響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可通過(guò)選擇碰撞池模式和優(yōu)化碰撞反應(yīng)氣流量來(lái)消除40Ar2H2+對(duì)82Se干擾。

3.2.2 檢測(cè)模式優(yōu)化

常用的質(zhì)譜檢測(cè)模式有標(biāo)準(zhǔn)模式（No gas，不通氣體）、雙路氣體（H2-He）碰撞反應(yīng)池模式、高能氦氣模式、氦氣碰撞模式、動(dòng)態(tài)反應(yīng)池模式等。盧鑫等[9]考察了78Se和80Se為定量同位素，并在不同碰撞反應(yīng)池模式下分別對(duì)檢測(cè)器調(diào)諧消除多原子離子的干擾，進(jìn)一步聯(lián)用高效液相色譜測(cè)定5種硒代氨基酸的檢出限，結(jié)果顯示在高能氦氣模式下，當(dāng)監(jiān)測(cè)質(zhì)荷比為78時(shí)，檢出限最佳。

3.2.3 其他ICP-MS工作條件優(yōu)化

梁志森等[6]采用80Se為定量同位素，在動(dòng)態(tài)反應(yīng)池模式下，對(duì)比氧氣、甲烷分別作為反應(yīng)氣體時(shí)對(duì)質(zhì)譜干擾的消除效果，發(fā)現(xiàn)甲烷作為反應(yīng)氣體時(shí)基線平整、響應(yīng)較低，且質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)比氧氣作為反應(yīng)氣體時(shí)高三四倍。林樾等[12]通過(guò)儀器調(diào)諧，在射頻功率為1 100 W、霧化器流量為0.91 L·min-1、輔助氣流速為1.2 L·min-1、泵速為0.8 r·s-1、定量同位素為78Se、檢測(cè)模式為氦氣碰撞模式等條件下，檢測(cè)了富硒碎米薺中的5種硒形態(tài)。

4 結(jié)語(yǔ)

當(dāng)前，采用HPLC-ICP-MS對(duì)富硒食品中的硒形態(tài)進(jìn)行定量分析成為熱點(diǎn)。但在不同食品中硒形態(tài)種類(lèi)和含量各不相同，且各形態(tài)的硒在分析過(guò)程中易受環(huán)境影響發(fā)生轉(zhuǎn)化，因此需要結(jié)合待測(cè)樣品類(lèi)型和儀器條件，選擇影響較大的因素進(jìn)行方法優(yōu)化。隨著聯(lián)用分析技術(shù)的不斷創(chuàng)新，期待建立更加快速便捷、精密準(zhǔn)確的硒形態(tài)分析方法。同時(shí)，未知硒化合物的鑒定分析及相關(guān)硒化合物標(biāo)準(zhǔn)品的開(kāi)發(fā)、硒形態(tài)與其他元素之間的相互關(guān)系也有待深入研究。

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