摘 要：隨著益生菌和人體共生關(guān)系研究的深入，菌種的快速發(fā)現(xiàn)、分離和篩選，以及益生菌產(chǎn)品質(zhì)量的高效管控都有賴于檢測及鑒定技術(shù)的進步。本文綜述了表型、基因型等鑒定技術(shù)以及常用的定量檢測技術(shù)的研究進展。近年來，研究者們逐步將多種檢測技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，提供多維度的檢測方案，并進行相互驗證，推動了檢測技術(shù)向系統(tǒng)化、精準化、高效化以及低成本化的方向發(fā)展。本文為益生菌的日常檢測研究提供了參考和借鑒。

關(guān)鍵詞：益生菌；鑒定；定量檢測

Research Progress on Detection and Identification Technology of Commonly Used Probiotics in Food

Abstract： With the deepening of research on the symbiotic relationship between probiotics and the human body， the rapid discovery， isolation and screening of bacterial species， as well as the efficient control of the quality of probiotic products， all rely on the progress of detection and identification technologies. This article reviews the research progress of phenotypic and genotypic identification technologies and commonly used quantitative detection technologies. In recent years， researchers have gradually combined and applied a variety of detection technologies， provided multi-dimensional detection schemes， and conducted mutual verification， which has promoted the development of detection technology towards systematization， precision， efficiency and low cost. This article provides a reference for the daily detection research of probiotics.

Keywords： probiotic; identification; quantitative detection

1 益生菌的研究現(xiàn)狀

益生菌是對人體有益的微生物群體，能夠通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)、增強免疫功能、降低血清膽固醇、改善肥胖、延緩衰老和抗腫瘤等方式對人體健康發(fā)揮積極作用[1]。近年來，隨著檢測技術(shù)的不斷更新，益生菌與人體健康的關(guān)系及其作用機制得到了深入研究。例如，“腸-腦軸”和“腸-肝軸”等作用機制[2]的研究表明，由腸道細菌產(chǎn)生的小分子代謝物進入大腦后，能改變腦細胞功能，從而影響人的情緒和認知。因此，新技術(shù)的發(fā)展為益生菌和宿主的關(guān)系及相互影響機制的研究提供了新的可能。目前，益生菌類產(chǎn)品多以復合益生菌及益生菌+益生元等形式出現(xiàn)[3-5]，菌種多樣性和基質(zhì)復雜性成為益生菌檢測和鑒定面臨的新挑戰(zhàn)。

2 益生菌鑒定技術(shù)

細菌鑒定技術(shù)可用于食品中菌種的定性和溯源，對食品中益生菌質(zhì)量控制和監(jiān)管起重要作用。益生菌鑒定分為表型微生物鑒定方法和以基因組序列為基礎(chǔ)的基因型微生物鑒定法[6]。

2.1 表型微生物鑒定方法

傳統(tǒng)鑒定方法培養(yǎng)周期長，要用到很多生化試劑，且過程煩瑣，難以滿足快速檢測的需要。對于復合菌株而言，傳統(tǒng)鑒定方法難以鑒定相似種及亞種的菌株。傳統(tǒng)鑒定方法的優(yōu)點是成本低，僅需要簡單的顯微鏡等基本設(shè)備即可完成檢測和鑒定，因此大多數(shù)鑒定方法都要基于平板培養(yǎng)的方法對菌株進行初步分離、培養(yǎng)和收集[7-9]。

從手工操作的生化鑒定系統(tǒng)（如梅里埃的API微生物鑒定系統(tǒng)），到各種自動化生物鑒定設(shè)備的出現(xiàn)（如Biolog公司設(shè)計的Biolog微生物鑒定系統(tǒng)），再到與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)的應(yīng)用，檢測速度和效率較人工鑒定方法獲得了大幅度提升。例如，許再元[7]用生化鑒定系統(tǒng)鑒定雙歧桿菌發(fā)現(xiàn)，API鑒定系統(tǒng)只能在屬的水平上進行鑒定，在種水平上的鑒定則存在一定的局限，推測可能與雙歧桿菌生化反應(yīng)的多變性有關(guān)。Biolog微生物鑒定系統(tǒng)6.01版的厭氧數(shù)據(jù)庫已收錄雙歧桿菌屬的29個標準菌種，占該屬總數(shù)的91%[10]，但對于相似菌株的鑒定還有待提升。

MALDI-TOF MS通過檢測微生物中能穩(wěn)定表達的蛋白（如核糖體中的蛋白）來繪制特征指紋圖譜，將繪制出的特征指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫中已知指紋圖譜進行比對，從而實現(xiàn)快速鑒定。范鐵男等[11]研究發(fā)現(xiàn)，對單一菌株進行MALDI-TOF MS鑒定僅需不到15 min，對實驗中的79株菌株進行鑒定則僅需約5 h，說明該技術(shù)適用于益生菌的高通量鑒定及篩選。

組成生物體的各種分子基團因其化學結(jié)構(gòu)的不同，分子振動頻率也有所差異，從而導致吸收光譜和折射率譜不同。紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectrometer，F(xiàn)T-IR）技術(shù)和太赫茲時域光譜技術(shù)（Terahertz Time-Domain Spectroscopy，THz-TDS）[12]能夠在不損傷微生物的情況下，反映菌種DNA、RNA、多糖蛋白等分子的結(jié)構(gòu)差異。這些技術(shù)可作為菌種鑒定的輔助方法，但目前在益生菌菌種鑒定中的應(yīng)用較為少見。

酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-Linked ImmunoSorbent"Assay，ELISA）是一種免疫學和分子生物學中廣泛使用的實驗室技術(shù)。該技術(shù)基于抗原-抗體相互作用的原理，通過酶標記抗原并產(chǎn)生顯色反應(yīng)，從而實現(xiàn)目標分子的定量檢測，主要用于檢測生物樣品中的特定蛋白質(zhì)、肽、抗體或抗原。目前，該方法多用在臨床檢測[13-14]，在益生菌檢測方面的應(yīng)用較少[15]。

2.2 基因型微生物鑒定法

2.2.1 聚合酶鏈式反應(yīng)鑒定方法

聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是在DNA聚合酶和引物的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則進行DNA擴增的技術(shù)。對DNA進行擴增可得到高濃度的DNA分子，結(jié)合凝膠電泳和熒光信號等技術(shù)，如PCR-脈沖場凝膠電泳（PCR Pulsed Field Gel Electrophoresis，PCR-PFGE）、PCR-變形梯度凝膠電泳（PCR Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，PCR-DGGE）、熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）等，可對擴增的基因進行分離、鑒定和定量分析。

DNA的磷酸基團長度與電荷數(shù)相關(guān)，PCR-PFGE技術(shù)正是利用這一原理，將PCR擴增后的DNA分子置于電場加持下的無活性介質(zhì)凝膠中，使含有不同電荷數(shù)的DNA分子因移動速度的不同而得到分離。對于10 kb以上的大分子DNA片段，PCR-PFGE技術(shù)也能進行有效分離。例如，在雙歧桿菌的鑒定中，DURANTI等[16]結(jié)合多種方法和PCR-PFGE技術(shù)，成功地區(qū)分了各個種屬的雙歧桿菌；?R?TKOVá等[17]研究發(fā)現(xiàn)，利用PFGE方法可以提高菌種的鑒定正確率。

PCR-DGGE技術(shù)是在PCR-PFGE技術(shù)的基礎(chǔ)上，在電泳過程中梯度增加DNA解鏈變性劑，使DNA分子上不同位點的堿基對逐漸解鏈，變成長短不等的DNA分子，進而因攜帶電荷數(shù)不同在凝膠板上進一步分離。因此，PCR-DGGE可以把同樣長度但序列不同的DNA片段區(qū)分開來。REQUENA等[18]對16S rDNA序列的保守區(qū)域進行了PCR擴增，并結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)對糞便樣品中的雙歧桿菌進行了分離鑒定。

2.2.2 基因測序技術(shù)鑒定方法

基因測序技術(shù)以分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)，根據(jù)測序的位點，可以分為16S rRNA基因擴增子測序（16S rRNA技術(shù)）、多位點序列分析（Multilocus Sequence Analysis，MLSA）、全基因組測序等。根據(jù)測序效率，基因測序技術(shù)可分為第一代的Sanger測序技術(shù)和下一代的高通量測序技術(shù)。

16S rRNA是一種細菌和古菌中都具有的核糖體RNA片段，因此常用于細菌系統(tǒng)發(fā)育樹研究和分類鑒定[19]。16S rRNA基因不僅包含了菌種間基因表達相同的保守區(qū)，也包含了菌種間基因表達特異的高變區(qū)。16S rRNA的保守區(qū)可用于設(shè)計通用型引物；高變區(qū)常用于高通量測序以設(shè)計特異性擴增引物，通過與數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對，可將雙歧桿菌準確鑒定到種的水平，菌種的鑒定匹配率為99%～100%。段文鋒等[9]從市場中常見的19例益生菌乳粉中分離得到28株雙歧桿菌，利用16S rRNA技術(shù)對28株雙歧桿菌進行了菌株鑒定，建立了基于雙歧桿菌基因組序列的分子鑒定方法。然而，16S rRNA技術(shù)對于親緣關(guān)系比較近的菌種分辨率不高[20]。

MLSA是將基因序列進行串聯(lián)，增加有效信息位點數(shù)量，對難以區(qū)分的相似菌群進行鑒定的技術(shù)[21-22]。該技術(shù)常被用來研究物種間的遺傳和變異關(guān)系。江建平等[23]挑選12株可用于食品的雙歧桿菌，對7種管家基因的序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果顯示，采用MLSA技術(shù)得到的串聯(lián)系統(tǒng)發(fā)育樹與16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致，由于部分管家基因相比保守的16s rRNA有更高的分化程度，MLSA具有更高的分辨率。

高通量測序技術(shù)（Next Generation Sequencing，NGS）是在Sanger測序技術(shù)[24]基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新一代基因測序技術(shù)，能同時測定大量核酸分子的序列，彌補了Sanger測序技術(shù)在檢測效率方面的不足[25]。例如，多位點序列分型技術(shù)（Multilocus Sequence"Typing，MLST）依賴于物種全基因組序列數(shù)據(jù)庫和多位點序列分型數(shù)據(jù)庫的豐富物種信息[26]，而NGS可快速豐富相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫的信息。再如，在益生菌鑒定中，NGS技術(shù)通過DNA提取、片段化、擴增等操作實現(xiàn)全基因組測序，提高了物種特異性引物的設(shè)計效率[27-28]。因此，NGS可廣泛應(yīng)用于生物種群的分類研究[28-29]、特異性引物的制備及益生菌產(chǎn)品的合規(guī)性判斷[30]。陳衛(wèi)等[31]提出了一種基于高通量測序的雙歧桿菌快速檢測方法，該方法以groEL基因為篩選標記，采用NGS技術(shù)1 d內(nèi)可快速批量處理菌株信息，無須用傳統(tǒng)的生化分析法即可在亞種水平上對復雜樣品中的雙歧桿菌進行全面鑒定，分辨率高于16S rRNA技術(shù)，對菌種和亞種的鑒定準確率達100%。

3 益生菌的定量檢測方法

益生菌的傳統(tǒng)定量檢測方法有平板計數(shù)法和流式細胞計數(shù)法，目前新型的檢測方法多為基因?qū)用娴姆肿由飳W檢測方法，如PCR方法及其衍生出的相關(guān)方法。

3.1 平板計數(shù)法

在采用平板計數(shù)法定量檢測乳酸菌和雙歧桿菌時，培養(yǎng)基的選擇是影響菌種鑒定及準確定量的重要因素?！妒称钒踩珖覙藴?食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》（GB 4789.35—2023）中提到，乳酸菌主要為乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和嗜熱鏈球菌。對于嗜熱鏈球菌的計數(shù)，國際標準和相關(guān)文獻多推薦采用M17培養(yǎng)基來代替國家標準中的MC培養(yǎng)基[32-33]。ISO 7889：2003[34]中規(guī)定，用酸化MRS培養(yǎng)基對德氏乳桿菌保加利亞亞種進行分離計數(shù)，但該方法僅適用于發(fā)酵乳中只含有嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種的樣本，不具有普遍性。平板計數(shù)法只能在屬的層面進行計數(shù)，對于復合益生菌的分別計數(shù)具有局限性。

3.2 流式細胞計數(shù)法

流式細胞術(shù)利用氣壓使含有核酸熒光染料的細胞溶液從噴嘴噴出，形成單列細胞的液柱，同時利用激光技術(shù)讀取熒光值，最后采用數(shù)字處理系統(tǒng)自動計數(shù)[35-36]。熒光染料只能穿過破損的細胞膜，不能進入完整的細胞膜，因此流式細胞術(shù)可對活細胞和死細胞分別計數(shù)[37-38]。與平板計數(shù)法相比，流式細胞術(shù)在計數(shù)的基礎(chǔ)上多了篩選活細胞這一優(yōu)勢，但是仍然做不到對復合菌株的分開計數(shù)。近年來，流式細胞計數(shù)法在益生菌定量檢測領(lǐng)域應(yīng)用的研究較少，可能是因為對不同菌種甚至菌株篩選特異性染料的難度較大。

3.3 PCR及其衍生技術(shù)

PCR是一種常用的基因片段指數(shù)擴增方法，先借基因測序技術(shù)獲得高特異性和可靠的引物和探針，可對不同菌株分開計數(shù)。目前，PCR定量檢測技術(shù)是發(fā)展和應(yīng)用的重點。

3.3.1 熒光定量PCR

熒光定量PCR（Quantitative Real-time，qPCR）技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，根據(jù)擴增產(chǎn)物發(fā)出的熒光強度與擴增次數(shù)的關(guān)系曲線，來計算原溶液中目標菌株的含量。DESFOSSéS-FOUCAULT等[39]用qPCR法定量檢測奶酪中復合益生菌的含量，研究發(fā)現(xiàn)在6個稀釋度的范圍內(nèi)，所有菌種的qPCR引物的擴增效率均在99.4%～101.9%，菌種標準曲線R2值均大于0.99。

（1）TaqMAN探針熒光定量PCR。TaqMAN探針是一種同時攜帶熒光基團和猝滅集團的特異性寡核苷酸，在PCR反應(yīng)體系中用于與目標DNA序列的互補配對。隨著反應(yīng)的進行，與目標DNA配對的TaqMAN探針會釋放出熒光信號，根據(jù)探針濃度與熒光信號的強弱關(guān)系，可對目標基因進行定量檢測。TaqMAN-qPCR技術(shù)可以在同一反應(yīng)體系內(nèi)完成對多種目標基因的檢測。在益生菌的定量檢測方面，趙一蘋等[40]使用TaqMan-小溝結(jié)合物探針（Minor Groove Binder，MGB）結(jié)合熒光定量PCR對酸奶制品中動物雙歧桿菌BB-12進行定量檢測，靈敏度低至0.05 pg·mL-1。王虹等[41]采用TaqMAN-qPCR對腸道菌群樣品中3類細菌數(shù)量和細菌總量分別進行了計數(shù)。雖然TaqMAN-qPCR僅能在科和屬的層面進行定量，但該技術(shù)能同時定量檢測多種益生菌，對食品行業(yè)日常檢測效率的提升具有參考意義。

（2）疊氮溴化丙錠（Propidium Monoazide，PMA）熒光定量PCR。PMA是一種與DNA有高親和力的染料，能進入死亡或外膜嚴重損傷的細胞內(nèi)，在可見光的參與下，與DNA發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生熒光信號，并抑制死細胞中DNA參與PCR擴增。因此，PMA-qPCR不僅可以判斷細胞膜受損的死菌的濃度，還可以結(jié)合qPCR測出活菌的濃度。韓之皓等[42]研究發(fā)現(xiàn)，PMA質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1，暗孵育時間為10 min，曝光時間為20 min時，PMA既不影響活菌DNA的PCR擴增，又能滲透進入細胞膜受損的死菌并抑制其PCR擴增，最低檢測限為103 CFU·mL-1。DESFOSSéS-FOUCAULT等[39]研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)平板計數(shù)法相比，PMA-qPCR的定量檢測結(jié)果更準確。

3.3.2 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）技術(shù)被認為是第3代核酸擴增技術(shù)，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，并分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元DNA分子的數(shù)量為1或0，基于單分子PCR實現(xiàn)核酸的絕對定量。與qPCR相比，dPCR不需要標準曲線，準確度更高。

微滴式數(shù)字PCR（Droplet Digital PCR，ddPCR）是將稀釋到一定濃度的DNA分子分配到10 000～20 000個微滴中，通過PCR擴增和陽性信號的累積，讀取陽性反應(yīng)單元數(shù)和陰陽性單元的比例，根據(jù)泊松分布計算出樣本中的DNA分子數(shù)。李恩靜等[43]應(yīng)用ddPCR技術(shù)準確定量了7種雙歧桿菌菌株，計數(shù)過程沒有被10種近源乳桿菌及嗜熱鏈球菌干擾。該方法與平板計數(shù)的結(jié)果相差不超過0.5 lgCFU·g-1，偏差小于10%，方法定量限為10-6 CFU·g-1，實驗樣品檢出值為106 CFU·g-1，可滿足日常菌種含量測試的要求。

3.3.3 環(huán)介導等溫擴增

環(huán)介導等溫擴增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一種類似于PCR的目標基因擴增方法，一般用于定性檢測。通過實時濁度檢測儀檢測LAMP反應(yīng)過程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂沉淀的濁度，結(jié)合標準曲線可實現(xiàn)定量檢測。范一靈等[44]采用該方法在60 min內(nèi)完成了雙歧桿菌屬細菌的DNA檢測，檢測限為（16.1±8.2）pg·μL-1，對雙歧桿菌屬細菌菌體的檢測限為0.1 CFU·mL-1。然而，LAMP一次只能檢測一種基因，因此在物種準確鑒定、目標基因制備成本控制、標準曲線準確度提升等方面仍需改進，以便更廣泛地應(yīng)用于日常檢測。

4 結(jié)語

綜上所述，明確各種鑒定技術(shù)的特點和優(yōu)勢，結(jié)合多種檢測技術(shù)，提供多維度的檢測方案并進行相互驗證，可推動檢測技術(shù)向系統(tǒng)化、精準化、高效化和低成本化方向發(fā)展。隨著技術(shù)的進步，益生菌檢測時面臨的菌種多樣性和基質(zhì)復雜性等問題，有望得到靈活有效的解決。

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