摘 要：本文建立了高效液相色譜檢測玉米及其制品中黃曲霉毒素B1含量的方法。試樣用甲醇-水溶液渦旋振蕩提取，提取液經(jīng)免疫親和柱凈化，氮吹濃縮，供高效液相色譜-熒光檢測器測定。結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1在0.1～20.0 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法檢出限為0.02 μg·kg-1，定量限為0.05 μg·kg-1，加標(biāo)回收率在89.0%～98.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.24%～4.39%。本方法適用于玉米及其制品中黃曲霉毒素B1含量的檢測。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；玉米；黃曲霉毒素B1

Detection of Aflatoxin B1 Content in Corn and Its Products by High-Performance Liquid Chromatography

Abstract： A method for detecting aflatoxin B1 content in corn and its products using high-performance liquid chromatography has been established in this paper. The sample was extracted by vortex oscillation with methanol water solution， and the extract was purified by an immunoaffinity column and concentrated by nitrogen blowing for determination by high-performance liquid chromatography fluorescence detector. The results showed that aflatoxin B1 had a good linear relationship in the range of 0.1～20.0 ng·mL-1， with a detection limit of 0.02 μg·kg-1 and a quantification limit of 0.05 μg·kg-1. The recovery rate was within the range of 89.0%～98.7%， and the relative standard deviation was 1.24%～4.39%. This method is applicable for the detection of aflatoxin B1 content in corn and its products.

Keywords： high-performance liquid chromatography; corn; aflatoxin B1

黃曲霉毒素是一種由黃曲霉代謝產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，其中黃曲霉毒素B1的毒性最強(qiáng)，具有高致癌性，世界衛(wèi)生組織將其定為Ⅰ類致癌物[1]。玉米是一種適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高的糧食作物，在我國栽培歷史悠久、分布范圍很廣，播種面積僅次于水稻、小麥，總產(chǎn)量則在糧食作物中居于首位[2]。玉米中富含蛋白質(zhì)、維生素、纖維素和多種微量元素，一直被譽(yù)為長壽食品，也是油料和飼料的重要來源[3]。然而，玉米這種主要的糧食作物受黃曲霉毒素B1污染也最為嚴(yán)重，因此，加強(qiáng)對玉米及其制品中黃曲霉毒素B1含量的監(jiān)管檢測，對保障糧食和飼料安全非常重要。本研究參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.22—2016）[4]第三法中高效液相色譜法（無衍生器法），建立了高效液相色譜法檢測玉米及其制品中黃曲霉毒素B1含量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜（配大流通池?zé)晒鈾z測器），美國沃特世公司；GL2202-1SCN分析天平（精度0.01 g），德國賽多利斯公司；XH-S旋渦混合器，無錫杰瑞安儀器公司；Multi Reax多管旋渦振蕩器，德國海道爾夫公司；TG16G臺式高速離心機(jī)，常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠；ASE-12固相萃取裝置，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；HSC-B水浴氮吹儀，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；移液器（1 mL、10 mL）移液器，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 材料與試劑

玉米、玉米糝，購自某農(nóng)貿(mào)市場；乙腈中黃曲霉毒素B1（編號91661c，濃度10 μg·mL-1），壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），德國默克公司；氯化鈉（分析純）、氯化鉀（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸氫二鉀（分析純）、鹽酸（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Triton X-100（化學(xué)純），上海酶聯(lián)生物科技有限公司；黃曲霉毒素B1免疫親和柱，北京泰樂祺科技有限公司。

磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）：準(zhǔn)確稱取4.00 g氯化鈉、0.60 g磷酸二氫鈉、0.10 g磷酸二氫鉀、0.10 g氯化鉀于燒杯中，用450 mL超純水溶解，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，全部轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，定容至刻度。

1%Triton X-100的PBS：準(zhǔn)確吸取5.0 mL1%Triton X-100，用PBS定容至500 mL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)中間液配制。準(zhǔn)確吸取0.25 mL濃度為10 μg·mL-1的乙腈中黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容至刻度，搖勻，配制得100 ng·mL-1的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)中間液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液配制。分別吸取0.01 mL、0.05 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL濃度為100 ng·mL-1的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)中間液于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋定容至刻度，搖勻，配制得濃度為0.1 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液。

1.4 樣品處理過程

（1）試樣提取。稱取5 g（精確至0.01 g）經(jīng)粉碎后粒徑小于2 mm的試樣于50 mL具塞離心管中，加入20 mL甲醇-水溶液（70+30），使用旋渦混合器渦旋1 min，混勻后置于多管旋渦振蕩器上渦旋振蕩20 min，6 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液備用。

（2）凈化測定。準(zhǔn)確移取4.0 mL上清液于比色管中，加入23 mL 1%Triton X-100的PBS，混勻。從冰箱冷藏室中取出免疫親和柱，待恢復(fù)至室溫，將免疫親和柱中液體放棄后，連接在50 mL注射器套管上，將混勻后的試液轉(zhuǎn)移入注射器中，連接至固相萃取裝置上，調(diào)節(jié)真空泵使樣液以1～3 mL·min-1的流速下滴。待樣液滴完后，加入10 mL超純水淋洗免疫親和柱并重復(fù)一次，超純水滴完后調(diào)節(jié)真空泵抽干小柱。關(guān)閉真空泵，取下注射器，往免疫親和柱中加入1 mL甲醇，控制以1～3 mL·min-1的流速洗脫親和柱，用玻璃刻度試管接收洗脫液，并重復(fù)一次，最后抽干親和柱，將全部洗脫液并入刻度試管中。將玻璃試管置于水溫50 ℃的氮吹儀上，緩緩?fù)ㄈ氲獨(dú)獯抵两?，用流?dòng)相定容至1.0 mL，渦旋混勻后過0.22 μm濾膜，收集濾液上機(jī)測試。

1.5 儀器工作條件

色譜柱：Waters BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）；流動(dòng)相：水∶乙腈+甲醇（50+50，V/V）=65∶35；洗脫程序：等度洗脫；流速：0.30 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測器：熒光檢測器（大流通池），激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長436 nm；進(jìn)樣量：3.0 μL；根據(jù)保留時(shí)間定性，色譜峰面積比較定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離效果

將配制的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按照本研究中儀器條件上機(jī)測試，色譜圖如圖1。黃曲霉毒素B1色譜峰尖銳對稱，流動(dòng)相中的溶劑峰、雜質(zhì)峰也未對目標(biāo)峰產(chǎn)生干擾，可以準(zhǔn)確進(jìn)行黃曲霉毒素B1的定性定量分析。

2.2 方法的線性關(guān)系與檢出限

將配制的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液按照本研究中儀器條件上機(jī)測試，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中黃曲霉毒素B1的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，測得目標(biāo)峰的色譜峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，獲得的線性回歸方程為Y=1.172×104X，相關(guān)系數(shù)R為0.999 9，由此看出黃曲霉毒素B1在0.1～20.0 ng·mL-1線性關(guān)系良好。稱取5.00 g陰性樣品，添加0.25 mL濃度為2.0 ng·mL-1的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4試樣處理過程，最終定容體積為1.0 mL，按照1.5儀器工作條件上機(jī)測試，以黃曲霉毒素B1色譜峰的信噪比S/N≥3對應(yīng)濃度為方法檢出限、信噪比S/N≥10對應(yīng)濃度為方法定量限，獲得方法檢出限為0.02 μg·kg-1，定量限為0.05 μg·kg-1，滿足GB 5009.22—2016第三法中高效液相色譜法（無衍生器法）的要求。

2.3 方法的準(zhǔn)確度與精密度

稱取經(jīng)本研究中方法檢測不含黃曲霉毒素B1的陰性玉米及玉米糝樣品（本底值為0 μg·kg-1），分別添加低（0.05 μg·kg-1）、中（5.00 μg·kg-1）、高（20.00 μg·kg-1）3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4試樣處理過程，在1.5儀器工作條件上機(jī)測試，每個(gè)水平加標(biāo)樣品平行測定6次，考察方法的準(zhǔn)確度（以加標(biāo)回收率表示）與精密度（以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示），結(jié)果見表1。玉米及玉米糝樣品中黃曲霉毒素B1的加標(biāo)回收率在89.0%～98.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.24%～4.39%，方法的準(zhǔn)確度與精密度滿足《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）[5]的規(guī)定。

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜法（無衍生器法）檢測玉米及其制品中黃曲霉毒素B1含量的分析方法，經(jīng)試驗(yàn)表明，黃曲霉毒素B1色譜峰尖銳對稱、分離效果較好，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R＞0.999，方法檢出限為0.02 μg·kg-1，定量限為0.05 μg·kg-1，加標(biāo)回收率在89.0%～98.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.24%～4.39%，均符合GB 5009.22—2016與GB/T 27404—2008中的規(guī)定，可以滿足食品檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)及相關(guān)企業(yè)對玉米及其制品中黃曲霉毒素B1含量的檢測需求。

參考文獻(xiàn)

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[4]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定：GB 5009.22—2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[5]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測：GB/T 27404—2008[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.