摘要 ［目的］以絲瓜（Luffa ssp.）品種“徐綠一號(hào)”的未授粉子房為試驗(yàn)材料，分析不同因素對(duì)類胚體形成的影響。［方法］設(shè)置L16（215）正交試驗(yàn)分析子房發(fā)育階段、4 ℃預(yù)冷處理、35 ℃黑暗熱激處理、TDZ、6-BA、ABA、NAA、2，4-D對(duì)絲瓜離體子房培養(yǎng)獲得類胚體的影響。［結(jié)果］不同因素對(duì)子房片的發(fā)育過程具有不同的效果，其中采集當(dāng)天開放的雌花、4 ℃預(yù)冷處理、在MS培養(yǎng)基中添加0.04 mg/L TDZ對(duì)子房片的類胚體形成具有促進(jìn)作用，添加0.04 mg/L 2，4-D對(duì)絲瓜子房類胚體形成具有抑制作用，但可以促進(jìn)子房片生根；另外預(yù)冷處理與TDZ、TDZ與雌花采集時(shí)間、4 ℃預(yù)冷和ABA的兩兩交互作用對(duì)絲瓜類胚體的形成也具有顯著影響。［結(jié)論］有效形成絲瓜子房類胚體途徑：當(dāng)天采集子房+4 ℃預(yù)冷處理+0.04 mg/L TDZ。

關(guān)鍵詞 絲瓜；離體子房；類胚體；單倍體；TDZ

中圖分類號(hào) S642.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）21-0044-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.21.009

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Induction Study on the Pathway of Embryoid Formation in Ovary Culture of Luffa ssp.

YAN Le-long， HUANG Yao， NI Wei-chen et al

（Nanjing Agricultural University （Changshu） New Rural Development Research Institute Co.， Ltd.， Suzhou，Jiangsu 215500）

Abstract ［Objective］To analyze the effects of different factors on embryoid formation using unpollinated ovaries of Luffa ssp. cultivar ‘Xulv No.1’ as experimental material. ［Method］ An L16（215） orthogonal test was set up to analyze the effects of ovary collection time， 4 ℃ cold pretreatment， 35 ℃ dark heat shock treatment， TDZ hormone， 6-BA hormone， ABA hormone， NAA hormone and 2，4-D hormone on embryoid formation in vitro cultured Luffa ssp. ovaries. ［Result］Different factors had different effects on the development process of ovary slices. Among them， collecting female flowers that opened on the same day and adding TDZ hormone to MS medium had a promoting effect on embryoid formation in ovary slices. However， 2，4-D hormone had an inhibitory effect on embryoid formation in Luffa ssp. ovaries but could promote rooting of ovary slices. In addition， the interaction between 4 ℃ cold pretreatment and TDZ hormone and between TDZ hormone and female flower collection time also had a significant effect on embryoid formation in Luffa ssp.. ［Conclusion］The effective way to form embryoids from Luffa ssp. ovaries is： collecting ovaries on day of flowering+4 ℃ cold pretreatment+0.04 mg/L TDZ hormone induction in vitro.

Key words Luffa ssp.;In vitro ovary;Embryoid;Haploid；TDZ

基金項(xiàng)目 江蘇省自主創(chuàng)新項(xiàng)目（CX202204）；常熟市科技項(xiàng)目（CN20-2204）。

作者簡(jiǎn)介 顏樂龍（1998—），男，湖南茶陵人，碩士，從事單倍體誘導(dǎo)技術(shù)研究。*通信作者，教授，博士，從事單倍體育種研究。

收稿日期 2023-12-17

絲瓜（Luffa aegyptiaca Miller）為葫蘆科（Cucurbitaceae）絲瓜屬（Luffa Mill.）一年生草本植物，其嫩瓜含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、氨基酸等物質(zhì)，具有保健和美容的作用［1］；老瓜或藤蔓可用藥，亦可加工，具有特殊的藥用和工業(yè)價(jià)值［2］。絲瓜在我國(guó)南北均有種植，主要栽培種有普通絲瓜和有棱絲瓜2個(gè)類型［3］。近年來，絲瓜市場(chǎng)需求量不斷增大，對(duì)絲瓜不同品種的需求也在擴(kuò)大。

由于F1代的雜合特性，導(dǎo)致F1品種具有較高的產(chǎn)量和活力。因此市場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)品種都是F1，而F1代通過不同純系品種雜交而來。目前獲得純系的方法有2個(gè)，分別為傳統(tǒng)自交和DH技術(shù)［4］。而傳統(tǒng)的多年自交獲得自交系成本高、時(shí)間長(zhǎng)，這種育種方式限制了現(xiàn)代絲瓜育種的需求［5］。而通過單倍體誘導(dǎo)技術(shù)結(jié)合染色體加倍技術(shù)獲得基因型純合的雙單倍體（DH）能縮短育種時(shí)間［6］。

創(chuàng)制葫蘆科作物單倍體的方式主要有3種：輻射花粉授粉結(jié)合胚培養(yǎng)技術(shù)、離體子房/胚珠培養(yǎng)、花藥/花粉培養(yǎng)［7］。通過這些手段已在甜瓜［8-9］、黃瓜［10］、南瓜［11］、西瓜［12］等作物上獲得了單倍體。且在甜瓜作物上已有利用單倍體誘導(dǎo)技術(shù)培育新品種的報(bào)道［13］。單倍體育種能在較短的育種周期內(nèi)純化性狀，加速育種進(jìn)程。因此，構(gòu)建絲瓜離體子房再生培養(yǎng)體系能加速絲瓜新品種培育。

筆者借鑒其他葫蘆科作物（黃瓜、甜瓜等）的離體子房培養(yǎng)體系，以“徐綠1號(hào)”為材料，研究不同因素如子房發(fā)育階段［9］、4 ℃預(yù)冷［10］、35 ℃黑暗熱激以及不同種類激素對(duì)絲瓜離體子房培養(yǎng)獲得類胚體和根形成的影響［14］，旨在構(gòu)建一條有效的絲瓜離體子房培養(yǎng)獲得類胚體途徑，為后續(xù)的絲瓜離體子房獲得單倍體研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為“徐綠1號(hào)”，為常熟地方品種“徐筒玉”高代自交系和自選品系“LZ88”高代自交系雜交一代［15］，由南農(nóng)大（常熟）新農(nóng)村發(fā)展研究院有限公司提供。于2022年9—11月種植于常熟市農(nóng)科所的連棟大棚內(nèi)。

1.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)涉及8個(gè)因素：子房發(fā)育階段、35 ℃黑暗熱激、4 ℃預(yù)冷處理、激素TDZ、6-BA、NAA、ABA、2，4-D，每個(gè)因素選取2水平進(jìn)行 L16（215）正交試驗(yàn)，共16個(gè)處理（表 1），每個(gè)處理 3 次重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 R語言進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

根據(jù)表1的16種處理進(jìn)行隨機(jī)試驗(yàn)。于絲瓜植株的第二朵雌花盛開時(shí)開始采集子房，選擇當(dāng)天開花的雌花（圖1b）或前1 d開始采集子房（圖1a）。根據(jù)不同處理的要求對(duì)子房進(jìn)行4 ℃預(yù)冷（1 d）處理；消毒處理：洗潔精清洗表面絨毛，流水沖洗15 min，75%乙醇消毒30 s，1 %的次氯酸鈉溶液中浸泡8～9 min（視子房大小調(diào)整浸泡時(shí)間），無菌水反復(fù)沖洗4～5次，最后用無菌濾紙吸干表面水分；對(duì)消毒好的子房進(jìn)行橫向切割，子房切片厚度為1～2 mm（圖1d），子房切片接種在已添加不同激素種類的MS培養(yǎng)基（4.74 g/L MS+蔗糖30 g/L+瓊脂2.5 g/L，pH 5.8～6.0）上進(jìn)行培養(yǎng)；之后進(jìn)行35 ℃黑暗熱激或不進(jìn)行處理（其中黑暗熱激處理3 d），然后轉(zhuǎn)入25 ℃、光照強(qiáng)度2 000 lx、16 h/8 h（光/暗）條件下培養(yǎng)［6］。

類胚體發(fā)生比例=類胚發(fā)生子房數(shù)量 /外植體總數(shù)

再生根形成比例=形成根的子房數(shù) /子房培養(yǎng)數(shù)

1.3 再生根的倍性鑒定

子房切片培養(yǎng)60 d后，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行取根，然后使用流式細(xì)胞儀鑒定再生根的倍性。

流式細(xì)胞儀鑒定倍性：取少量幼嫩根組織，置于預(yù)冷的培養(yǎng)皿中，加入緩沖液A，并用解剖刀將材料切碎，置于冰上繼續(xù)裂解。裂解10 min后使用40 μm細(xì)胞篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，加入碘化丙錠和RNase，避光。使用BECKMAN流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 子房切片產(chǎn)生類胚體和根

黑暗熱激影響子房切片表面顏色。對(duì)采集的子房進(jìn)行切片培養(yǎng)后，按照不同處理組合對(duì)外植體放置35 ℃暗環(huán)境或直接放置光照環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。在接種培養(yǎng)3～7 d后，子房切片表面開始形成“隆起物”（圖2a、2b），此時(shí)子房開始啟動(dòng)發(fā)育，而形成的“隆起物”為開始發(fā)育的類胚體。但不同培養(yǎng)條件下的子房切片表面的顏色不同，其中直接放置于自然光環(huán)境下的子房切片呈深綠色（圖2a），而經(jīng)過35 ℃熱激暗培養(yǎng)的子房切片呈黃綠色（圖2b）。培養(yǎng)15 d后，類胚體漸漸形成串狀的形態(tài)（圖2d）。將含有類胚體的切片轉(zhuǎn)至胚分化培養(yǎng)基上后，出現(xiàn)了黃化、發(fā)育停止的現(xiàn)象。培養(yǎng)60 d后，接種在含有0.75 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基的子房切片開始逐漸出現(xiàn)根（圖2c）。

2.2 不同處理對(duì)根形成和類胚體的影響

由圖3可知，不同處理類胚體和根的形成都有顯著差異。其中處理①、處理②、處理⑦、處理⑧、處理B11、處理B12、處理B13、處理B14對(duì)根的形成具有積極影響；其余處理對(duì)根的形成幾乎沒有效果（圖3a）。不同處理對(duì)類胚體的形成也有不同的效果，其中處理③對(duì)類胚體形成促進(jìn)效果最佳（圖3b）。同時(shí)，觀察（圖3a）發(fā)現(xiàn)，不同處理在類胚體的形成與根的形成上呈現(xiàn)相反的分布，且二者的相關(guān)系數(shù)為-0.49。為了解造成這種分布的差異，對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行了單因素方差分析。

2.3 不同因素對(duì)根形成和類胚體形成的影響

由圖4和圖5可知，子房發(fā)育階段（圖4、5a）、4 ℃預(yù)冷（圖4、5b）、35 ℃黑暗熱激（圖4、5c）、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加TDZ（圖4、5d）、6-BA（圖4、5e）、ABA（圖4、5f）、NAA（圖4、5g）和2，4-D（圖4、5h）激素對(duì)絲瓜子房生根影響具有差異，只有添加0.04 mg/L 2，4-D激素的培養(yǎng)基可以有效誘導(dǎo)絲瓜生根，其他未添加2，4-D的培養(yǎng)基較難誘導(dǎo)形成根系。因此，在絲瓜子房離體培養(yǎng)過程中MS培養(yǎng)基中添加2，4-D能有效誘導(dǎo)根系的產(chǎn)生。

在類胚體形成過程中，4 ℃預(yù)冷、培養(yǎng)基中添加NAA和2，4-D對(duì)該過程均有顯著影響。在培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)素類激素（NAA、2，4-D）和ABA激素對(duì)類胚體的誘導(dǎo)具有負(fù)向作用，而TDZ對(duì)類胚體的誘導(dǎo)具有正向作用。對(duì)比（圖4h）和（圖5h），發(fā)現(xiàn)2，4-D激素在根誘導(dǎo)和類胚體誘導(dǎo)上存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。此外4 ℃預(yù)冷也能提高類胚體誘導(dǎo)效率。

2.4 不同因素的交互作用對(duì)根形成和類胚體形成的影響

除探究單因素對(duì)絲瓜子房切片的影響外，還分析了不同因素間的交互作用（圖6）；發(fā)現(xiàn)5個(gè)因素（子房發(fā)育階段、4 ℃預(yù)冷、TDZ激素、ABA激素、35 ℃暗培養(yǎng)）之間的交互作用對(duì)子房片的發(fā)育具有影響。在根發(fā)育過程中，子房的采集時(shí)間與35 ℃熱激對(duì)子房片的發(fā)育具有顯著影響（圖6a）。在類胚體形成過程中（子房發(fā)育階段、TDZ激素、4 ℃預(yù)冷、ABA激素）多個(gè)因素之間的交互作用顯著。其中，4 ℃預(yù)冷因素在顯著的兩兩交互項(xiàng)中出現(xiàn)3次，TDZ激素出現(xiàn)2次，這提示這二者是關(guān)鍵因素，因此在改進(jìn)試驗(yàn)中要考慮這二者之間的因素水平的關(guān)系。子房外植體類胚體的誘導(dǎo)是通過子房發(fā)育形成單倍體或雙單倍體植株的第一步，其誘導(dǎo)效果影響后續(xù)再生植株形成的效率。絲瓜類胚體誘導(dǎo)的途徑：雌花開花當(dāng)天采集子房+4 ℃預(yù)冷處理+ 0.04 mg/L TDZ。

2.5 再生根的倍性鑒定

只有添加0.75 mg/L 2，4-D的處理（處理①、②、⑦、⑧、B11、B12、B13、B14）才能誘導(dǎo)產(chǎn)生根系，其中處理②的根系是從子房切片中心長(zhǎng)出，故產(chǎn)生單倍體根系可能性更大。對(duì)處理②全部取樣，其他7個(gè)處理隨機(jī)挑選10個(gè)子房切片切取根系進(jìn)行倍性鑒定，并以正?！靶炀G一號(hào)”二倍體的根作為對(duì)照。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，在對(duì)照（圖7a）中首個(gè)呈現(xiàn)正態(tài)分布的峰熒光強(qiáng)度為 100左右，故單倍體的首個(gè)呈現(xiàn)正態(tài)分布的峰熒光強(qiáng)度則為50左右（圖7c），在鑒定樣本中出現(xiàn)了單倍體、二倍體以及不同類型的混倍體，其中只有處理②得到了2株單倍體。

3 討論

離體培養(yǎng)時(shí)胚囊的發(fā)育狀態(tài)是子房發(fā)育形成胚的關(guān)鍵因素，胚囊接近成熟或完全成熟時(shí)才具有較高的潛力開始發(fā)育［16］。Zou等［17-18］比較了黃瓜雌花不同發(fā)育階段對(duì)胚形成的影響，發(fā)現(xiàn)完全發(fā)育的胚囊子房（開花當(dāng)天）是雌核發(fā)育最優(yōu)的外植體，這與西瓜離體子房培養(yǎng)一致 。同樣在南瓜和冬瓜的離體子房研究中，也認(rèn)為使用處于花期的子房可獲得最高的胚誘導(dǎo)率［11］。該研究設(shè)置了2種不同的子房采集期（開花前1 d和開花當(dāng)天），結(jié)果表明開花當(dāng)天采集的子房形成的類胚體數(shù)量顯著高于開花前1 d，這與前人的研究結(jié)果一致。

一些非生物因素的脅迫作用如冷脅迫、暗培養(yǎng)、饑餓處理對(duì)離體子房培養(yǎng)具有刺激作用［5］。脅迫處理可以改變配子體發(fā)育途徑進(jìn)入孢子體發(fā)育途徑以形成單倍體的胚或植株［19］。4 ℃預(yù)冷處理不僅可以促進(jìn)離體子房的類胚體發(fā)生數(shù)量［20］，也可以提高小孢子培養(yǎng)的胚形成效率［21］。Deng等［10］認(rèn)為子房4 ℃預(yù)冷4 d可有效提高黃瓜子房離體培養(yǎng)中胚的發(fā)生數(shù)量；而Pazuki等［20］認(rèn)為甜菜花序預(yù)冷7 d可有效提高體胚發(fā)生數(shù)量。而該研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)冷1 d再進(jìn)行離體培養(yǎng)，類胚體的發(fā)生數(shù)量顯著提高。

該研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中0.04 mg/L TDZ對(duì)絲瓜類胚體的形成具有顯著的積極效應(yīng)，Diao等［22］認(rèn)為TDZ對(duì)胚的形成具有正向作用。Deng等［10］研究發(fā)現(xiàn)黃瓜子房在MS+0.04 mg/L TDZ可以直接形成再生植株。在南瓜離體子房培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)基中附加0.04～0.06 mg/L TDZ能誘導(dǎo)離體子房直接產(chǎn)生再生植株。此外，Kurtar等［11，14］認(rèn)為在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中增加低劑量的TDZ可明顯提高南瓜和黃瓜子房形成類胚體的數(shù)量。2，4-D也被用于離體子房培養(yǎng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基［23-24］。Metwally等［25］認(rèn)為在培養(yǎng)基中添加1～5 mg/L 2，4-D可以提高西葫蘆子房培養(yǎng)的再生植株數(shù)量。Rakha等［26］研究發(fā)現(xiàn)2，4-D可以促進(jìn)花藥培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)形成再生植株的數(shù)量。相反，Kielkowska等［27］研究發(fā)現(xiàn)2，4-D會(huì)抑制胚的形成。該研究結(jié)果表明，2，4-D抑制類胚體的形成但促進(jìn)根的發(fā)育。因此，2，4-D是導(dǎo)致該研究中生根率與類胚體率呈負(fù)相關(guān)（-0.49）的原因。

不同因素的交互作用也在一些研究中有過報(bào)道［10，12］ 。Zou等［12］研究發(fā)現(xiàn)基因型和誘導(dǎo)培養(yǎng)基之間的交互作用對(duì)類胚體的形成具有重要影響。而Deng等［10］也認(rèn)為4 ℃預(yù)冷和TDZ激素之間的交互作用顯著，這與該研究結(jié)果一致。

該研究并未在試驗(yàn)中獲得完整的植株（類胚體在轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基后黃化死亡），認(rèn)為類胚體的死亡原因：①類胚體的質(zhì)量不佳（約2/3類胚體顏色呈黃綠色），可能與培養(yǎng)基的滲透壓有關(guān)；②基因型依賴性，研究?jī)H使用了1種絲瓜品種，可能是“徐綠一號(hào)”對(duì)于離體培養(yǎng)的過程不敏感；③絲瓜本身對(duì)離體培養(yǎng)具有抑制性。這可能是目前沒有通過孤雌生殖誘導(dǎo)成功絲瓜單倍體的原因。該研究獲得了2個(gè)進(jìn)展，即通過鑒定再生根為單倍體，表明通過離體子房培養(yǎng)可以啟動(dòng)絲瓜卵細(xì)胞啟動(dòng)發(fā)育，并分化形成了單倍體的器官；子房發(fā)育階段、TDZ、4 ℃預(yù)冷對(duì)類胚體的形成影響較大。

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