摘要 芽孢桿菌屬在煙葉發(fā)酵和醇化的過程中起到了十分重要的作用。綜述了煙葉發(fā)酵和醇化過程中細菌群落的研究進展，對芽孢桿菌屬在協(xié)調煙葉化學成分、增加煙葉香氣物質含量、改善煙葉感官質量、縮短發(fā)酵醇化時間和抑制煙葉霉變等方面的應用研究現(xiàn)狀進行了總結，并對芽孢桿菌屬在雪茄煙葉發(fā)酵過程中的研究方向及應用進行了展望，以期為應用芽孢桿菌菌劑提升國產(chǎn)雪茄煙葉品質提供參考。

關鍵詞 芽孢桿菌；煙葉發(fā)酵；煙葉醇化

中圖分類號 TS41+4 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）21-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.21.001

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research Progress on Application of Bacillus in Fermentation and Alcoholization of Tobacco Leaves

ZHAO Liang1，JU Shao-xuan2，SHI Xiang-dong2 et al

（1.Zhejiang Tobacco Industry Co.，Ltd.Technology Center，Hangzhou，Zhejiang 310024;2.Key Laboratory of Tobacco Industry Cultivation，Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan 450046）

Abstract Bacillus plays an important role in the fermentation and alcoholization of tobacco leaves.In this paper，the research progress of bacterial community in the process of tobacco leaf fermentation and aging was reviewed.The application of Bacillus in coordinating the chemical composition of tobacco leaves，increasing the content of aroma substances in tobacco leaves，improving the sensory quality of tobacco leaves，shortening the time of fermentation and aging，and inhibiting the mildew of tobacco leaves were summarized.The research direction and application of Bacillus in the fermentation process of cigar tobacco leaves were prospected，in order to provide reference for the application of Bacillus agents to improve the quality of domestic cigar tobacco leaves.

Key words Bacillus;Tobacco fermentation;Tobacco alcoholization

基金項目 浙江中煙工業(yè)有限責任公司科技計劃項目（QG/ZY-SK-005/06）。

作者簡介 趙亮 （1983—），男，江西玉山人，工程師，碩士，從事雪茄煙產(chǎn)品技術研究。*通信作者，工程師，從事雪茄煙產(chǎn)品開發(fā)及技術管理研究。

收稿日期 2023-11-23

發(fā)酵和醇化是煙葉生產(chǎn)加工過程中不可或缺的環(huán)節(jié)，不僅可以改善烤煙煙葉品質［1］，提高卷煙質量，還對雪茄煙葉和雪茄成品質量起到重要的作用［2］。通過發(fā)酵和醇化，不同種類煙葉內在化學成分更協(xié)調，致香物質增ZQ7RkGk2skEx4OFpEGdCT5OTnzGFVClyLAKNXZNIOv8=加，雜氣和刺激性下降，燃燒性改善，香氣更加顯露，工業(yè)可用性提高［3-4］。一般認為煙葉發(fā)酵機理主要包括酶作用［5］、微生物作用［6-8］和化學作用［9］。研究表明，煙葉發(fā)酵和醇化過程中，葉面微生物分解煙葉中的大分子物質，通過一系列物理和化學變化，改善了煙葉品質［10-11］。隨著葉面微生物研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)細菌種類的多樣性和數(shù)量都要多于真菌種類，并且細菌在煙葉發(fā)酵和醇化品質改善中發(fā)揮著重要作用［12-13］。因此，有益細菌在煙葉發(fā)酵和醇化中的應用日益得到重視，期望通過對微生物功能的挖掘，實現(xiàn)煙草品質的更好提升。由于煙葉葉面微生物數(shù)量巨大［14］，各類細菌的功能也不盡相同，為更好地了解不同種類細菌在煙葉發(fā)酵和醇化過程中的作用。該研究以耐高溫、耐強酸強堿的芽孢桿菌屬［15］為著眼點，對煙葉葉面優(yōu)勢細菌的分離鑒定以及芽孢桿菌屬在煙葉發(fā)酵和醇化中的應用效果進行綜述，并對其應用和研究前景進行展望，旨在為有益細菌的挖掘、功能開發(fā)及其在雪茄煙生產(chǎn)提供參考。

1 煙葉發(fā)酵和醇化過程中細菌群落的研究

為了篩選功能微生物用于提高煙葉品質，學者采用不同的方法對煙葉發(fā)酵和醇化過程中的葉面微生物群落進行研究。1967年，English等［16］從發(fā)酵的美國康州闊葉中分離出的嗜熱菌包括：8株枯草芽孢桿菌、5株凝結芽孢桿菌、4株巨大芽孢桿菌和3株環(huán)狀芽孢桿菌。國內也有大量科研人員對發(fā)酵和醇化過程中的煙葉葉面微生物進行研究。韓錦峰等［17］研究表明，自然陳化和人工發(fā)酵時葉面微生物數(shù)量減少且以芽孢桿菌屬為優(yōu)勢種群。隨后，有學者對雪茄煙葉的葉面微生物進行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)在煙葉堆積發(fā)酵前后，芽孢桿菌屬為優(yōu)勢種群［18］。此外，張曉娟［19］在雪茄茄衣煙葉人工發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)細菌占絕對優(yōu)勢，分離出來的細菌均為芽孢桿菌，杜佳等［20］在此后的研究中驗證了這一結論。張鴿等［21］使用常規(guī)分離方法對4個國家7種雪茄茄衣煙葉的葉面細菌進行鑒定，發(fā)現(xiàn)各國家煙葉葉面細菌種類存在差異，但主要由芽孢桿菌和葡萄球菌組成，且芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬。

隨著分子生物學的發(fā)展，煙葉中微生物的多樣性得以更為系統(tǒng)地分析。此類技術具有高效、通量大、收集更多數(shù)據(jù)的特征［22-23］。Huang等［24］采用不依賴培養(yǎng)的方法分離了陳化前后煙葉葉面微生物基因組DNA，通過限制性片段長度多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)陳化前后芽孢桿菌和假單胞菌均為優(yōu)勢菌屬。此后，陳小敏等［25］對不同調制方式的“黑老虎”煙葉進行16rDNA高通量測序，同樣發(fā)現(xiàn)主要細菌類群為芽孢桿菌、假單胞菌和微球菌。張鴿等［26］則使用HTS（high-throughput sequencing）和傳統(tǒng)微生物分離方法對不同發(fā)酵時期的墨西哥茄衣葉面細菌進行研究。HTS結果表明，隨發(fā)酵的進行，葉面優(yōu)勢微生物由棒狀桿菌屬和假單胞菌屬演替為葡萄球菌屬。而傳統(tǒng)分離結果表明，不同發(fā)酵時期細菌主要為芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬。對比2種方法發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)微生物分離鑒定方法更能獲得發(fā)酵過程中的部分微生物用于后期的功能研究，而HTS測序則在揭示微生物群落演替中發(fā)揮了重要作用。在隨后的研究中，對雪茄煙葉發(fā)酵過程中煙葉葉面微生物的測序結果表明，雪茄煙葉發(fā)酵過程中葉面優(yōu)勢菌群發(fā)生演替，細菌群落多樣性增加，群落結構發(fā)生變化，而芽孢桿菌屬主要出現(xiàn)在發(fā)酵前期和中期［27-28］。

煙葉發(fā)酵主要為人工發(fā)酵，即在特定的溫度和空氣濕度的發(fā)酵室內，促使煙葉加快變化。而醇化則偏重于在自然環(huán)境下輕發(fā)酵，所處環(huán)境溫度較低，煙葉進行緩慢變化。2種方式煙葉所處環(huán)境溫濕度不同，葉面微生物活動不同。浦紹占等［29］通過對不同倉庫的不同醇化時期煙葉葉面細菌進行測序，發(fā)現(xiàn)不同時期、不同地點煙葉葉面細菌的優(yōu)勢種群不盡相同，而芽孢桿菌屬始終為優(yōu)勢種群。周家喜等［30］以不同倉庫醇化時間不同的云南保山C3F煙葉為研究對象，發(fā)現(xiàn)煙葉醇化過程中細菌群落以假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬和芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，且醇化后期芽孢桿菌優(yōu)勢度明顯增加。此后，牟丹等［31］對不同倉庫不同醇化時間的243個煙葉樣品葉面微生物進行測序，同樣發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬為優(yōu)勢細菌菌屬。陳善義等［32］對不同氧氣濃度下醇化的煙葉表面微生物進行測序，結果表明芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和伯克霍爾德菌屬是氣調醇化階段優(yōu)勢菌屬，其中芽孢桿菌屬和伯克霍爾德菌的占比在整個過程中先升后降，表明了不同醇化階段活躍的微生物類群有所不同。此外，芽孢桿菌屬和伯克霍爾德菌屬則主要在醇化后期發(fā)揮作用。綜上所述，國內外學者使用多種方法對不同煙葉葉面微生物進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)無論是在人工高溫發(fā)酵還是自然低溫醇化過程中，芽孢桿菌屬都能以優(yōu)勢微生物菌群存在。這可能與芽孢桿菌屬在4～70 ℃的條件下生長，具有抗逆性強、營養(yǎng)需求簡單和生長速度快等特性［15］，這使其能夠適應大多數(shù)環(huán)境下不同煙葉發(fā)酵和醇化過程中溫度、水分和pH等微生物生長條件的變化。因此，研究芽孢桿菌屬在煙葉發(fā)酵和醇化中的作用及其應用對于提高煙葉品質至關重要。

2 芽孢桿菌屬在煙葉發(fā)酵和醇化中的應用效果

芽孢桿菌屬是一類好氧或兼性厭氧的細菌，能在極端條件下生存并產(chǎn)生抗逆性芽孢，其種屬包含許多特殊功能菌株，能夠大量產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶等。在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學等科學領域有重要研究和應用價值［33］。在煙葉發(fā)酵和醇化過程中可適當添加有益的芽孢桿菌，將煙葉中的蛋白質、糖和脂肪等有機大分子物質作為微生物生長和繁殖的營養(yǎng)成分，使其利用自身生長代謝降解大分子物質并產(chǎn)生生物酶來促進煙葉內部生化代謝，進而改善煙葉品質［34-37］。

2.1 協(xié)調化學成分

蛋白質在煙葉生長和發(fā)育過程中至關重要，但其含量過高時煙氣強度過大，煙葉感官質量變差。研究表明，在煙葉發(fā)酵和醇化過程中添加芽孢桿菌屬可有效降解煙葉中的蛋白質。馮志珍等［38］使用芽孢桿菌（F-Y-11 菌株）將煙絲發(fā)酵后使其蛋白質降解率提升到29.32%。同年，李寧等［39］將可產(chǎn)生蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌從煙葉葉面分離，然后將其用于雪茄煙葉發(fā)酵，使煙葉的蛋白質降解率增加了12.94%。楊宗燦等［40］從煙葉上分離出短小芽孢桿菌制成的菌液同樣也可使發(fā)酵后煙葉中蛋白質降解率達29.66%。王穎等［41］研究了單一菌株和復配菌株對卷煙葉組化學成分的影響，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬會將大分子蛋白質分解為氨基酸等小分子物質，這導致煙葉蛋白質含量下降。因此，通過使用芽孢桿菌屬降解煙葉蛋白質，不僅可以減少蛋白質本身對煙葉品質帶來的不利影響，而且其生成的游離氨基酸、短肽等小分子物質還可參與美拉德反應生成致香物質等［42］，這些過程對煙葉品質的改善具有重要意義。目前，我國已有應用枯草芽孢桿菌［43-44］、短小芽孢桿菌［45］和高地芽孢桿菌［46］等制成的菌劑來降解煙葉中蛋白質的實踐。

煙葉中的淀粉含量過高會對其制品的燃燒性和安全性產(chǎn)生不良影響，并產(chǎn)生焦糊氣味等。而利用芽孢桿菌屬可產(chǎn)淀粉酶的特性，對煙葉添加有益芽孢桿菌是有效促進淀粉降解、改善煙葉品質的有效手段之一。研究表明，添加單一菌株和復配菌株發(fā)酵時，芽孢桿菌不僅起到降解蛋白質的作用，還可以有效降解煙葉中的淀粉［41］。另外，在煙葉發(fā)酵時使用蘇云金芽孢桿菌處理煙葉，可利用其高效產(chǎn)淀粉酶的特點，使發(fā)酵后煙葉淀粉降解率高達29.84％［47］。張曉瑞等［48］發(fā)現(xiàn)，將從煙葉上分離出的枯草芽孢桿菌HX-6用于發(fā)酵煙葉，可使煙葉淀粉降解率達31.75%。此外，芽孢桿菌也可產(chǎn)生相應的酶降解煙葉中的纖維素、果膠和木質素等成分，從而使煙葉的內在化學成分趨于協(xié)調。煙葉中果膠含量過高會嚴重影響煙草吸食品質和陳化速度，張耀廣等［49］將葉面枯草芽孢桿菌從煙葉中分離出來作為菌劑用于煙葉發(fā)酵，使煙葉的果膠含量降低，從而提高煙草和煙草制品的質量和安全性。雪茄煙中茄衣煙葉需要具有較好的韌性，而煙葉葉脈較粗、半纖維素含量過高時煙葉韌性較差，工業(yè)可用性變差。李志豪等［50］研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌B.cereus可降低雪茄茄衣煙葉中的纖維素和半纖維素含量，這為利用芽孢桿菌屬有效降解煙葉中的半纖維素和纖維素、改善茄衣煙葉的物理特性提供了有效途徑。除此之外，利用產(chǎn)纖維素酶和漆酶的芽孢桿菌Bacillus sp.GYC30降解煙草薄片原料中的纖維素和木質素的技術也已得到應用［51］。

2.2 增加煙葉香氣物質含量

煙葉中的香氣物質成分繁雜，提高煙葉香氣物質的含量是當前的研究熱點之一。消費者通常更喜歡來自然的本草香產(chǎn)品，因此越來越多的研究人員致力于利用生物技術方法產(chǎn)香［52］。Tamayo等［8］首先使用芽孢桿菌來改善煙葉香氣，此后國內關于利用芽孢桿菌提高煙葉香氣的研究越來越多。李曉強［53］在復烤后的煙葉中添加巨大芽孢桿菌進行發(fā)酵，處理后的煙葉香氣物質含量明顯增加。陳興等［54］利用西姆芽孢桿菌V16菌株處理發(fā)酵煙絲，發(fā)現(xiàn)該菌株有助于產(chǎn)生部分香氣物質，增加煙葉致香成分總量。梁開朝等［55］的研究結果表明，蠟樣芽孢桿菌菌株M-5利用煙葉發(fā)酵液產(chǎn)生的主要香氣物質不僅可以用于制備煙葉香精香料，還可以提高煙葉香氣，改善醇化煙葉質量。蔡文等［56］發(fā)現(xiàn)，用高斯芽孢桿菌處理云南煙葉可明顯提高發(fā)酵后煙葉的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量。此外，鞏效偉等［57］探究了3種不同產(chǎn)香芽孢桿菌及其復合微生物菌劑處理對梗絲品質影響的研究，結果表明各處理發(fā)酵后梗絲揮發(fā)性香氣成分的含量均有所增加，且復合菌劑處理樣品提升最高。綜上所述，在煙葉發(fā)酵和醇化的過程中添加芽孢桿菌可以促進煙葉香氣物質的生成，改善煙葉質量。但不同的芽孢桿菌處理煙葉產(chǎn)生的香氣物質有所差異，添加多種復合菌共同作用，其產(chǎn)物會更加復雜，可能更有利于香氣物質的產(chǎn)生，因此對于復合菌劑處理對煙葉香氣物質的影響需要深入研究。

2.3 改善煙葉感官質量

經(jīng)發(fā)酵和醇化的煙葉感官質量會有所提升，添加微生物能進一步改善煙葉的感官質量。瞿嬌嬌等［58］利用從豆豉中分離的芽孢桿菌在30 ℃、相對濕度65%條件下發(fā)酵貴州煙葉15 d，發(fā)現(xiàn)該菌可使發(fā)酵后煙葉香氣質有所提升，吃味得到改善，雜氣減輕，感官品質整體得到改善。黃靜文等［59］發(fā)現(xiàn)，短小芽孢桿菌處理發(fā)酵煙絲可以起到增加香氣、醇和細膩煙氣、除雜降刺和改善吸味的效果。王禎等［60］利用從煙葉表面篩選出的7株細菌對6個不同產(chǎn)地的煙葉進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬菌株GY99處理后的煙葉香氣提升且甜感增加，感官質量評價總分明顯提高。由此可見，在煙葉發(fā)酵和醇化過程中添加芽孢桿菌屬菌株可以起到除雜降刺，使香氣更加顯露，改善煙葉感官質量的作用。

2.4 縮短發(fā)酵和醇化時間

煙葉發(fā)酵和醇化所需時間較長，尤其是雪茄煙葉，晾制后一般要經(jīng)過農(nóng)業(yè)發(fā)酵和工業(yè)發(fā)酵，之后自然醇化1～2年或更長，期間占用資金和庫房，并需要定期殺蟲等養(yǎng)護。而添加有益微生物促進煙葉發(fā)生一系列的生理生化反應、加速內含物質降解可在一定程度上加快整個發(fā)酵和醇化進程，縮短時間。芽孢桿菌屬作為煙葉葉面優(yōu)勢菌屬，對縮短整個進程具有重要作用。陳福星等［61］研究表明，用4個煙葉葉面優(yōu)勢芽孢桿菌菌種制成的菌液可加快整個煙葉發(fā)酵進程。羅家基等［37］的研究結果也證明了利用芽孢桿菌發(fā)酵煙葉可以縮短發(fā)酵時間。韓錦峰等［17］發(fā)現(xiàn)，利用煙葉葉面分離出的芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌混合發(fā)酵煙葉，可加速煙葉內在化學成分的轉化，證明添加微生物不僅可以提高煙葉品質，還可以縮短整個發(fā)酵進程。之后有學者指出，在煙葉自然發(fā)酵過程中，微生物和酶可能起到“催化劑”的作用［62］。謝和等［63］的研究結果則表明，枯草芽孢桿菌處理后煙葉發(fā)酵時間可縮短至8 d。因此，應用芽孢桿菌屬縮短煙葉的發(fā)酵和醇化時間，有利于降低成本，進一步提高經(jīng)濟效益。

2.5 抑制煙葉霉變

煙葉發(fā)酵和醇化期間煙葉容易產(chǎn)生霉變，不僅會使煙葉品質下降，嚴重的還會使煙葉喪失使用價值，對消費者的安全性也有影響。目前，煙葉防霉主要采用物理技術［64-66］、化學技術［67-68］和生物技術［69］。其中，生物防治技術中利用有益菌抑制煙葉霉變具有明顯效果。這一研究結果開辟了利用微生物對煙葉霉變防治的新途徑，為之后的研究提供了方向。另外，有研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對青霉屬霉菌有較強拮抗能力［70］。此后，有研究者公開了一株高地芽孢桿菌在雪茄煙葉發(fā)酵防霉中的應用，該發(fā)明專利指出將該菌株制成菌劑對雪茄煙葉進行發(fā)酵可有效減少煙葉霉變［71］。宋嘉寶等［72］從霉變煙葉上篩選出對霉菌拮抗效果良好的枯草芽孢桿菌和耐鹽芽孢桿菌，為雪茄煙葉發(fā)酵和醇化過程中霉變的防治提供了參考。張岱源等［73］篩選出的解淀粉芽孢桿菌DY-9對各霉菌的拮抗能力均為最強，其菌懸液用于雪茄煙葉發(fā)酵防霉效果最好?？梢?，芽孢桿菌屬在煙葉霉變防治中有很好的應用前景。

3 結語與展望

芽孢桿菌屬因其較強的生長能力，以優(yōu)勢菌屬存在于不同條件下發(fā)酵和醇化的煙葉表面，對探究利用其改善煙葉的發(fā)酵和醇化效果具有重要意義。研究表明，應用芽孢桿菌不僅可以有效降解煙葉中蛋白質、淀粉、果膠和纖維素等物質，促使煙葉內在化學成分更加協(xié)調，還可促進產(chǎn)香反應，增加煙葉香氣物質含量，從而進一步改善煙葉的感官質量。除此之外，芽孢桿菌屬在縮短煙葉發(fā)酵和醇化時間以及此期間抑制煙葉霉變等方面也起到了重要作用。但芽孢桿菌屬菌種繁多，各菌株具有共性但也具有個性，不同的煙葉自身素質和葉面微生物也存在差異，自然界中許多重要的生化過程都是多種微生物共同作用的結果。因此，利用單一芽孢桿菌處理煙葉存在一定的局限性。

目前，提高國產(chǎn)雪茄煙葉質量是煙草行業(yè)亟待解決的問題。發(fā)酵作為雪茄煙葉提質必不可少的環(huán)節(jié)，外源添加微生物定向改善發(fā)酵后煙葉品質也就成了一個研究熱點。結合芽孢桿菌屬具有降解煙葉不同內含物質進行自身代謝、分泌多種功能酶的特性，在今后的研究中可以外源添加不同種類的芽孢桿菌對雪茄煙葉進行發(fā)酵，對比分析不同種芽孢桿菌對煙葉影響的共性和特性，進一步探究芽孢桿菌屬在煙葉發(fā)酵和醇化過程中的作用。此外，利用代謝組學分析方法可以更深入地了解芽孢桿菌屬在煙葉發(fā)酵和醇化過程中小分子內含物質的變化機理，預測代謝通路，從而更全面了解芽孢桿菌屬在煙葉發(fā)酵和醇化過程中作用，為芽孢桿菌屬的應用提供理論參考，并為開發(fā)提升國產(chǎn)雪茄煙葉品質的芽孢桿菌菌劑奠定基礎。

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