關(guān)鍵詞：高州油茶；小果油茶；種仁；蛋白質(zhì)組；非標(biāo)記技術(shù)

中圖分類號：S601；S794.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1003—8981（2024）03—0010—15

油茶屬于山茶科Theaceae 山茶屬Camellia 小喬木或灌木，是我國南方地區(qū)重要的木本油料樹種[1-2]。油茶種質(zhì)資源豐富，小果油茶Camelliameiocarpa 和高州油茶Camellia drupifera 是其中具有代表性的2 種。小果油茶的特點(diǎn)是適應(yīng)性較強(qiáng)，抗炭疽病能力較強(qiáng)，產(chǎn)量穩(wěn)定，單果出籽率和含油率優(yōu)于普通油茶，栽培面積和年產(chǎn)量僅次于普通油茶，主要分布在江西、福建、湖南、廣西、貴州和廣東北部等地區(qū)[3]。高州油茶，又名華南油茶、大果油茶，具有果實(shí)大且樹體較高的特點(diǎn)，是培育果大皮薄、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)油茶的重要種質(zhì)資源，主要分布在廣東、廣西、海南和香港等地，栽植面積和產(chǎn)量均排在全國第3 位[4]。

油茶具有廣泛的應(yīng)用前景，不但可用于園林觀賞，而且非產(chǎn)油部位的果皮可用于堆漚作為肥料，果皮提取物質(zhì)還可用于制作護(hù)膚產(chǎn)品和水果保鮮等，種仁是油茶產(chǎn)油的主要部位，其中富含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、淀粉、黃酮類、酚酸類、有機(jī)酸類、萜類、木脂素類等物質(zhì)[5-6]。從油茶種仁中提取的油脂含有豐富的油酸、亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸及棕櫚酸、硬脂酸等飽和脂肪酸，還有生育酚、角鯊烯、多酚類化合物等主要成分，以及胡蘿卜素、維生素、礦物質(zhì)、皂苷、三萜醇、鞣質(zhì)和芝麻素等物質(zhì)[7-11]。小果油茶油脂中包含約80% 的油酸，含有較多的棕櫚酸和亞油酸，少量硬脂酸、亞麻酸、棕櫚油酸和花生烯酸等，還含有多酚、角鯊烯、植物甾醇和維生素E 等生物活性物質(zhì)，營養(yǎng)價值極高[12-15]。高州油茶油脂中，油酸含量同樣最高，其次為棕櫚酸、亞油酸、硬脂酸和亞麻酸，不飽和脂肪酸含量可達(dá)90%。高州油茶的油脂中，具有與小果油茶類似的活性物質(zhì)，還富含黃酮類和酚酸類物質(zhì)。研究結(jié)果表明，高州油茶油脂具有普通油茶油脂約3 倍的角鯊烯含量和更高的β- 谷甾醇含量，說明高州油茶種仁在抗氧化活性方面具有極高價值[6，16-18]。

油茶是以產(chǎn)油為主要種植目的的經(jīng)濟(jì)林樹種，茶油的產(chǎn)量和品質(zhì)決定了其價值。茶油產(chǎn)量受種仁大小、發(fā)育進(jìn)程以及油脂積累過程等諸多因素影響，茶油品質(zhì)則與抗氧化活性、脂肪酸組成及其生物合成水平等緊密相關(guān)。趙松子等[19]對普通油茶轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，用油茶SPATULA/ALCATRAZ 基因的mRNA 序列搜索，發(fā)現(xiàn)了CoALC、CoSPT1、CoSPT2 等與油茶果實(shí)發(fā)育、大小相關(guān)的基因；趙松子[20] 通過對普通油茶CYP78A10同源基因的mRNA 序列搜索，發(fā)現(xiàn)CoCYP78A10a、CoCYP78A10b、CYP78A10、GmCYP78A10 等基因可能參與種子大小的調(diào)控；Ji等[21] 采用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析法研究了普通油茶種子大小相關(guān)基因，篩選到21 個樞紐基因，其中SPL4、ABI4、YAB1、KLU 等基因在不同時期的表達(dá)水平發(fā)生顯著改變，參與調(diào)控種子大小的過程；吳波等[22] 研究了油脂合成源基因（GPD1）和匯基因（DGAT1 和DGAT2）在高產(chǎn)油量與低產(chǎn)油量的油茶種子中的表達(dá)差異及其對油脂合成積累的影響，發(fā)現(xiàn)GPD1 基因?yàn)橛椭铣煞e累了更多初始底物，從而促進(jìn)種子油脂合成，DGAT1 和DGAT2基因在種子發(fā)育期間的高表達(dá)促進(jìn)了油脂積累；Wu 等[23] 對高產(chǎn)和低產(chǎn)普通油茶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和qRT-PCR 分析，發(fā)現(xiàn)上游基因HAD、EAR 和KASI的協(xié)同高表達(dá)為油酸生物合成提供了前體資源，SAD 基因的持續(xù)高表達(dá)加速了油酸的合成和積累，而下游基因FAD2、FAD3 等的協(xié)同低表達(dá)降低了油酸轉(zhuǎn)化的消耗；郭鈺柬[24] 利用qRT-PCR 技術(shù)對越南油茶的4 個關(guān)鍵酶基因進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)了SAD、FAD2、FAD3 等基因參與脂肪酸合成的作用機(jī)制。這些研究結(jié)果揭示了影響油茶種仁大小、發(fā)育過程、油脂合成和油脂積累水平的相關(guān)基因及其表達(dá)情況，但仍未能完整地反映調(diào)控種仁性狀的作用機(jī)制。蛋白質(zhì)能直接或間接地控制生理性狀的表達(dá)，通過比較2 種油茶種仁的蛋白質(zhì)組差異，可以初步探索調(diào)控油茶油脂合成和積累的蛋白質(zhì)組學(xué)機(jī)制?；诖耍狙芯恐胁捎梅菢?biāo)記（label-free）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對小果油茶和高州油茶種仁的蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較分析，挖掘2 種油茶種仁中與種仁大小、發(fā)育、油脂合成積累及其成分等相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，分析差異蛋白的生物學(xué)功能，以期為油茶分子育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

用于試驗(yàn)的高州油茶和小果油茶的成熟果實(shí)及其種仁如圖1 所示，高州油茶于2020 年10 月中旬（成熟期）采自中國廣東省惠州市博羅林場（114°34′E，23°23′N）， 小果油茶于2020 年11月中旬（成熟期）采自中國廣東省韶關(guān)市曲江小坑林場（113°35′E，24°15′N）。2 個品種均隨機(jī)選擇3 棵盛果期單株，采集樹冠中上部成熟果實(shí)，取其種仁放入凍存管，高州油茶種仁樣品標(biāo)記為GZ255-2-1、GZ255-2-2、GZ255-2-3，小果油茶種仁樣品標(biāo)記為YPZZ13-1、YPZZ13-2、YPZZ13-3，隨后置于液氮中快速冷凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)提取和酶解

取1g種仁樣品置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮充分研磨至粉末狀。參照文獻(xiàn)[25-26] 中的方法，進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取。蛋白質(zhì)濃度參照Bradford 法[27]測定。隨后，對蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，樣品的消化肽段在SPE Cartridges C18（標(biāo)準(zhǔn)密度）濾芯（Sigma-Aldrich公司）上進(jìn)行脫鹽，管床內(nèi)徑7 mm，體積3 mL。真空離心濃縮后用40 μL 體積比0.1% 的甲酸重構(gòu)。

1.2.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析

LC-MS/MS 分析在Q-Exactive 質(zhì)譜儀上進(jìn)行，該質(zhì)譜儀與Easy nLC 聯(lián)用。根據(jù)定量后的酶解產(chǎn)物濃度，從各組酶解的樣品中分別取2 μg 上樣分析。

1.2.3 蛋白質(zhì)鑒定和定量

使用MaxQuant（1.5.3.17）軟件對每個樣品的LC-MS/MS 原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)搜索，對各組的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定和定量分析。使用公共蛋白數(shù)據(jù)庫UniProt（https：//www.uniprot.org/）對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分析。

1.2.4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)篩選

使用公共蛋白數(shù)據(jù)庫UniProt 篩選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，包括顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)和部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)。顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)，是指組間比較中差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）大于2.0 或小于0.5 的差異蛋白質(zhì)；部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)，指組間比較中一組樣品具有2 個及以上的非空值，而另一組樣品具有空值的差異蛋白質(zhì)。

1.2.5 生物信息學(xué)分析

分別使用CELLO（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）軟件和在線網(wǎng)站NCBI Conserved Domain（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）的CDD 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析和蛋白結(jié)構(gòu)域分析。

小果油茶和高州油茶種仁中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)使用Cluster 3.0 軟件采用層次聚類法進(jìn)行聚類，并將結(jié)果顯示在熱圖中。

采用GO 數(shù)據(jù)庫（http：//www.geneo-ntology.org/） 和KEGG 通路數(shù)據(jù)庫（http：//www.genome.ad.jp/kegg/）對差異蛋白進(jìn)行GO 功能注釋和所參與代謝通路分析，獲得差異蛋白質(zhì)的生物功能、所參與生物過程以及細(xì)胞定位等信息。

通過Fisher 精確檢驗(yàn)進(jìn)行富集分析，應(yīng)用多重測試的Benjamini- Hochberg 校正來調(diào)整得到的P 值，P 值小于0.05 的功能類別和通路被認(rèn)為是顯著的。

使用String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks，PPI）分析，通過Cytoscape軟件（http：//www.cytoscape.org/）進(jìn)行可視化和編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 種仁蛋白質(zhì)的識別與鑒定

酶解后總蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，共有27 983 個肽段被鑒定，肽段的氨基酸組成數(shù)量集中分布在7～22，占總數(shù)量的95.31%（圖2）。所有肽段對應(yīng)5712個蛋白質(zhì)，其相對分子質(zhì)量主要為10 ～ 100 kDa，占總數(shù)量的94.15%（圖3）。

如圖4所示， 在YPZZ13中共鑒定出5399個蛋白質(zhì)， 其中有4248個共有的蛋白質(zhì)，在GZ255-2中共鑒定出5602個蛋白質(zhì)， 其中有4497個共有的蛋白質(zhì)。通過組間比較發(fā)現(xiàn)，GZ255-2和YPZZ13中共鑒定出5712個蛋白質(zhì)，其中有5289個共有的蛋白質(zhì)，差異蛋白質(zhì)有110個屬于YPZZ13，313個屬于GZ255-2。

2.2 種仁蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位及結(jié)構(gòu)域注釋

蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位可揭示其在細(xì)胞中發(fā)揮的功能，GZ255-2和YPZZ13中的蛋白質(zhì)分布在細(xì)胞內(nèi)的大部分亞細(xì)胞器中，體現(xiàn)功能的主要亞細(xì)胞器依次分別是細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、葉綠體、質(zhì)膜、線粒體和胞外，在溶酶體、過氧化物酶體、高爾基體、細(xì)胞骨架等其他亞細(xì)胞器中體現(xiàn)了部分功能（圖5）。

結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)中能獨(dú)立折疊和發(fā)揮功能的基本單位，GZ255-2和YPZZ13的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)數(shù)量排名靠前的結(jié)構(gòu)域主要為過氧化物酶、Ras家族、RNA 識別基序、UDP-葡萄糖苷和UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、乙醇脫氫酶GroES類結(jié)構(gòu)域等（圖6）。

2.3 種仁差異表達(dá)蛋白的篩選

對在GZ255-2 和YPZZ13 種仁中鑒定出的5712個蛋白質(zhì)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白（differentiallyexpressed proteins，DEPs）的篩選，將折疊變化的蛋白質(zhì)進(jìn)行t 檢驗(yàn)得到P 值，篩選出顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。與YPZZ13 種仁蛋白質(zhì)相比，GZ255-2種仁中有403個上調(diào)的顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)，有337 個下調(diào)的顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)，有178 個上調(diào)的部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)，有68 個下調(diào)的部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)。GZ255-2 與YPZZ13 種仁中蛋白質(zhì)表達(dá)的差異情況如圖7 所示。

2.4 種仁差異表達(dá)蛋白質(zhì)的聚類

將GZ255-2和YPZZ13種仁中差異表達(dá)的740 個蛋白質(zhì)采用層次聚類法進(jìn)行聚類，結(jié)果如圖8所示。具有相似積累模式的蛋白質(zhì)被聚在一起，展示了蛋白質(zhì)的差異表達(dá)與生理功能、性狀的相關(guān)性。有403 個差異表達(dá)蛋白質(zhì)在YPZZ13中上調(diào)，在GZ255-2 中下調(diào)；有337個差異表達(dá)蛋白質(zhì)在YPZZ13 中下調(diào)，在GZ255-2中上調(diào)。高州油茶和小果油茶種仁中蛋白質(zhì)聚類的結(jié)果表明，二者生理性狀的差異來源于蛋白質(zhì)的積累模式差異。

2.5 種仁差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO分析

根據(jù)GO 數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecularfunction，MF）和細(xì)胞成分（cellular component，CC）的分類，得到前20 個GO 功能富集術(shù)語（圖9）。生物過程方面，具有代表性的GO 術(shù)語是氧化還原過程（79 個DEPs）和質(zhì)子跨膜運(yùn)輸（14個DEPs）；分子功能方面，氧化還原酶活性（116個DEPs）、核糖體結(jié)構(gòu)成分（33 個DEPs）和無機(jī)分子實(shí)體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性（17 個DEPs）是具有代表性的GO 術(shù)語；細(xì)胞成分方面，膜（197 個DEPs）和核糖體（37 個DEPs）是具有代表性的GO 術(shù)語。

2.6 種仁差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG分析

2.6.1 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG通路注釋

在GZ255-2 和YPZZ13種仁中共檢測出179條差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集的KEGG通路并進(jìn)行注釋，篩選出差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集數(shù)量排名在前20 位的通路（圖10）。差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集的KEGG 通路中，富集數(shù)量最多的前5 條通路分別是核糖體通路（40個DEPs）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工通路（24個DEPs）、輔助因子的生物合成通路（21個DEPs）、丙酮酸代謝通路（20個DEPs）和氧化磷酸化通路（19個DEPs）。

2.6.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG富集分析

通過KEGG 富集分析， 篩選出GZ255-2 與YPZZ13 中差異表達(dá)蛋白質(zhì)顯著富集的前20 條KEGG 富集通路（圖11）。視黃醇代謝通路（5個DEPs）、丙酮酸代謝通路（20 個DEPs）、萘降解通路（4 個DEPs）、氧化磷酸化通路（19 個DEPs）和核糖體通路（40 個DEPs）是顯著富集（P＜0.05）的前5 條重要通路。其中，丙酮酸代謝通路、氧化磷酸化通路和核糖體通路是屬于差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集數(shù)量排名在前20 位的通路，而視黃醇代謝通路是差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集最顯著的通路。

2.7 種仁蛋白質(zhì)互作的網(wǎng)絡(luò)分析

蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)是蛋白之間介導(dǎo)的途徑，或其形成復(fù)合物從而發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用的機(jī)制。以String 數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系為基礎(chǔ)，利用CytoScape 軟件構(gòu)建GZ255-2 與YPZZ13 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，展示GZ255-2與YPZZ13 差異表達(dá)蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖12）。不同蛋白質(zhì)高度聚集說明其可能具有相同或相似的功能，能通過協(xié)同作用發(fā)揮生物學(xué)功能。將互作網(wǎng)絡(luò)中聚集程度高的蛋白質(zhì)劃分為不同簇，進(jìn)行功能歸類分組，如圖13所示。

2.8 種仁顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)的代謝通路富集分析

通過比較高州油茶和小果油茶種仁中參與油脂合成積累、營養(yǎng)物質(zhì)合成、活性成分合成等重要通路的顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，篩選出部分關(guān)鍵的顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)。

表1中展示了與油脂合成、積累相關(guān)的關(guān)鍵顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)，及其參與的重要通路。在淀粉和蔗糖代謝、脂肪酸的生物合成、脂肪酸降解、脂肪酸延伸、不飽和脂肪酸的生物合成等通路中鑒定出多個關(guān)鍵的顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中長鏈?；o酶A 合成酶同時參與了脂肪酸的生物合成和脂肪酸降解通路，酰基-[ ?；d體蛋白] 去飽和酶同時參與了脂肪酸的生物合成和不飽和脂肪酸的生物合成通路，烯?；d體蛋白還原酶/ 反式-2-烯酰- 輔酶A 還原酶同時參與了脂肪酸的生物合成和脂肪酸延伸通路，而在脂肪酸降解通路中有3個S-（ 羥甲基） 谷胱甘肽脫氫酶/ 乙醇脫氫酶。

維生素和人體不能合成的必需氨基酸在種仁中的表達(dá)情況是影響油茶種仁品質(zhì)的重要因素。表2 中展示了與營養(yǎng)物質(zhì)、活性成分合成相關(guān)的關(guān)鍵顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)，及其參與的重要通路。在視黃醇代謝（維生素A）、抗壞血酸（維生素C）和醛酸代謝、硫胺素代謝（維生素B1）、核黃素代謝（維生素B2）、維生素B6代謝、生物素代謝（維生素B7、維生素H）等通路中共鑒定出14個關(guān)鍵的顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中參與視黃醇代謝通路的3個S-（ 羥甲基） 谷胱甘肽脫氫酶/乙醇脫氫酶還參與了脂肪酸降解通路，參與生物素代謝的3- 羥?；?[ 酰基載體蛋白] 脫水酶還參與了脂肪酸的生物合成通路。在必需氨基酸代謝和生物合成的不同通路中，共鑒定出16 個顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中酰胺酶同時參與了苯丙氨酸代謝通路和色氨酸代謝通路。

3 結(jié)論與討論

本研究中利用非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了小果油茶和高州油茶種仁的蛋白質(zhì)組差異，發(fā)現(xiàn)740個蛋白質(zhì)在2 種油茶種仁中呈現(xiàn)表達(dá)的差異。通過GO 分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要參與氧化還原的過程以及核糖體的組成。KEGG 分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)蛋白質(zhì)顯著富集的通路是視黃醇代謝通路、丙酮酸代謝通路、萘降解通路、氧化磷酸化通路和核糖體通路，這與GO 分析結(jié)果相關(guān)。此外，通過對差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行挖掘，總結(jié)和分析了影響種仁中油脂合成積累、營養(yǎng)物質(zhì)合成、活性成分合成相關(guān)的部分關(guān)鍵的顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)，揭示了其在高州油茶和小果油茶種仁中積累模式的差異。

糖類物質(zhì)是油脂積累的重要前體物質(zhì)，可溶性糖和淀粉含量與油脂的積累正相關(guān)[28-30]。本研究結(jié)果表明，6個顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)包括淀粉合酶（glgA）、ADP- 葡萄糖焦磷酸化酶（glgC）、海藻糖-6- 磷酸合酶/ 磷酸酶（TPS）、UDP- 葡萄糖焦磷酸化酶（UGP2）、果糖激酶（scrK）和己糖激酶（HK）。其中，glgA 和glgC 是參與淀粉生物合成的關(guān)鍵酶，其基因表達(dá)水平與淀粉積累速率正相關(guān)[31-32]。TPS 參與海藻糖代謝，是合成海藻糖的關(guān)鍵酶，其酶活性影響植物新陳代謝、發(fā)育進(jìn)程和脅迫應(yīng)答的能力[33-35]。UGP2 則是多糖生物合成過程中的關(guān)鍵酶，參與調(diào)控植物體內(nèi)蔗糖的合成與代謝[36]，還參與催化生產(chǎn)UDP- 葡萄糖，從而合成蔗糖和促進(jìn)細(xì)胞壁形成[37-38]，UGP2 在植物發(fā)育和應(yīng)答脅迫方面也具有重要的作用[39]。此外，Granot 等[40] 經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)，HK 家族和scrK 家族是催化葡萄糖和果糖基本不可逆磷酸化的2 個酶家族，游離果糖會被scrK 或HK 催化磷酸化，且scrK 與果糖的親和度更高[41]。與小果油茶相比，在高州油茶種仁中，這6 個顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)在淀粉和蔗糖代謝通路中下調(diào)，這可能與高州油茶消耗了大量的糖類物質(zhì)用于合成脂肪酸有關(guān)。莊瑞林[4] 經(jīng)研究認(rèn)為，在油脂合成和積累的能力上，高州油茶優(yōu)于小果油茶，這與本研究結(jié)果基本一致，說明脂肪酸的合成和積累可能是影響糖類物質(zhì)代謝的重要因素。

此外，本研究中發(fā)現(xiàn)長鏈?；o酶A 合成酶（ACSL）、烯酰基載體蛋白還原酶/ 反式-2- 烯酰- 輔酶A 還原酶（MECR）、?；?[ 酰基載體蛋白] 去飽和酶（FAB2）參與了與脂肪酸代謝相關(guān)的多個通路。ACSL 通過形成酰基輔酶A 中間體激活脂肪酸，參與脂肪酸的生物合成、降解。ACSL 家族酶能將長鏈或超長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為硫酯，用于不同的脂質(zhì)代謝相關(guān)過程，而其活性的改變影響種子萌發(fā)、種子含油量以及植物應(yīng)答脅迫的能力[42]。MECR 參與脂肪酸的生物合成和延伸，能促進(jìn)脂肪酸的合成，并參與脂肪酸的延伸，使脂肪酸從C4 延伸到C16，甚至進(jìn)一步拉長成為極長鏈脂肪酸，改變不同脂肪酸的相對含量[43-44]。FAB2 是一類可溶性酶，是參與不飽和脂肪酸和脂肪酸的生物合成的關(guān)鍵蛋白[45]，其基因表達(dá)影響植物對生物脅迫調(diào)控的反應(yīng)[46]。與小果油茶相比，高州油茶有9 個顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)在脂肪酸的生物合成、脂肪酸降解和脂肪酸延伸通路中下調(diào)，有1 個顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)在不飽和脂肪酸的生物合成通路中上調(diào)，這與糖類物質(zhì)代謝促進(jìn)脂肪酸合成的推測結(jié)果不一致。高州油茶作為性狀變異程度較大的大果油茶，其成熟時間常存在差異，采集時間較晚或種子成熟度較高有可能是導(dǎo)致種仁脂肪酸合成減弱的原因，但脂肪酸的降解也減弱，這與Wang 等[47] 的報道一致，即早熟大果油茶種子成熟末期，脂肪酸的含量先增加，后略有減少。此外，與小果油茶種仁相比，高州油茶種仁中FAB2 在不飽和脂肪酸的生物合成通路中上調(diào)，推測在種仁成熟末期，高州油茶種仁中不飽和脂肪酸的合成和積累增加，這與高州油茶油脂高不飽和脂肪酸含量的特征一致。

視黃醇是維生素A中的一種[48]，與視覺功能、細(xì)胞分化和生長、上皮組織細(xì)胞健康、免疫功能及抗氧化能力等相關(guān)[49]。視黃醇通常與脂肪酸結(jié)合成視黃基酯，視黃基酯和植物性食物中的類胡蘿卜素又常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，最終在小腸中釋放出脂肪酸、游離的視黃醇及類胡蘿卜素[50]。KEGG 富集分析的前20條通路中，差異表達(dá)蛋白質(zhì)最顯著富集的通路是視黃醇代謝通路。在視黃醇代謝通路中，共有4個顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集，其中1個為脫氫酶/ 還原酶SDR家族成員4（DHRS4），另外3個顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)均為S-（ 羥甲基） 谷胱甘肽脫氫酶/ 乙醇脫氫酶（frmA）。其中，DHRS4 屬于短鏈脫氫酶/ 還原酶（SDR）大家族，SDR 是NAD（P）H 依賴性氧化還原酶，在脂質(zhì)、氨基酸、糖、輔助因子、激素和異生物代謝以及氧化還原傳感機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[51]。SDR基因在種子萌發(fā)過程中顯著表達(dá)，參與了種子的發(fā)育[52]。乙醇脫氫酶則參與視黃醇代謝，催化視黃醇和視黃醛的可逆相互轉(zhuǎn)化，視黃醛經(jīng)還原得到視黃醇，經(jīng)氧化后得到視黃酸[53]。視黃酸是視黃醇代謝的中間產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和凋亡、胚胎發(fā)育和再生、視力發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用[54-55]。與小果油茶種仁相比，高州油茶種仁中顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)在視黃醇代謝通路下調(diào)，說明小果油茶種仁的維生素A含量可能較高。

試驗(yàn)中筆者采樣時對油茶果實(shí)成熟度的判斷可能存在一定的偏差，這會對油茶種仁蛋白質(zhì)的鑒定產(chǎn)生一定的影響。后續(xù)將進(jìn)一步分析關(guān)鍵蛋白（酶）的調(diào)控基因和最終合成的代謝產(chǎn)物，以驗(yàn)證本研究中的差異蛋白數(shù)據(jù)。