關(guān)鍵詞：棗；莖段；組織培養(yǎng)；快繁

中圖分類號：S665.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1003—8981（2024）03—0245—10

棗Ziziphus jujuba 為鼠李科Rhamnaceae 棗屬Ziziphus 植物。棗屬植物在世界上約有100 多個種，主要在亞洲和美洲熱帶地區(qū)分布，在非洲有少量種植[1]。棗原產(chǎn)于中國，是我國重要的經(jīng)濟樹種[2]，栽培歷史悠久，至今已經(jīng)有3 000 多年的栽培歷史[3-4]。新疆地區(qū)光熱資源豐富，溫差大，獨特的氣候地理條件促進(jìn)了紅棗品質(zhì)的提升，使新疆地區(qū)成為全國優(yōu)質(zhì)紅棗栽培區(qū)[5]。據(jù)統(tǒng)計，2023年全國棗栽培面積約120 萬hm²，其中新疆紅棗面積31.88 萬hm²，占全國栽培面積的26.6%，新疆棗總產(chǎn)量161.01 萬t，約占全國干棗產(chǎn)量的50%，新疆已逐漸成為我國棗栽培中心。

棗樹品種繁多，遺傳背景較復(fù)雜，雜合度較高，坐果率低。而且棗樹花小，較難摘除雄花和人工授粉，難以獲得雜交后代，其繁殖育種遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他果樹?！惷鬯帧嗝邸? 個品種為新疆地區(qū)特有的棗樹品種，其棗果實可鮮食也可制干，營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，老少皆宜，深受人們喜愛[6-7]。其中‘賽蜜酥’的鮮果極為甘甜酥脆，遺傳性狀穩(wěn)定，具有較強的早期高產(chǎn)性能[8]，是優(yōu)良的鮮食兼制干早熟品種[9]?！嗝邸奶攸c是品質(zhì)優(yōu)良、易豐產(chǎn)、成熟早，是較優(yōu)良的鮮食早熟品種[10]。

目前，生產(chǎn)中通常采用嫁接法來進(jìn)行棗樹品種擴繁。但是，嫁接的生產(chǎn)成本較高，對繁殖材料和砧木的需求量較大[11]，受環(huán)境與氣候條件影響較大，不適用于材料有限的新選育優(yōu)良品種（如‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’）的大量繁殖[12]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行繁殖，可克服傳統(tǒng)嫁接繁殖方法的缺點，降低生產(chǎn)成本，不受地域、空間、氣候條件影響，縮短育苗周期[13]，更有利于優(yōu)良品種的快速繁育、無病毒幼苗繁殖、種質(zhì)資源的離體保存[14]。

棗組織培養(yǎng)研究開始于20 世紀(jì)70 年代。1978 年，石蔭坪等[15] 通過培養(yǎng)‘金絲小棗’等的胚乳首次獲得棗三倍體植株；1983 年，張福泉等[16] 以棗當(dāng)年生幼嫩莖段為試材獲得了棗再生植株。目前已建立了超過20 個品種的棗再生體系，包括葉片、莖段、胚乳、棗頭芽、花藥等不同類型的外植體[17-21]。通過誘導(dǎo)莖段（包括莖尖）的主芽或腋芽萌發(fā)，再通過誘導(dǎo)叢生芽或不定芽增殖，所培育的組培苗的成活率通常較高[22]，而關(guān)于‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’2 個品種初代培養(yǎng)中誘導(dǎo)莖段直接分化不定芽的研究鮮見報道。

鑒于此，筆者以‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’莖段為外植體材料，研究組織培養(yǎng)條件下不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)過程中，最佳的外植體消毒方式和激素配比，旨在建立快速高效的‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’組培快繁技術(shù)體系，為‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’2 個棗品種的推廣和快速大量繁育提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料取自新疆喀什地區(qū)麥蓋提縣央塔克鄉(xiāng)棗綜合實驗站內(nèi)（77°75′33″E，38°98′87″N）。該地區(qū)氣候干燥，降水稀少，晝夜溫差大，土壤類型主要為砂壤土。以‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’2 個品種為研究對象，2 個品種均是分別取自同一母樹枝條嫁接到酸棗砧木上成活的植株。2023 年4—8 月，選擇天氣晴朗的清晨，取無病蟲害、長勢健碩的當(dāng)年生帶芽棗頭枝莖段為外植體，采后進(jìn)行標(biāo)記，并及時帶回實驗室處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒

剪去樣品的多余葉片和二次枝，用流水沖洗30 ～ 60 min，然后將棗頭枝剪成合適長度的帶芽莖段。將處理好的材料移至無菌的超凈工作臺中進(jìn)行消毒滅菌。選用毒性小、對外植體傷害小的次氯酸鈉（NaClO）溶液作為消毒劑。使用75%乙醇處理30 s，無菌水漂洗3 ～ 5 次，然后使用1%、2% 的NaClO 進(jìn)行消毒（5、10、15 min），無菌水漂洗3 ～ 5 次，共9 種消毒處理組合（表1）。每瓶接種4 個外植體，每處理接種10瓶，重復(fù)3次。組織培養(yǎng)條件：MS 培養(yǎng)基，溫度（25±2） ℃，光照強度2 500 ～ 3 000 lx，光照時長12 h/d。培養(yǎng)7 d 后統(tǒng)計外植體污染率及成活率。

1.2.2 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，采用L9（34） 正交試驗設(shè)計，設(shè)置了9 組6-BA、IBA 和TDZ 激素質(zhì)量濃度配比（表2）的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中蔗糖含量30 g/L，瓊脂含量5.6 g/L，pH 值5.8。其他培養(yǎng)條件：（25±2） ℃，光照強度2 000 lx，光照時長12 h/d。每瓶接種4 個帶芽莖段外植體，每處理接種10 瓶，重復(fù)3 次。培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計誘導(dǎo)率，篩選最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.3 增殖繼代培養(yǎng)

采用了L（3⁴） 正交試驗設(shè)計，設(shè)置了9 組6-BA、IBA 和TDZ 激素質(zhì)量濃度配比（表3）的增殖繼代培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中蔗糖含量30 g/L，瓊脂含量5.6 g/L，pH 值5.8。將經(jīng)初代不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的組培苗剪成1 ～ 2 cm 的莖段，接種至增殖繼代培養(yǎng)基中，置于（25±2） ℃、2 000 lx 光照強度和12 h/d 光照條件下培養(yǎng)。每瓶接種4 個莖段，每個處理接種10 瓶，重復(fù)3 次。培養(yǎng)20 d 后統(tǒng)計不定芽增殖生長狀況，篩選最佳增殖繼代培養(yǎng)基。

1.2.4 生根培養(yǎng)

以1/2MS 為基本培養(yǎng)基，設(shè)置了加入不同質(zhì)量濃度IBA、TDZ 和活性炭的6 組生根培養(yǎng)基（表4）。培養(yǎng)基中蔗糖含量30 g/L，瓊脂含量5.6 g/L，pH 值5.8。待不定芽伸長生長3 ～ 5 cm 時，選取長勢良好、生長健壯、葉片生長良好無卷曲、節(jié)間明顯的無菌苗，接種至生根培養(yǎng)基中。接種后，先進(jìn)行7 d 暗培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)為光培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為（25±2） ℃、光照強度2 000 lx、光照時長12 h/d。每瓶接種1 株，每個處理10 瓶，重復(fù)3 次。培養(yǎng)30 d后觀察根系生長情況，篩選最適合‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’2 個棗品種的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.5 移栽煉苗

在移栽前鍛煉組培苗，使其適應(yīng)外部環(huán)境。組培瓶空間小，遇較強的光照容易使其內(nèi)部溫度快速升高，會導(dǎo)致葉片發(fā)生灼燒枯干。因此要采取恰當(dāng)?shù)臒捗绱胧?，煉苗時逐漸打開培養(yǎng)瓶蓋，使幼苗逐步適應(yīng)外部環(huán)境。生根40 d 后準(zhǔn)備煉苗移栽，在生長室中分別閉瓶煉苗3、7、10 d，再開瓶煉苗3 d。移栽時（室內(nèi)溫度25 ℃）將根系發(fā)達(dá)、生長健壯的生根苗從組培瓶中取出，清洗去除根部多余的培養(yǎng)基，將其移栽至裝有基質(zhì)（蛭石與營養(yǎng)土體積比3∶1）的小盆（直徑10 cm、高度10 cm）中，放入人工氣候室培養(yǎng)，溫度為（25±2） ℃，空氣相對濕度保持在50% ～ 60%。小盆下放置托盤，提前在托盤中澆水，使基質(zhì)濕潤，利于組培苗成活。試驗期間保持基質(zhì)濕潤，利于萌發(fā)新根。培養(yǎng)60 d 后統(tǒng)計幼苗成活率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

將獲得的數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2021 軟件進(jìn)行匯總。統(tǒng)計各階段處理的污染率、褐化率、成活率、誘芽率、增殖系數(shù)、生根率、移栽成活率等。采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析。通過單變量方差分析（ANOVO）結(jié)合鄧肯檢驗，進(jìn)行結(jié)果差異顯著性分析（α=0.05）。

污染率為污染外植體數(shù)量占接種外植體總數(shù)量的百分比，褐化率為褐化外植體數(shù)量占接種外植體總數(shù)量的百分比，成活率為接種成活的外植體數(shù)量占接種的外植體總數(shù)量的百分比，不定芽誘導(dǎo)率為誘導(dǎo)出不定芽的外植體數(shù)量占接種成活的外植體總數(shù)量的百分比，增殖系數(shù)為增殖的不定芽數(shù)量占接種的不定芽總數(shù)量的百分比，生根率為生根苗數(shù)量占接種苗數(shù)量的百分比，移栽成活率為移栽成活的植株數(shù)量占移栽植株總數(shù)量的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對棗莖段組織培養(yǎng)效果的影響

在組織培養(yǎng)過程中，‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’2個棗品種莖段外植體的生長情況分別如圖1 和圖2所示。

2.1.1 不同消毒處理對棗莖段消毒效果的影響

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaClO 溶液及不同消毒時間處理的‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’2 個品種棗莖段消毒結(jié)果見表5。在使用1% NaClO 溶液消毒條件下：消毒5 min 處理的莖段褐化情況較少但污染情況嚴(yán)重，出現(xiàn)白色污染；消毒10 min 處理的莖段保持正常綠色，且污染率較低，褐化的情況相對較少；消毒15 min處理的莖段表皮未出現(xiàn)白色菌絲污染，隨著時間延長漸漸出現(xiàn)黃褐色小斑點，切口處韌皮部呈現(xiàn)黃白色。在使用2% NaClO 溶液消毒條件下，消毒5 min 處理的莖段保持正常綠色，因消毒時間較短，污染并未隨NaClO 質(zhì)量分?jǐn)?shù)增高而降低，但褐化率增高；消毒10 min 處理的莖段污染率降低，褐化情況也較少；消毒15 min 處理的莖段表皮逐漸出現(xiàn)褐色斑點，污染率不高，但較嫩莖段整體易褐化。在使用NaClO 溶液對棗莖段進(jìn)行消毒時，使用2% NaClO 消毒10 min 不但能較好地控制污染率，而且褐化率較相同NaClO 質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理15 min 時無明顯上升。總體來看，適宜的消毒方式為75% 乙醇處理30 s 與2% NaClO 溶液處理5 ～ 10 min 組合，NaClO 消毒10 min 是最佳處理（表5，圖3）。

2.1.2 不同激素配比對棗莖段不定芽誘導(dǎo)的影響

將‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’棗莖段接種至不同激素配比的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，7 d 左右莖段腋芽開始萌發(fā)，芽逐漸伸長生長，葉片逐漸長大舒展，25 d 后不定芽高度可達(dá)3 cm 左右。由表6 可知：當(dāng)6-BA 質(zhì)量濃度相同時，隨著IBA、TDZ 的質(zhì)量濃度增加，外植體萌芽率先升高后降低，當(dāng)IBA、TDZ 質(zhì)量濃度在0.2、0.010 mg/L 時‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’2個品種棗莖段的萌芽率均最高，分別為79.19%、87.50%。因此，‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’2個品種棗頭枝莖段不定芽誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+0.010 mg/LTDZ+30 g/L 蔗糖+5.6 g/L 瓊脂。

2.1.3 不同激素配比對棗莖段新芽增殖繼代的影響

對誘導(dǎo)出的‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’2 個品種的新芽進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，經(jīng)多次繼代增殖后發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度的6-BA、IBA 和TDZ 配比對增殖繼代的影響顯著（表7）。在9 組處理中，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為0 時：僅加入質(zhì)量濃度為0.006 mg/L的TDZ，增殖系數(shù)不高，新芽長勢隨時間推移逐漸變差，直至葉片脫落；加入質(zhì)量濃度為0.2、0.4 mg/L 的IBA 和0.008、0.010 mg/L 的TDZ 時，葉片長勢一般，芽細(xì)弱，基部逐漸褐化。隨6-BA質(zhì)量濃度增加，增殖系數(shù)逐漸增高，植株長勢逐漸良好。當(dāng)6-BA 質(zhì)量濃度為1.0 mg/L 時，植株葉片舒展，長勢良好；當(dāng)6-BA、TDZ 質(zhì)量濃度分別為1.0、0.006 mg/L 時，2 個品種均生長良好，其中‘賽蜜酥’的增殖系數(shù)普遍較高，增殖能力較強，植株健壯，葉片舒展，節(jié)間明顯，有利于后期的生根培養(yǎng)。因此，‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’2 個品種棗頭枝莖段不定芽誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L6-BA+0.2 mg/L IBA+0.006 mg/L TDZ+30 g/L 蔗糖+5.6 g/L 瓊脂。

2.1.4 不同激素配比對棗增殖苗生根培養(yǎng)的影響

以1/2 MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，對增殖繼代的植株進(jìn)行生根培養(yǎng)，結(jié)果見表8。當(dāng)NAA 質(zhì)量濃度相同時，加入0.3 g/L 活性炭處理的根系生長情況明顯好于不加入活性炭處理；隨著IBA 質(zhì)量濃度增加，根系開始出現(xiàn)愈傷組織，當(dāng)IBA 質(zhì)量濃度0.1 mg/L，根系長勢最好，無多余愈傷組織出現(xiàn)。因此，‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’增殖苗生根的適宜培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L IBA+0.1 mg/LNAA+0.3 g/L 活性炭+15 g/L 蔗糖+5.6 g/L 瓊脂。

2.2 不同閉瓶處理對棗組培苗成活的影響

用于大田生產(chǎn)的棗組培苗要經(jīng)過從異養(yǎng)狀態(tài)過渡到主要由光合自養(yǎng)生長狀態(tài)的馴化過程。組培苗在培養(yǎng)瓶中處于相對封閉的狀態(tài)，相對濕度高（80% ～ 95%），光照不足（一般容器的光照強度為1 500 ～ 3000 lx，遠(yuǎn)低于室外的自然光照強度），移栽馴化時組培苗要從較高濕度及弱光照狀態(tài)慢慢過渡到自然環(huán)境狀態(tài)下。對生根40 d后的組培苗進(jìn)行3、7、10 d 煉苗3 種閉瓶處理，試驗結(jié)果表明，閉瓶煉苗7 d，再開瓶煉苗3 d 處理的‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’組培苗成活率最高，分別可達(dá)53.3%、56.6%。成活的‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’組培苗生長情況如圖4所示。

3 討論與結(jié)論

以‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’當(dāng)年生棗頭枝莖段為外植體材料，對組織培養(yǎng)過程中最佳的外植體消毒方式以及最適合不定芽誘導(dǎo)與伸長、增殖繼代、生根的添加物種類與濃度配比進(jìn)行了研究，初步建立了‘賽蜜酥’‘伏脆蜜’2 個品種棗莖段組織培養(yǎng)快繁體系。外植體最佳消毒方式為75%乙醇處理30 s 加上2%NaClO 溶液處理5 ～ 10 min組合， 最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L6-BA+0.2 mg/L IBA+0.010 mg/L TDZ+30 g/L 蔗糖+5.6 g/L 瓊脂， 最佳增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L6-BA+0.2 mg/L IBA+0.006 mg/L TDZ+30 g/L 蔗糖+5.6 g/L 瓊脂，最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/LIBA+0.1 mg/L NAA+0.3 g/L 活性炭+15 g/L 蔗糖+5.6 g/L 瓊脂。

對外植體的消毒滅菌處理是建立組培快繁體系的重要環(huán)節(jié)。消毒處理的最佳效果是，消毒徹底，并且外植體組織盡可能不受損傷，細(xì)胞仍可旺盛生長和分化。目前，使用乙醇、氯化汞、NaClO進(jìn)行組合消毒的研究報道較多[23-25]。本研究中采用乙醇、次氯酸鈉對外植體進(jìn)行組合消毒，可以降低對外植體的傷害且安全性較高，對環(huán)境的污染較小，最佳的消毒方式為75% 乙醇處理30 s 與2%NaClO 處理10 min 組合。

在不定芽再生體系中，基本培養(yǎng)基、植物激素的種類及濃度均是影響不定芽誘導(dǎo)、生長、增殖、生根的主要因素。培養(yǎng)基包含著植物生長需要的物質(zhì)，不同棗品種的不同外植體在不同階段對營養(yǎng)物質(zhì)的需求各不相同，因此要根據(jù)品種、外植體材料來選用最適合的培養(yǎng)基。棗樹組織培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基有MS、1/2 MS[26-27]、WPM[28] 等。誘導(dǎo)不定芽再生時一般選用MS 作為基本培養(yǎng)基，例如馬牙棗、魯棗3 號[29] 以MS作為基本培養(yǎng)基時，不定芽的誘芽率較高；在棗外植體增殖繼代培養(yǎng)研究中，多選用MS 作為基本培養(yǎng)基；棗組培苗生根培養(yǎng)多選用1/2 MS 為基本培養(yǎng)基。

在木本植物棗樹的組織培養(yǎng)研究中，存在嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象[30-32]。植物激素可以促進(jìn)組織和器官的分化、有效調(diào)控細(xì)胞生長、植株生長發(fā)育，防止外植體褐化。在棗樹的組織培養(yǎng)研究中，常用的植物激素中生長素有IBA、2，4-D、IAA、NAA，細(xì)胞分裂素有6-BA、TDZ 和KT[33]。在誘導(dǎo)出不定芽后，通過增殖繼代，可以得到大量不定芽，這是建立完善的棗植物組織培養(yǎng)體系并進(jìn)行苗木擴繁的重要步驟。在增殖繼代研究中，僅添加6-BA 和IBA 的培養(yǎng)基中，2 個品種的組培苗長勢一般，增殖率不高，加入適當(dāng)濃度的TDZ 可以顯著促進(jìn)組培苗不定芽的增殖與生長[34]。增殖繼代培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)是移栽前的最重要環(huán)節(jié)，經(jīng)過生根培養(yǎng)，組培苗長出具有從基質(zhì)中吸取營養(yǎng)能力的根系。在誘導(dǎo)棗樹離體再生過程中，不同階段、不同品種、不同外植體需要的生長素和細(xì)胞分裂素的濃度配比是不同的。因此，在建立棗樹組織培養(yǎng)快繁體系過程中，探究適宜的生長素和細(xì)胞分裂素濃度配比，對提高不定芽誘導(dǎo)率、增殖率、生根率以及減少褐化等起到十分關(guān)鍵的作用。

目前，已成功建立了較多種類植物的組織培養(yǎng)快繁體系，其中包括多個棗品種。但是不同棗品種、不同外植體的組織培養(yǎng)快速繁殖的效果不同[35]，而且棗當(dāng)年生枝條莖段只能在夏天進(jìn)行采集，受時間、材料數(shù)量的限制較大，下一步將以葉片、花藥或其他部位作為外植體探索構(gòu)建棗組織培養(yǎng)快繁體系。