摘要：金屬有機(jī)框架材料被廣泛應(yīng)用于種植體、骨修復(fù)等醫(yī)療領(lǐng)域。選用二甲基咪唑?yàn)橛袡C(jī)配體，Mg2+、Zn1+為金屬結(jié)節(jié)，通過(guò)溶劑熱法在室溫下成功合成納米級(jí)Mg@ZIF-8有機(jī)框架材料。Mg@ZIF-8納米顆粒為正十二面體結(jié)構(gòu)，粒徑為200～400 nm，具有Mg–N、Zn–N、C–N、C=C、C=N、C?H官能團(tuán)，在酸性微環(huán)境下不穩(wěn)定，以上物理表征與ZIF-8相似?？咕鷮?shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著Mg2+濃度的升高，Mg@ZIF-8對(duì)大腸桿菌的抗菌性能逐步提高，而且一定濃度的Mg2+對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌性能也有所提高。體外礦化實(shí)驗(yàn)表明：Mg2+能夠促進(jìn)鈦片表面P、Ca的沉積。Mg@ZIF-8有機(jī)框架材料在植入物領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：Mg2+；ZIF-8；金屬有機(jī)框架；抗菌；成骨

中圖分類號(hào)：TG 174文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Preparation of ZIF-8 materials doped with Mg and study on its antibacterial and bone properties

LI Lili，MANG Fengcang，HE Daihua

（School of Materials and Chemistry，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China）

Abstract：Metal-organic framework materials are widely used in implants，bone repair and other medical fields.In this study，dimethylimidazole was selected as the organic ligand and magnesium ion and zinc ion were used as metal nodules，and nanoscale Mg@ZIF-8 organic framework materials were successfully synthesized by solvothermal method under room temperature conditions.The nanoparticles have aregular dodecahedral structure，a size of 200-400 nm，Mg–N，Zn–N，C–N，C=C，C=N and C?H functional groups，and are unstable in an acidic microenvironment，and the above physical characteristics are similar to ZIF-8.The results of antibacterial experiments and in vitro mineralization experiments were also carried out，and the results of antibacterial experiments showed that with the increase of magnesium ion addition concentration，its antibacterial performance against Escherichia coli gradually improved，and the antibacterial performance of acertain concentration of Mg2+against Staphylococcus aureus was also improved.In vitro mineralization experiments showed that the addition of magnesium ions could promote the deposition of phosphorus and calcium on the surface of titanium sheets.Mg@ZIF-8 organic framework materials have good application prospects in the field of implants.

Keywords：Mg2+;ZIF-8;metal-organic framework;antibacterial;osteogenesis

金屬離子不易產(chǎn)生耐藥性，因此選用Zn2+、Mg2+等作為促成骨和抗菌因子來(lái)改善鈦表面的性能[1-2]。金屬有機(jī)框架（metal-organic framework，MOF）材料是抗菌及骨再生應(yīng)用中有效的表面改性劑[3]?；赯n2+的MOF材料在體外和體內(nèi)具有低毒性或無(wú)毒性[4]。Zn-MOF材料在分解過(guò)程中會(huì)釋放Zn2+和有機(jī)配體。一方面，Zn2+能促進(jìn)BMSC的成骨分化[5]，增加成骨細(xì)胞的膠原蛋白分泌和鈣沉積，促進(jìn)骨形成[6]，抑制破骨細(xì)胞進(jìn)行骨吸收[7]；另一方面，有機(jī)配體也對(duì)成骨因子表達(dá)有積極作用[8]。

ZIF-8具有藥物遞送[9]、可持續(xù)釋放藥物、pH響應(yīng)[10]的能力，在酸性環(huán)境下釋放Zn2+，從而達(dá)到抗菌[11]、促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[12-14]。與其他多孔生物材料相比，ZIF-8具有可控且更經(jīng)濟(jì)的合成、優(yōu)異的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性[15]及良好的生物相容性[16]等優(yōu)點(diǎn)。Chen等[17]在多孔鈦表面制備了由納米尺度和微米尺度的沸石咪唑鹽框架-8（ZIF-8）晶體組成的Zn基MOF膜，其納米ZIF-8膜不僅增強(qiáng)了MG63細(xì)胞中堿性磷酸酶（ALP）活性、細(xì)胞外基質(zhì)礦化和成骨基因（ALP，Runx2）的表達(dá)，還抑制了變形鏈球菌的生長(zhǎng)。

Mg2+作為一種良好的生物金屬元素，具有優(yōu)異的抗菌、抗炎性能和促成骨性能，被廣泛用于醫(yī)療領(lǐng)域[18]。Kang等[19]利用Mg2+的成骨性能，合成了一種外泌體功能化的無(wú)細(xì)胞PLGA/Mg-GA MOF（PLGA/Exo-Mg-GA MOF）支架，該支架可以同時(shí)增強(qiáng)成骨、血管生成和抗炎能力。

為了進(jìn)一步提高ZIF-8的抗菌性及促成骨活性，本實(shí)驗(yàn)提出將Mg2+摻雜到ZIF-8中，合成Mg@ZIF-8納米顆粒。實(shí)驗(yàn)選用Mg（NO3）2·6H2O作為Mg2+源，在低溫下合成Mg@ZIF-8，探究Mg2+濃度對(duì)ZIF-8的影響，并通過(guò)抗菌實(shí)驗(yàn)、體外礦化實(shí)驗(yàn)研究Mg@ZIF-8的抗菌性及促成骨性能。

1實(shí)驗(yàn)方法

1.1材料與設(shè)備

用于制備ZIF-8及Mg@ZIF-8的試劑為Zn（NO3）2·6H2O、二甲基咪唑、Mg（NO3）2·6H2O、去離子水、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉等，均為分析純。測(cè)試設(shè)備有：掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、能譜儀（energy disperse spectroscopy，EDS）、X射線衍射儀（X-ray diffractometer，XRD）、傅里葉紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)T-IR）、電感耦合等離子體光譜儀（inductively coupled plasma atomic emission spectrometer，ICP-AES）。

1.2制備方法

1.2.1 Mg@ZIF-8的制備

采用溶劑熱法制備Mg@ZIF-8。稱取一定量二甲基咪唑、Zn（NO3）2·6H2O、Mg（NO3）2·6H2O粉末，分別加入去離子水并攪拌均勻，配成一定比例的溶液，Mg2+、Zn2+、二甲基咪唑的原子分?jǐn)?shù)比分別為0.5：1：70、1：1：70、1.5：1：70、2：1：70。將配置好的二甲基咪唑溶液倒入不同濃度的Mg（NO3）2·6H2O溶液中反應(yīng)5～10 min，然后再將混合溶液倒入Zn（NO3）2·6H2O溶液中反應(yīng)5～10 min，得到Mg@ZIF-8溶液。將Mg@ZIF-8溶液以8000 r/yyPpQcvKD5hvli756plAtQ==min的轉(zhuǎn)速離心，在80℃干燥一夜后可得Mg@ZIF-8固體粉末，樣品記為Mg1@ZIF-8、Mg2@ZIF-8、Mg3@ZIF-8、Mg4@ZIF-8。

1.2.2 Mg@ZIF-8@AHT的制備

將堿熱處理后的鈦片表面清洗干凈，用無(wú)水乙醇、去離子水超聲清洗各3次，每次15 min。將堿熱處理后的鈦片浸泡在不同Mg2+濃度的Mg@ZIF-8溶液中15 min后取出，低溫烘干，得到表面附著Mg@ZIF-8的鈦片，即Mg@ZIF-8@AHT。樣品制備流程圖見(jiàn)圖1。

1.3樣品表征

利用SEM和EDS對(duì)Mg@ZIF-8進(jìn)行表征，分析其表面形貌及成分；利用XRD分析Mg@ZIF-8的結(jié)構(gòu)特征，掃描速率為3（°）/min，掃描角度2θ為5°～50°;選用FT-IR分析Mg@ZIF-8的官能團(tuán)，波長(zhǎng)為400～4000 cm?1；用界面張力測(cè)量?jī)x及配備的數(shù)碼相機(jī)和圖像分析軟件檢測(cè)Mg@ZIF-8@AHT的浸潤(rùn)性，滴量為5 μL，間隔時(shí)間為10～20 s；采用ICP-AES檢測(cè)Mg@ZIF-8中Mg2+和Zn2+的釋放濃度，將Mg@ZIF-8@AHT標(biāo)本浸泡在3 mL的磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffered saline，PBS）中，在37℃無(wú)攪拌條件下分別浸泡6、12、24、48、96 h，并在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集滲濾液，用ICP測(cè)試濾液中Mg2+和Zn2+的濃度。

1.4抗菌實(shí)驗(yàn)

1.4.1細(xì)菌培養(yǎng)

選擇大腸桿菌（escherichia coli，E.coli，ATCC25922）和金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus，S.aureus，ATCC29215）分別作為革蘭氏陰性、陽(yáng)性細(xì)菌的代表，選擇LB液體/固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4.2抗菌率評(píng)價(jià)

采用平板計(jì)數(shù)法來(lái)考察各組鈦片的抗菌能力，實(shí)驗(yàn)步驟如下：

（1）用接種環(huán)在大腸桿菌菌板上蘸取部分菌落于50 mL準(zhǔn)備好的LB液體培養(yǎng)液中，然后放入37℃振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行10 h細(xì)菌培養(yǎng)。

（2）將測(cè)試材料放入孔板中，取1 mL的菌液浸沒(méi)材料，置于37℃條件下培養(yǎng)24 h。

（3）將離心管、LB瓊脂液、槍頭等物品進(jìn)行滅菌處理。

（4）24 h后，取出培養(yǎng)的細(xì)菌菌液，用無(wú)菌PBS沖洗鈦片，去除鈦片表面黏附的細(xì)菌。在每個(gè)孔中加入1 mL的無(wú)菌PBS溶液，在超聲條件下振蕩5 min。

（5）在離心管與LB瓊脂板上進(jìn)行標(biāo)名后，取懸浮液加入到離心管中，振蕩搖勻，稀釋菌液。重復(fù)多次操作至菌液濃度分別為10?4、10?5、10?6倍。

（6）分別取50 μL上述3種濃度菌液加入到LB瓊脂板中進(jìn)行涂布，每種菌液涂3板。涂布前需對(duì)涂布器進(jìn)行滅菌，且培養(yǎng)皿開(kāi)口處靠近酒精燈，防止其他細(xì)菌進(jìn)入。

（7）涂布后將LB瓊脂板置于37℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，24h后取出，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況與菌落數(shù)量。

1.5體外礦化實(shí)驗(yàn)

將Mg@ZIF-8@AHT放入20 mL的0.2 mol/L的CaCl2溶液中浸泡3 min，取出后浸入蒸餾水（dH2O）中5 s；再放入烘箱中干燥3 min；烘干后置于20 mL的0.2 mol/L的K2HPO4溶液中浸泡3 min后取出；浸入dH2O中5 s；再放入烘箱中干燥3 min。以上步驟循環(huán)操作3次。

將不同Mg2+濃度的Mg@ZIF-8@AHT裝入有40 mL SBF溶液的離心管中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中保存，隔天換液。在3、7 d時(shí)間點(diǎn)取樣，用dH2O浸泡清洗，以去除在表面結(jié)晶的NaCl，放置在空氣中干燥。將礦化后的Mg@ZIF-8@AHT作表面噴金處理，置于SEM中進(jìn)行形貌表征。

2結(jié)果與討論

2.1 Mg@ZIF-8表征

圖2為ZIF-8、Mg@ZIF-8、ZIF-8@AHT的SEM圖。圖2（a）、2（c）中ZIF-8表現(xiàn)為菱形十二面體結(jié)

構(gòu)，尺寸為200～400 nm。圖2（c）、2（d）中的ZIF-8已經(jīng)成功負(fù)載到鈦片表面的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。圖2（e）、2（f）中Mg@ZIF-8呈菱形十二面體結(jié)構(gòu)，尺寸為200～400 nm，這和ZIF-8結(jié)構(gòu)一致。負(fù)載到堿熱處理后的鈦片上的形貌如圖2（g）、2（h）所示，Mg@ZIF-8均勻地附著在鈦片表面的網(wǎng)格中。

表1和表2分別是ZIF-8和Mg@ZIF-8的EDS分析結(jié)果。從表1中可以看出，ZIF-8中含有C、N、Zn、Au等元素。從表2中可以看出，Mg@ZIF-8中含有C、N、Zn、Mg、Au等元素。EDS檢測(cè)不出H，有機(jī)物可根據(jù)C、N兩種元素來(lái)判別，因此，可判斷Mg@ZIF-8是含有有機(jī)物、Zn2+、Mg2+的聚合物。根據(jù)上述元素分析結(jié)果推測(cè)，已成功將Mg 2+摻雜到ZIF-8結(jié)構(gòu)當(dāng)中。由于樣品進(jìn)行了噴金處理，所以導(dǎo)致了Au的出現(xiàn)。

圖4（a）為ZIF-8和Mg@ZIF-8的XRD譜圖，可以看到，合成的ZIF-8與標(biāo)準(zhǔn)ZIF-8卡片（602542）中的（011）（002）（112）（022）（013）（222）（114）（233）（134）特征峰都能對(duì)應(yīng)，Mg@ZIF-8與ZIF-8的特征峰一致。因此，Mg2+的添加并沒(méi)有影響ZIF-8的結(jié)構(gòu)。ZIF-8和Mg@ZIF-8的FT-IR光譜圖如圖4（b）所示，可以看出，ZIF-8在417、1147、1580、1627、2927 cm?1處出現(xiàn)吸收峰，分別對(duì)應(yīng)Zn–N、C–N、C=C、C=N、C?H官能團(tuán)。Mg@ZIF-8的FT-IR光譜為圖4（b）中的藍(lán)線，Mg@ZIF-8在464、631 cm?1處出現(xiàn)兩個(gè)吸收峰；在3100～3700 cm?1處出現(xiàn)了較寬的吸附峰。464、631 cm?1處的峰是由于Mg（NO3）2·6H2O NP中的Mg–N引起的拉伸振動(dòng)；3100～3700 cm?1處的吸收峰與-OH基團(tuán)有關(guān)，摻雜Mg2+后的Mg@ZIF-8結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，有更多的水分子殘留在孔道中。

圖5（a）是Zn2+在PBS溶液中的釋放情況，Zn2+在pH為7.4時(shí)緩慢釋放，在pH為6.0時(shí)的釋放速率增大。圖5（b）是Mg2+在PBS溶液中的釋放情況，Mg2+在pH為7.4時(shí)緩慢釋放，在pH為6.0時(shí)的釋放速率增大。Mg@ZIF-8在酸性溶液中Zn2+和Mg2+的釋放速率增大，這與MOF材料在堿性環(huán)境下穩(wěn)定、酸性條件下分解的性質(zhì)一致。

圖6是不同濃度的Mg@ZIF-8負(fù)載的鈦片的浸潤(rùn)性表征分析。從圖6中可以看出，摻雜Mg2+后，鈦片表面的接觸角增大，且隨著Mg2+濃度的增加，接觸角從8.50°增大到23.75°，這可能是因?yàn)殡S著離子濃度的升高，有機(jī)配體和金屬離子的比例逐漸升高，引發(fā)Mg@ZIF-8納米粒子尺寸減小，進(jìn)而導(dǎo)致接觸表面更加光滑。

2.2抗菌實(shí)驗(yàn)

使用擴(kuò)散平板法，選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌來(lái)評(píng)估樣品的抗菌性能。不同樣品上的大腸桿菌如圖7（a）所示，隨著Mg2+濃度的增加，對(duì)大腸桿菌的抗菌性也隨之增加。大腸桿菌的抗菌率如圖7（c）所示，低濃度和高濃度的Mg2+對(duì)大腸桿菌的抗菌率分別為2.7%和100%。不同樣品上的金黃色葡萄球菌如圖7（b）所示，其抗菌率如圖7（d）所示，隨著Mg2+濃度的升高，Mg@ZIF-8對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌率依次為17.3%、43.3%、?14.9%、?25.0%，這可能是因?yàn)殡S著Mg2+濃度的提高，預(yù)防了核糖體脅迫下的細(xì)菌超極化現(xiàn)象，促進(jìn)了細(xì)菌生長(zhǎng)[20]。因此，Mg2@ZIF-8對(duì)這兩種細(xì)菌的抗菌率都有所提升。

2.3體外礦化

圖8是ZIF-8@AHT和Mg@ZIF-8@AHT浸泡在SBF模擬體液中3、7 d的表面礦化情況。如圖8（a）、8（b）所示，在3 d時(shí)，ZIF-8@AHT和Mg@ZIF-8@AHT表面均有結(jié)晶沉淀，沉淀首先在ZIF-8、Mg@ZIF-8周圍沉積，隨著結(jié)晶物的堆積最終將ZIF-8和Mg@ZIF-8淹沒(méi)。圖8（c）、8（d）為礦化后的各元素的含量，礦化3d后，Mg@ZIF-8@AHT表面結(jié)晶沉積物中Ca含量更高，原子分?jǐn)?shù)為21.27%；礦化7 d后Mg@ZIF-8@AHT中Ca含量明顯上升，原子分?jǐn)?shù)為51.64%，且Ca含量已經(jīng)超過(guò)Zn含量，說(shuō)明有源源不斷的Ca、P離子從SBF模擬體液中析出，沉積在礦化位點(diǎn)或已形成的鈣磷沉積上。因此，Mg@ZIF-8可誘導(dǎo)鈣磷在晶體結(jié)構(gòu)內(nèi)均勻沉積，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，形成的混合礦化物出現(xiàn)團(tuán)聚、變大等現(xiàn)象。

3結(jié)論

本文主要通過(guò)溶劑熱法制備出了具有納米尺寸的MOF材料Mg@ZIF-8，并對(duì)其抗菌和促成骨性能進(jìn)行了研究，主要結(jié)論如下：

（1）Mg@ZIF-8呈正十二面體結(jié)構(gòu)，尺寸為200～400 nm，具有和ZIF-8相似的框架結(jié)構(gòu)及官能團(tuán)，在酸性條件下框架解體，離子釋放速率加快。將Mg@ZIF-8加載到鈦片表面后接觸角從8.50°增大到23.75°，整體親水性變化不大。

（2）與ZIF-8相比，Mg@ZIF-8對(duì)大腸桿菌的抗菌性增強(qiáng)，且隨Mg2+濃度的增加，抗菌率從2.7%增加到100%；少量的Mg2+摻雜對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌性能也有所提高，Mg2@ZIF-8對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌率提升最顯著，為43.3%。

（3）與ZIF-8相比，Mg@ZIF-8的Ca沉積性能增強(qiáng)，礦化3 d后Ca的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從14.89%增加到21.27%，礦化7 d后Ca的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從47.76%增加到51.64%。

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（編輯：畢莉明）