摘 要：【目的】通過對(duì)荷蘭皇家帝斯曼集團(tuán)在中國布局的酵母相關(guān)專利信息進(jìn)行分析，了解其關(guān)于宿主菌酵母及其表達(dá)產(chǎn)物的技術(shù)信息，為我國相關(guān)創(chuàng)新主體研發(fā)工作的開展提供技術(shù)啟示?！痉椒ā客ㄟ^智慧芽專利數(shù)據(jù)庫檢索帝斯曼在中國布局的主要酵母相關(guān)的專利申請(qǐng)，并對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析?！窘Y(jié)果】帝斯曼在中國專利制度建立之初就開始布局酵母相關(guān)專利，且其涵蓋的技術(shù)領(lǐng)域較廣，并形成了較為完善的專利保護(hù)體系。【結(jié)論】帝斯曼結(jié)合分子生物學(xué)手段和合成生物學(xué)方法，優(yōu)化外源蛋白在工業(yè)菌株畢赤酵母中的表達(dá)，為我們提供了相關(guān)的技術(shù)方案，同時(shí)也為我國相關(guān)創(chuàng)新主體的研發(fā)工作提供了技術(shù)啟示。

關(guān)鍵詞：帝斯曼；酵母；專利分析

中圖分類號(hào)：Q819 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1003-5168（2024）16-0130-05

DOI：10.19968/j.cnki.hnkj.1003-5168.2024.16.026

A Review of the Main Yeast-related Patent Technologies of DSM in China

HOU Sicong1 SHI Chaoshuo2 LI ji1

（1.Beijing RisingMark Intellectual Property Agency， Beijing 100071，China;

2.School of Bioengineering， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China）

Abstract：[Purposes] By analyzing the yeast-related patent information of DSM in China， this paper aims to understand its technical information on host yeast and its expression products， providing technical inspiration for the development of related innovative entities in China.[Methods] By using the Patsnap patent database to search for the main yeast-related patent applications of DSa7df9b3b258e1f74ad35807af099ad0dM in China， this paper conducts statistical and analytical analysis of the search results.[Findings] It was found that DSM began to lay out yeast related patents from the beginning of the establishment of the Chinese patent system， and it covers a wide range of technical fields， and a relatively complete patent protection system. [Conclusions] DSM combined molecular biology and synthetic biology methods to optimize the expression of exogenous proteins in the industrial strain Pichia pastoris， which provides relevant technical solutions for us， and also provides technical inspiration for the research and development of related innovative bodies in China.

Keywords： DSM; yeast; patent analysis

0 引言

酵母（yeast） 是最早被人類馴化利用的微生物，其在食品、飲料、飼料、工業(yè)乙醇等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［1-2］。面對(duì)海量的信息，專利信息檢索分析能夠從技術(shù)、法律、經(jīng)濟(jì)信息等方面，有效地反映出最新的科研開發(fā)及技術(shù)創(chuàng)新水平［3-5］。例如，陳瑩等［6］從專利分析的角度，揭示了全球特殊酵母工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域技術(shù)創(chuàng)新的發(fā)展態(tài)勢以及各類特殊酵母的應(yīng)用優(yōu)勢，為我國特殊酵母工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域科研決策和科研工作提供了參考。

荷蘭皇家帝斯曼集團(tuán)擁有100多年的歷史，在全球范圍內(nèi)活躍于健康、營養(yǎng)和材料領(lǐng)域，其產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用于食品和保健品、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、醫(yī)藥和醫(yī)療設(shè)備、飼料、汽車和運(yùn)輸、涂料和油漆、建筑、電子電氣、生命防護(hù)、替代能源以及生物基材料等終端市場。

目前，帝斯曼在全球擁有近3.2萬件專利，僅在中國就布局了3 000件以上，涉及生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個(gè)技術(shù)領(lǐng)域。本研究利用智慧芽專利數(shù)據(jù)庫，采用申請(qǐng)人結(jié)合關(guān)鍵詞和分類號(hào)的方式進(jìn)行檢索，重點(diǎn)分析帝斯曼在中國申請(qǐng)的酵母相關(guān)專利申請(qǐng)趨勢、熱點(diǎn)技術(shù)領(lǐng)域，包括維生素A制備、乙醇生產(chǎn)、生物油制備、二羧酸制備和甜菊醇生產(chǎn)等相關(guān)專利技術(shù)，以期為我國相關(guān)創(chuàng)新主體提供有價(jià)值的信息參考。

1 申請(qǐng)趨勢分析

帝斯曼酵母在中國的相關(guān)專利申請(qǐng)量呈波動(dòng)變化趨勢，如圖1所示。從專利申請(qǐng)的數(shù)量上來看，在2020年之前，帝斯曼中國專利申請(qǐng)量處于穩(wěn)步緩慢的增長趨勢，可以看出帝斯曼未曾停止相關(guān)領(lǐng)域的研發(fā)。但根據(jù)對(duì)帝斯曼酵母相關(guān)中國專利的進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)其審中專利占比近23%，而審中專利能從一定程度上反映出創(chuàng)新主體的研發(fā)活力和研發(fā)熱點(diǎn)。帝斯曼與酵母相關(guān)的研發(fā)熱點(diǎn)技術(shù)領(lǐng)域主要集中在生物燃料，如乙醇；生物油；生物化學(xué)品與生物材料，如二羧酸；生物過程法生產(chǎn)維生素與抗生素，如維生素A、維生素D3和維生素E等方面。

2 技術(shù)領(lǐng)域分析

為了更具體地了解和分析帝斯曼酵母相關(guān)的研究熱點(diǎn)以及在中國布局的技術(shù)熱點(diǎn)，對(duì)檢索到的相關(guān)專利主分類號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，如表1所示。

帝斯曼酵母在中國申請(qǐng)量最多的分類號(hào)集中在C12N （微生物或酶；其組合物；繁殖、保藏或維持微生物；變異或遺傳工程；培養(yǎng)基）小類下的3個(gè)大組分類號(hào)： C12N9/00（酶；酶原； 其組合物，制備、活化、抑制、分離或純化酶的方法）占比18%、C12N15/00（突變或遺傳工程； 遺傳工程涉及的DNA或 RNA，載體（ 如質(zhì)粒）或其分離、制備或純化； 所使用的宿主）占比14% 和 C12N1/00 （微生物本身，如原生動(dòng)物；及其組合物）占比13.7%；C12P（發(fā)酵或使用酶的方法合成目標(biāo)化合物或組合物或從外消旋混合物中分離旋光異構(gòu)體）小類下的兩個(gè)大組分類號(hào)：C12P7/00 （含氧有機(jī)化合物的制備）占比15%和C12P19/00 （含有糖殘基的化合物的制備）占比5%?？梢姡鬯孤湍赶嚓P(guān)的中國專利涉及的分類號(hào)較多，表明其涉足的技術(shù)領(lǐng)域較廣。

通過對(duì)相關(guān)專利中的酵母作用進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)酵母在近73%的專利中是作為生產(chǎn)菌株的，其次是含酵母的常規(guī)培養(yǎng)基、酵母提取物、利用酵母自身的基因等。將酵母作為生產(chǎn)菌株包括直接以酵母細(xì)胞作為宿主菌或者對(duì)酵母細(xì)胞自身基因修飾以后將其作為宿主菌。下文結(jié)合帝斯曼主要產(chǎn)品對(duì)其布局的中國專利技術(shù)發(fā)展路線進(jìn)行詳細(xì)梳理。

2.1 維生素A相關(guān)專利技術(shù)分析

帝斯曼開發(fā)了全新的生物基工藝生產(chǎn)維生素A。該工藝可以使用一種專門研制的酵母菌株將可再生碳源轉(zhuǎn)化為維生素A，屬世界首創(chuàng)。本文對(duì)維生素A及其一類的化合物包括視黃醛、視黃醇、3-脫氫視黃醇、視黃酸、這些化合物的異構(gòu)體以及視黃基酯相關(guān)專利進(jìn)行詳細(xì)分析。

1997年，帝斯曼在中國最早提出了一件維生素A相關(guān)的專利，涉及一種酶促?；椒–N1169473A。隨后在2000年，帝斯曼布局了首件將酵母作為宿主菌表達(dá)β、β-胡蘿卜素15、15′-二加氧酶cDNA以裂解β-胡蘿卜素生成維生素A的專利CN1269366A。2004—2013年間，帝斯曼先后提交了5件關(guān)于生產(chǎn)類異戊二烯化合物的甲羥戊酸激酶、用于產(chǎn)生類胡蘿卜素的胡蘿卜素羥化酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶的專利申請(qǐng)。直至2017年，帝斯曼同日提交了5件關(guān)于生產(chǎn)維生素A的專利申請(qǐng)，保護(hù)能產(chǎn)生胡蘿卜素的酵母菌、酶促方法以及維生素A生產(chǎn)方法，尤其是CN111108194A，能將90％的視黃醛轉(zhuǎn)換成視黃醇。2019年，專利CN113227365A將乙酰轉(zhuǎn)移酶在耶氏酵母屬或酵母屬的宿主細(xì)胞中異源表達(dá)，能夠以葡萄糖為碳源提高乙酸視黃酯的產(chǎn)量，同時(shí)增加總類視黃醇的量。2020年，專利CN114127273A保護(hù)具有催化β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)換成反式視黃醛的活性的酶，在產(chǎn)生類胡蘿卜素/類視黃醇的耶氏酵母屬或酵母屬中表達(dá)，提高反式視黃醛的產(chǎn)率，從而提高維生素A的生產(chǎn)率。同年，專利CN114901816A將耶氏酵母屬LIP8對(duì)應(yīng)的內(nèi)源酶活性降低或消除，使其以甘油三酯油為碳源，生產(chǎn)總類視黃醇的視黃醇乙酸酯的百分比增加。

可見，帝斯曼在中國提交的專利申請(qǐng)中，有關(guān)維生素A制備的專利申請(qǐng)主要致力于維生素A生產(chǎn)方法中的重要中間體/前體的生物生產(chǎn)方法，特別是通過參與視黃醇、視黃醇乙酸酯和/或維生素A產(chǎn)生的（異源）酶在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，或者對(duì)宿主菌進(jìn)行基因修飾再表達(dá)該類酶來提高重要中間體/前體的產(chǎn)率，從而進(jìn)一步提高維生素A的產(chǎn)量。并且首次提出了在合適的培養(yǎng)條件下以可再生碳源（如葡萄糖、甘油三酯油等）進(jìn)行發(fā)酵來生產(chǎn)維生素A。

2.2 乙醇生產(chǎn)相關(guān)專利技術(shù)分析

日益嚴(yán)重的資源短缺和環(huán)境惡化，使人們?cè)絹碓揭庾R(shí)到可持續(xù)發(fā)展與科學(xué)發(fā)展觀并行的發(fā)展觀念很重要，因而節(jié)能環(huán)保的綠色生產(chǎn)方式也越來越受到關(guān)注［7］。作為補(bǔ)充甚至替代化石燃料的新型清潔可持續(xù)性的能源生物乙醇也成為帝斯曼研發(fā)的重點(diǎn)。

帝斯曼在2000年以后開始布局生物發(fā)酵制備乙醇的相關(guān)專利。2003年首次提出了將木糖作為碳源進(jìn)行乙醇發(fā)酵的酵母細(xì)菌（CN100448996C）。2005—2009年，又申請(qǐng)了9件關(guān)于木糖、戊糖發(fā)酵的專利，其通過對(duì)酵母細(xì)胞的改變最終能將木糖發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乙醇。2010年，CN112029804A是包含阿拉伯糖異構(gòu)酶（AraA）、L-核酮糖激酶（AraB）和L-核酮糖-5-P-4差向異構(gòu)酶（AraD）基因的酵母菌，在耗盡葡萄糖后能夠?qū)⒗且詤捬醴绞桨l(fā)酵半乳糖。同年，還申請(qǐng)了無甘油的乙醇發(fā)酵生產(chǎn)的專利（CN102712895B），保護(hù)一種缺乏NADH依賴的甘油合成所需的酶的酵母菌株。2012年，帝斯曼提出了一種由乙酸和甘油生產(chǎn)乙醇的工程化酵母菌株（CN104126011B），通過使用經(jīng)基因修飾的酵母細(xì)胞將包括己糖、戊糖、乙酸和甘油的培養(yǎng)基發(fā)酵為乙醇，同時(shí)能夠有效地提高甘油利用率。之后，帝斯曼提出了具有改善作用的戊糖轉(zhuǎn)化的細(xì)胞（CN112195145A），該細(xì)胞能夠在葡萄糖的作用下縮短發(fā)酵中包含戊糖和己糖的糖混合物的發(fā)酵時(shí)間。2015—2019年，帝斯曼又提出了多件利用產(chǎn)醇酵母菌酶促水解木質(zhì)纖維素材料和發(fā)酵糖的方法（CN112553266A、CN107429265A、CN111225982A、CN112204151A）的專利，以及能夠提高產(chǎn)物收率同時(shí)降低甘油產(chǎn)量的技術(shù)效果的重組酵母細(xì)胞相關(guān)專利（CN111032854A、CN109312296A、CN110088275A、CN111148840A、CN110088288A）。2018年，帝斯曼發(fā)明了一種親本多肽的變體，該專利中的重組酵母在厭氧的條件下能夠?qū)⒑⒗堑挠衩捉斩?、玉米淀粉生產(chǎn)為乙醇。 兩年后，帝斯曼又提出了一種新的用于生產(chǎn)乙醇的方法，通過優(yōu)化酵母細(xì)胞內(nèi)源基因，在厭氧的條件下將葡萄糖或阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為乙醇，同時(shí)增加阿拉伯糖轉(zhuǎn)換的量和/或速率。

從以上分析可知，帝斯曼從開始利用轉(zhuǎn)化的酵母宿主細(xì)胞單獨(dú)發(fā)酵木糖或戊糖生產(chǎn)乙醇，逐漸轉(zhuǎn)向使用重組酵母菌株從糖組合物中發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，再到無甘油的乙醇發(fā)酵生產(chǎn)和由乙酸和甘油生產(chǎn)乙醇，直至由木質(zhì)纖維素材料制備糖和/或發(fā)酵產(chǎn)物的整合方法等，一直致力于生產(chǎn)乙醇的菌株及其在轉(zhuǎn)化方面的效果的研發(fā)。尤其是生物乙醇和纖維素乙醇方面的研發(fā)在過去的20年里取得了巨大突破。近幾年，帝斯曼開發(fā)了可同時(shí)高效利用復(fù)合碳源的重組酵母，解決了復(fù)合碳源的高效利用以及葡萄糖抑制酵母碳源利用的技術(shù)問題；基于自有的核心生物轉(zhuǎn)化技術(shù)（包括酶水解和發(fā)酵碳五/碳六先進(jìn)酵母等），使得纖維素乙醇生產(chǎn)成本持續(xù)降低。

2.3 生物油制備相關(guān)專利技術(shù)分析

微生物油脂（SCO）又被稱為單細(xì)胞油脂，是由酵母、霉菌、細(xì)菌和藻類等微生物在一定條件下利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭瑸樘荚?、氮源，輔以無機(jī)鹽生產(chǎn)的油脂產(chǎn)品。通過人為地篩選和培育產(chǎn)油微生物，可以得到γ-亞麻酸（GLA）、α-亞麻酸（ALA）、花生四烯酸（ARA）、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）等功能性脂肪酸。帝斯曼是全球主要的微生物油脂生產(chǎn)企業(yè)之一。

帝斯曼從2008年開始在中國布局生物油及其制備相關(guān)專利。CN113846129A首次提出采用包含纖維素作為碳源的原料經(jīng)異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)假菌界（Stramenopile）微生物，其中生物油中約11%～99％的不飽和脂肪酸是多不飽和脂肪酸，油脂酵母解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）也適用于該工藝。2011年，帝斯曼布局了3種酵母菌株（CN103210080B、CN107794230B）：ATCC登錄號(hào)PTA-11615（菌株28428）、ATCC登錄號(hào)PTA-11616（菌株29404）和ATCC登錄號(hào)PTA-11617（菌株29794），使用該3種菌株分離的微生物或其混合物在培養(yǎng)基中生長即可產(chǎn)生微生物油。2014年，又布局了3件用于從微生物細(xì)胞中獲得微生物油的方法專利（CN105939710B、CN105960235B、CN106061475B），其中微生物細(xì)胞不限于酵母細(xì)胞，具體獲得微生物油的方法包括裂解細(xì)胞以形成裂解細(xì)胞組合物然后從裂解細(xì)胞組合物中回收油。直至2017年，帝斯曼提出了一種新的從微生物細(xì)胞中提取含有PUFA的油的有效方法（CN109477122A），包括在進(jìn)行破乳之前從細(xì)胞發(fā)酵液或裂解的細(xì)胞組合物中去除水。這種方法具有減少破乳時(shí)間和減少鹽的使用的益處，通過該方法可以從微生物細(xì)胞中回收包含一種或多種PUFA的微生物油。

帝斯曼有關(guān)生物油的生產(chǎn)技術(shù)包括利用酵母細(xì)胞自身的特性在由蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、油、甘露糖、阿拉伯糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、纖維素、木質(zhì)纖維素及其組合中選擇碳源的存在下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生微生物油，以及通過裂解一個(gè)或多個(gè)微生物細(xì)胞獲得生物油。

2.4 二羧酸制備相關(guān)專利技術(shù)分析

二羧酸，如蘋果酸、延胡索酸、琥珀酸、富馬酸和己二酸是大量化學(xué)品的潛在前體，其在藥物、化妝品、食物、飼料或化學(xué)工業(yè)中有大量應(yīng)用。

帝斯曼從2008年開始在中國布局生物法制備二羧酸的專利。2008年11月14日，帝斯曼同日提交了4件專利申請(qǐng)（CN104818224A、CN101903522B、CN101896606B、CN101978063B）用于酵母菌表達(dá)三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶來制備二羧酸。2009年，帝斯曼又布局了有關(guān)在低pH下發(fā)酵生產(chǎn)二羧酸的方法專利（CN102089436A、CN107267562A、CN107267561A），包括在低于有機(jī)酸最低pKa的pH值下，在存在含碳水化合物的底物和少量氧時(shí)發(fā)酵酵母，所述pH下二羧酸中至少有50％以酸性形式存在。2014年，帝斯曼與合作伙伴羅蓋特合作申請(qǐng)了在包含合適發(fā)酵培養(yǎng)基的容器中發(fā)酵經(jīng)基因遺傳修飾的細(xì)胞制備二羧酸的方法專利（CN112143762A、CN105378093A）。同年，帝斯曼提出了關(guān)于延胡索酸還原酶的專利申請(qǐng)（CN105814198A、CN112094826A），這是一種具有延胡索酸還原酶活性的變體多肽，該變體多肽的酵母細(xì)胞發(fā)酵可以顯著提高二羧酸如琥珀酸的產(chǎn)量。2016和2017年，帝斯曼分別布局了用于二羧酸生產(chǎn)的宿主細(xì)胞相關(guān)專利： CN108431215A公開的宿主細(xì)胞在其基因組中包含至少一種遺傳修飾，該遺傳修飾導(dǎo)致至少一個(gè)催化輔因子（NADH、NADPH或FADH2）氧化的酶促步驟的缺陷；CN109689864A公開的宿主細(xì)胞包含突變的蘋果酸脫氫酶，其可以提高二羧酸的產(chǎn)量。

可見，帝斯曼一直致力于通過對(duì)重組宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾來提高二羧酸產(chǎn)量的研究。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，帝斯曼在中國專利制度建立之初就開始布局酵母相關(guān)專利，且涵蓋的技術(shù)領(lǐng)域較廣。該公司圍繞與酵母相關(guān)的主要產(chǎn)品如維生素A、生物乙醇、生物油、二羧酸等的生產(chǎn)技術(shù)路線布局了多件專利，在生產(chǎn)菌株、產(chǎn)品制備方法方面已經(jīng)形成了較為完善的專利保護(hù)體系，這為國內(nèi)酵母行業(yè)相關(guān)企業(yè)提供了很好的技術(shù)啟示。

近年來，中國酵母行業(yè)發(fā)展迅速，且有了很多自主研發(fā)技術(shù)，帝斯曼在中國布局的酵母相關(guān)專利，為我國相關(guān)企業(yè)提供了相關(guān)技術(shù)創(chuàng)新的方法和新的思路。同時(shí)，中國企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)海外專利布局，提升國際市場競爭力，提高專利質(zhì)量的同時(shí)均衡專利布局技術(shù)領(lǐng)域，充分利用專利信息，通過專利信息預(yù)測技術(shù)發(fā)展趨勢，有效規(guī)避專利侵權(quán)風(fēng)險(xiǎn)。

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