關鍵詞： 海棠； 叢枝菌根真菌； 高通量測序； 根際微生物多樣性

中圖法分類號： S661.4 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-2324（2024）01-0063-07

在自然界中，植物與微生物相互作用、相互影響[1-3]。植物的根系分泌物（比如糖類，蛋白質，有機酸等）為根際微生物提供營養(yǎng)[4-6]，同時微生物可以促進植物對礦質營養(yǎng)的吸收利用，提高植物的抗逆能力[7-9]。AMF（Arbuscular mycorrhizalfungi）是一類廣泛存在于陸生植物根系的促生菌[10]，能與植物建立互惠的共生關系[2，11]。AMF不僅能與苜蓿、黃豆、玉米、小麥等共生[5，12-13]，還能與番茄、辣椒、黃瓜、胡蘿卜、柑橘、蘋果等園藝作物形成共生關系[14-15]。AMF侵染植物后，根內菌絲體存在于根系皮層細胞，與植物細胞進行物質交換，而根外菌絲則向土壤中擴展，擴大了根的吸收面積，促進根系對水分、氮、磷等吸收[16-19]。有研究表明，AMF不但能提高植物對土壤病原體侵害的抗性[20]，增強植物對鹽、高溫、干旱及重金屬等非生物脅迫的耐受性[21-24]，而且在改善土壤結構和維持生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)性過程中也發(fā)揮著重要的作用[25-26]。因此，AMF的研究對農業(yè)發(fā)展有深遠的意義。

蘋果（Malus domestica）作為世界種植范圍最廣的果樹之一，消費市場廣闊[27]。我國蘋果種植歷史悠久，同時也是最大的生產(chǎn)國和消費國[28]。為了獲得更高的產(chǎn)量和品質，果樹種植通常采用嫁接的方式，將具有優(yōu)良品種特性的接穗與根系發(fā)達的、抗逆性強的砧木接在一起。八棱海棠（Malus robusta）是一種常用的蘋果砧木，具有抗鹽堿、抗水澇、抗線蟲、抗真菌病害等能力[29-31]，被廣泛應用到蘋果種植中。砧木根系的發(fā)育直接影響蘋果的產(chǎn)量和品質，另外根際微生物也會影響果樹的生長發(fā)育，所以研究二者之間的相互作用具有重要的意義。

目前，AMF促進果樹生長的研究較多，但果樹生長對AMF影響的研究較少。在生產(chǎn)中，種植時間是影響果樹生長、果實產(chǎn)量及品質的因素之一。因此本文利用高通量測序技術，對不同種植時間的八棱海棠根際土壤中AMF多樣性進行研究。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

我們于2022 年10 月采集山東蒙陰果園的土壤樣品，蘋果樹的接穗與砧木分別為紅富士、八棱海棠。土壤樣品取自同一個果園，果樹的栽培措施、水肥管理、土壤類型和生態(tài)環(huán)境相似。每棵蘋果樹隨機取樣，距樹干20～30 cm，深度10～30 cm。每個處理取5 棵樹，每棵果樹取5 個孔。挖取土層內的根系，先輕輕抖落根系上松散的土壤，這些土壤為非根際土壤，而不能被抖落且附著在根系表面的土壤為根際土壤[3]。不同處理的土壤樣品過2.0 mm 孔徑的無菌網(wǎng)篩并均質化，土壤樣品保存于-80 ℃[32-33]。

1.2 高通量測序

土壤樣品首先置于無菌袋中搖晃幾分鐘，然后提取八棱海棠根際土壤樣品DNA[34]。根據(jù)Krüger 等[35]和Xiang 等[36]的描述進行PCR 擴增。純化后的DNA 樣品，利用Illumina MiSeq 3000進行測序。

將測序得到的PE reads 利用FLASH 軟件，根據(jù)overlap 關系進行拼接。通過Trimmomatic軟件和UCHIME 軟件，分別對數(shù)據(jù)進行過濾和去除嵌合體，并獲得有效Tags 數(shù)據(jù)。將相同種植時間的3 個樣品合為一組，分別為10 年生八棱海棠根際土壤（10 years soil）和30 年生八棱海棠根際土壤（30 years soil），非根際土壤的3 個樣品合為另一個組（Bulk soil）進行分析。數(shù)據(jù)在QIIME軟件中根據(jù)97%的相似度水平進行聚類，并獲得OTU 數(shù)據(jù)。基于AMF 在線數(shù)據(jù)庫對OTU進行序列比對，獲得分類學注釋，并在各分類學水平統(tǒng)計各樣品群落組成。將數(shù)據(jù)用QIIME 軟件進行處理，生成物種豐度表，利用R語言工具繪制圖表。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本文采用Microsoft Excel 2013 軟件處理試驗數(shù)據(jù)，通過DPS 軟件的Duncan’s 新復極差法進行差異顯著性分析，不同字母表示處理間的差異性（Plt;0.05）。

2 結果與分析

2.1 八棱海棠AMF的OTU分析

八棱海棠土樣檢測數(shù)據(jù)根據(jù)Xiang 等[36]和Li等[33]描述處理，將獲得的OTU序列與Nt 數(shù)據(jù)庫進行比對，去除non-Glomeromycota 序列。將剩余的OTU 序列利用AMF 在線數(shù)據(jù)庫MaarjAM（http：//maarjam.botany.ut.ee）進行序列比對，得到具體物種注釋，并對OTU和物種注釋進行分析。

聚類結果表明，10年生八棱海棠與30 年生八棱海棠OTU存在差異。在OTU水平10年生八棱海棠與30 年生八棱海棠共有OTU 6個，10年生八棱海棠特有OTU 16個，30年生八棱海棠特有OTU 9個。非根際土壤、10年生八棱海棠根際土壤、30年生八棱海棠根際土壤共有OTU 1個，非根際與10 年生八棱海棠共有OTU1個，非根際與30年生八棱海棠共有OTU 6個，非根際特有OTU 1個。在種水平，10年生八棱海棠與30年生八棱海棠共有種3個，10年生八棱海棠特有種11個，30年生八棱海棠特有種3個。非根際土壤、10年生八棱海棠根際土壤、30年生八棱海棠根際土壤共有種1個，非根際與10年生八棱海棠共有種1個，非根際與30年生八棱海棠共有種3個，非根際特有種0個。

2.2 八棱海棠AMF 的Rank-abundance曲線分析

在OTU 水平AMF 的Rank-abundance 曲線（圖1）中，10年生八棱海棠在橫軸的跨度比30年生八棱海棠更長，表明物種含量較豐富。同時，10年生八棱海棠曲線較平坦，樣品組成與30年生八棱海棠相比物種組成更均勻。

2.3 八棱海棠AMF的稀釋性曲線分析和香農指數(shù)曲線分析

在AMF的稀釋性曲線中（圖2），隨著選取測序reads 數(shù)的增加，曲線趨于平坦，表明測序覆蓋度高，測序數(shù)據(jù)量合理，足以反映樣品的AMF多樣性。

在OTU水平香農指數(shù)曲線中（圖3），10年生八棱海棠曲線高于30 年生八棱海棠曲線，表明10 年生八棱海棠比30 年生八棱海棠具有更高的AMF多樣性。此外，各處理香農指數(shù)曲線趨于平緩，表明測序數(shù)據(jù)量足夠大，檢測結果可以反映樣本AMF的多樣性信息。

2.4 八棱海棠AMF的豐富度和多樣性分析

在97% 的相似度水平下，對土壤樣品的Sobs 指數(shù)、ACE 指數(shù)、香農指數(shù)和Simpson 指數(shù)進行分析（表1）。Sobs 指數(shù)和ACE指數(shù)通常反映群落中物種豐富度，10年生八棱海棠的Sobs指數(shù)和ACE指數(shù)明顯高于30年生八棱海棠，即10年生八棱海棠根部定殖的AMF物種數(shù)更多。在微生物多樣性研究中，香農指數(shù)和Simpson 指數(shù)反映群落多樣性。與30年生八棱海棠樣品相比，10年生八棱海棠的Simpson 指數(shù)較低、香農指數(shù)較高，表明10年生八棱海棠的AMF多樣性更高。綜上表明，10年生八棱海棠的AMF豐富度和多樣性高于30年生八棱海棠，種植時間對AMF的多樣性存在影響。

2.5八棱海棠AMF的群落組成分析

將MaarjAM物種注釋結果利用QIIME軟件對不同分類水平下的群落結構進行分析。在科水平的群落結構柱形圖（圖4）中，10年生八棱海棠豐度較高的科為無梗囊霉科（Acaulosporaceae，75.42%）、球囊霉科（Glomeraceae，12.30%）、原囊霉科（Archaeosporaceae，6.59%）和巨孢囊霉科（Gigasporaceae，5.70%），30年生八棱海棠豐度較高的科為無梗囊霉科（Acaulosporaceae，76.18%）、球囊霉科（Glomeraceae，23.04%）、未分類球囊菌綱（unclassified_c_Glomeromycetes，0.67%）和類球囊霉科（Paraglomeraceae，0.10%）。

在非根際土中，球囊霉科（Glomeraceae）豐度為91.65%，未分類球囊菌綱（unclassified_c_Glomeromycetes）豐度為8.35%。在屬水平群落結構柱形圖（圖4）中，10年生八棱海棠的優(yōu)勢屬有7個，30年生八棱海棠的優(yōu)勢屬有4 個。10年生八棱海棠的優(yōu)勢屬分別為無梗囊霉屬（Acaulospora，75.42%）、球囊霉屬（Glomus_f_glomeraceae，12.30%）、原囊霉屬（Archaeospora，6.25%）、巨孢囊霉屬（Gigaspora，4.59%）、盾巨孢囊霉屬（Scutellospora，1.01%）、未分類球巨孢囊霉科（unclassified_f_Gigasporaceae，0.08%）和未分類屬（norank，0.33%）。30 年生八棱海棠的優(yōu)勢屬為無梗囊霉屬（Acaulospora，76.18%）、球囊霉屬（Glomus_f_glomeraceae，23.04%）、未分類球囊菌綱（unclassified c Glomeromycetes，0.67%）和類球囊霉屬（Paraglomus，0.10%）。非根際土屬水平只有球囊霉屬（Glomus_f_glomeraceae，91.65%）和未分類球囊菌綱（unclassified_c_Glomeromycetes，8.35%）。在種水平（ 圖4），10年生八棱海棠豐度較高的種有12個，30年生八棱海棠豐度較高的種有5 個。在10 年生八棱海棠和30年生八棱海棠中無梗囊霉菌（unclassified_g_Acaulospora）是豐度最高的種，分別為61.43% 和63.84%。不同種植時間的AMF優(yōu)勢物種相似，但10 年生八棱海棠的優(yōu)勢種較多，除未分類無梗囊霉菌（unclassified_g_Acaulospora）外，各優(yōu)勢種豐度較均勻。非根際土只有3 個優(yōu)勢種。（圖4 中AMF只顯示豐富度gt;0.01%的物種，其他合并為others。）

3討論

AM真菌作為共生型的促生菌，普遍存在于各種生態(tài)環(huán)境中。1885年，F(xiàn)rank首次將土壤中的一類能與植物根系形成共生關系的真菌命名為菌根（Mycorrhiza）[37]。隨后研究發(fā)現(xiàn)，AMF存在于柑橘、蘋果、葡萄、山楂、草莓、番茄以及其它園藝作物的根系中[17，38]，而且AMF促進果樹的生長，特別是在土壤貧瘠的環(huán)境中[39]。

蘋果作為典型的AMF共生植物，對AMF有很強的依賴性。AMF不僅促進蘋果對水分和礦質元素的吸收利用[40-42]，還能調節(jié)植株內源激素的含量[43-44]，提高果樹生長發(fā)育[16]和抗逆性[45-46]。前人研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因素會影響AMF在蘋果中的定殖[47]。養(yǎng)分含量是衡量土壤肥力的標準。養(yǎng)分含量較高的土壤，植物生長狀態(tài)好，但AMF的孢子數(shù)量較少。Miller 等發(fā)現(xiàn)在相同條件下，用AMF處理蘋果幼苗，有效磷較低的土壤AMF侵染率較高[48]。土壤濕度對AMF生長也會產(chǎn)生影響，濕度過大AMF侵染率降低，菌絲生長受到抑制，但在濕度低的條件下對AMF生長的影響較小[49]。此外，溫度[41]和種植時間對AMF 侵染和生長也會產(chǎn)生影響。李素美等研究表明，在相同環(huán)境條件下，30年生湖北海棠AMF侵染率最低，10 年生和20 年生湖北海棠AMF 侵染率較高[50]。本研究發(fā)現(xiàn)，10年生八棱海棠根際土壤的AMF多樣性高于30年生八棱海棠。10年生八棱海棠的Sobs 指數(shù)、ACE指數(shù)和香農指數(shù)較高，Simpson 指數(shù)較低，因此10年生八棱海棠AMF的物種豐度和群落多樣性高于30年生八棱海棠。在科、屬和種水平群落組成分析中，10年生八棱海棠AMF優(yōu)勢物種的數(shù)量高于30年生八棱海棠，并且10年生八棱海棠AMF的物種豐度更均勻。在馬鈴薯的栽培研究中同樣表明，AMF 的多樣性隨著連作時間的增長而減少[52]。

羅漢果連作土壤AMF的優(yōu)勢屬的數(shù)目也呈逐年降低的趨勢，而且球囊霉屬的豐度逐漸升高，甚至超過90%[53]。八棱海棠的根際土壤中，10年生植株的球囊霉科和球囊霉屬豐度同樣低于30年生植株。球囊霉菌的適應性強、再生能力和菌絲周轉速率高，這可能是其在根際土壤中豐度升高的原因之一[53-54]。在非根際土壤中，球囊霉科和球囊霉屬的豐度達到90%以上，30年生植株中二者的豐度與10年生植株相比升高約一倍。此外，非根際與10年生植株共有OTU 1個，非根際與30年生植株共有OTU 6個，所以30 年生海棠根際AMF群落與非根際AMF群落可能存在同化趨向發(fā)展。另外，王洪濱等[51]和胡又厘[55]對果樹根系AMF鑒定結果表明，無梗囊霉屬、厚囊霉屬、巨孢囊霉屬和球囊霉屬是果樹根系AMF的主要屬。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，無梗囊霉屬和球囊霉屬是八棱海棠根際AMF的優(yōu)勢屬，其中無梗囊霉屬的豐度最高。在生產(chǎn)中，隨著種植時間的增加，自毒物質會逐漸積累。自毒物質可能對AMF的定殖產(chǎn)生影響，降低根際AMF的多樣性。前人研究發(fā)現(xiàn)，AMF的生長繁殖和侵染受到植物根系生理狀態(tài)和形態(tài)的影響[56]。此外，AMF 的侵染對象主要是新生根[57]。隨著樹齡的增大，蘋果樹生長勢降低，新生細根形成變慢，根系皮層木質化加重，進而抑制AMF的侵染與定殖[50]。因此，在種植時間較長的果園，維持AMF的群落的多樣性，極有可能是蘋果樹提質增效的有效途徑。

4結論

通過本研究發(fā)現(xiàn)，10年生八棱海棠與30年生八棱海棠根際AMF的多樣性存在差異，10年生八棱海棠根際AMF的多樣性高于30年生八棱海棠。蘋果樹的種植時間極有可能影響AMF的多樣性，隨著種植時間的增加，根系AMF的多樣性降低。