周修騰+王雪+楊光+陳敏+李鵬英+華國(guó)棟+陳美蘭+郭姣

[摘要]該文旨在初步探索接種地表球囊霉（Glomus versiforme，GV）真菌不同時(shí)期丹參內(nèi)源激素含量的動(dòng)態(tài)變化，實(shí)驗(yàn)設(shè)定對(duì)照組和菌根組，測(cè)定接種GV菌劑30，60，75，90，105，130 d丹參根系侵染率，同時(shí)采用ELISA方法測(cè)定內(nèi)源激素ABA，ZR，GA，IAA，MeJA含量的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，接種菌根90 d丹參根部侵染率為90%，基本達(dá)到平衡；地上部分鮮重和葉片數(shù)顯著高于對(duì)照組，約為對(duì)照組的2.7，1.96倍；除ABA外，丹參接種菌劑75 d地上部分其他內(nèi)源激素含量均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），分別約為對(duì)照組含量的63%～75%；接種菌劑90 d后地下部分內(nèi)源激素含量均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），分別約為對(duì)照組含量的45%～81%；接種GV菌劑105 d后地下部分內(nèi)源激素含量均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），分別高1.4～1.7倍；接種菌劑60，75，105 d地下部分ABA含量顯著增加。因此，推論叢枝菌根真菌能促進(jìn)丹參生長(zhǎng)，且不同侵染時(shí)期影響丹參內(nèi)源激素含量。

[關(guān)鍵詞]叢枝菌根真菌； 丹參； 內(nèi)源激素

[Abstract]To investigate the dynamic changes of endogenous hormones contents in Salvia miltiorrhiza after the inoculation of Glomus versiforme（GV）.The contents of endogenous hormones of ABA， ZR， GA， IAA and MeJA by ELISA were measured. Infection rata of GV reached plateau of 90% at the 90^th d of inoculation； fresh weight of overground part and leaf number were significantly higher in GV group， with 2.7 and 1.96 fold than that of control； contents of all endogenous hormones apart from ABA in over- and under-ground part were markedly lower （P<0.05） in GV group at the 75^th and 90^th d， respectively， with 63% to 75% and 45% to 81% of that in control， and were significantly higher （P<0.05） in both over- and under-ground part in GV group at the 105^th d， with 1.4 to 1.7 fold higher than that of control； content of ABA in underground part increased significantly at 60^th， 75^th and 105^th d. Arbuscular mycorrhizal fungi could promote the growth of S. miltiorrhiza， and affect the dynamic changes of endogenous hormones contents in different infection periods.

[Key words]arbuscular mycorrhizal fungi； Salvia miltiorrhiza； endogenous hormones；

doi：10.4268/cjcmm20162010

叢枝菌根（arbuscular mycorrhiza，AM）是自然界分布最廣泛、最普遍的一類菌根。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道地球上80%以上的陸地植物具有菌根，只有少數(shù)的植物如杜鵑、蘭科、松科、樺科、十字花科、藜科、石竹科、莎草科、燈心草科、蕁麻科、蓼科中的種很少或完全沒(méi)有發(fā)現(xiàn)叢枝菌根^[1]。叢枝菌根是由球囊菌門(mén)Glomeromycota真菌侵染植物根系所形成的一大類菌根，現(xiàn)代的研究表明，AM真菌能促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育^[2-3]，增強(qiáng)其對(duì)養(yǎng)分和水分的吸收與利用^[4-6]，同時(shí)能加強(qiáng)植物根系吸收面積和吸收能力，改變植物內(nèi)源激素平衡狀況^[7]。

植物激素作為植株內(nèi)重要信號(hào)分子，在調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)外界環(huán)境的響應(yīng)的過(guò)程起十分重要的作用。在AM真菌侵染宿主植物，建立共生關(guān)系的過(guò)程中可直接合成或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多種激素類物質(zhì)，如細(xì)胞分裂素（cytokinin，CK）、生長(zhǎng)素（auxin，IAA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、油菜素內(nèi)酯（brassinosteroids，BR）、赤霉素（giberellin acid，GA）、乙烯（ethylene，ET）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）、水楊酸（salicylic acid，SA）等^[8-10]，這些激素形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，除調(diào)節(jié)植物自身生長(zhǎng)發(fā)育、控制植物形態(tài)建成和生理代謝外，還能在菌根真菌與植物相互識(shí)別、菌根形成、誘導(dǎo)植物抗逆性等方面發(fā)揮作用^[11-12]。此外，AM真菌可以通過(guò)影響植物內(nèi)源激素的含量以及它們之間的平衡，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，進(jìn)而間接提高植物抗病性。

丹參Salvia miltiorrhiza Bunge為唇形科多年生草本植物，是一類菌根營(yíng)養(yǎng)型植物，能被叢枝菌根真菌侵染，形成典型的菌根結(jié)構(gòu)。前期課題組研究結(jié)果表明，AM真菌能促進(jìn)丹參的生長(zhǎng)，提高丹參的抗病性，但其作用機(jī)制不清楚，本研究通過(guò)盆栽實(shí)驗(yàn)，接種AM真菌不同時(shí)期丹參體內(nèi)內(nèi)源激素脫落酸（ABA）、生長(zhǎng)素（IAA）、赤霉素（GA）、玉米素核苷（ZR，屬于游離態(tài)細(xì)胞分裂素）、茉莉酸甲酯（MeJA，茉莉酸衍生物）含量的動(dòng)態(tài)變化，初步探索AM真菌影響藥用植物丹參內(nèi)源激素的作用機(jī)制，為后期深入研究?jī)?nèi)源激素在AM真菌提高丹參次生代謝產(chǎn)物及抗性中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

顯微鏡（Nikon E200型）、高速冷凍離心機(jī)HC-3018R；臺(tái)式快速離心濃縮干燥器或氮?dú)獯蹈裳b置，酶聯(lián)免疫分光光度計(jì)，恒溫箱，酶標(biāo)板（40孔或96孔），其他常規(guī)器材。

1.2 供試種子

供試丹參種子，由山東萊蕪丹參種植基地提供，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心黃璐琦研究員鑒定為白花丹參S. miltiorrhiza的種子。供試AM菌Glomus versiforme由三葉草Trifolium repens L.擴(kuò)繁，用其根段、菌絲體、孢子及其混合物作為菌劑。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將丹參種子先在室溫下浸泡10 h后，用75%乙醇浸洗30 s，蒸餾水漂洗3次，用10%過(guò)氧化氫浸泡消毒5 min，蒸餾水漂洗至無(wú)過(guò)氧化氫為止，播種至蛭石中，待種子萌發(fā)。移栽前進(jìn)行接種AM菌處理，即接種G. versiforme，每盆接種10 g菌劑，同時(shí)以不接種菌劑作為對(duì)照CK。采用高10 cm，盆口直徑為12.5 cm，盆底直徑為8.5 cm的小盆，每盆裝入121 ℃高壓蒸汽滅菌土-河沙-蛭石 1∶1∶1混合基質(zhì)，將萌發(fā)的丹參轉(zhuǎn)入到小盆中生長(zhǎng)，每周澆2次50%的hoagland營(yíng)養(yǎng)液。溫室白天氣溫20～25 ℃，夜間15～19 ℃，光照12 h，夜間12 h。植物分別于接種30，60，75，90，105，130 d后取樣，將地上部分和地下部分剪斷，稱重后迅速放入液氮中冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?，每個(gè)處理重復(fù)10次。

1.4 菌根侵染率測(cè)定

隨機(jī)選取不同時(shí)期CK組和GV組30條根段，根據(jù)Trouvelot等^[13]的方法測(cè)定，并按照菌根侵染和叢枝豐度分級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)，輸入等級(jí)參數(shù)，用mycocalc軟件計(jì)算菌根侵染頻率（frequency of mycorrhiza in the root system，用F表示），整個(gè)根系的菌根侵染強(qiáng)度（intensity of the mycorrhizal colonisation in the root system，用M表示），侵染根段的菌根侵染強(qiáng)度（intensity of the mycorrhizal colonization in the root fragments，用m表示）。

1.5 植物激素測(cè)定

取上述丹參植物材料1 g，加入 2 mL 樣品提取液（含1 mmol·L^-1二叔丁基對(duì)甲苯酚的80%甲醇溶液），液氮中研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，4 ℃下提取4 h，1萬(wàn)r·min^-1離心15 min，取上清液。沉淀物再加入1 mL上述提取液，渦旋混勻，4 ℃下再次提取1 h，1萬(wàn)r·min^-1離心15 min，合并上清液，通過(guò)C₁₈固相萃取小柱（預(yù)先用甲醇3 mL活化，純水3 mL平衡），用80%甲醇5 mL洗脫。收集洗脫液，氮?dú)獯蹈?，用樣品稀釋液[500 mL磷酸鹽緩沖液中加0.5 mL聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯（Tween-20），0.5 g明膠]復(fù)溶，用于植物激素酶聯(lián)免疫測(cè)定^[14]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 接種GV不同時(shí)期丹參根系侵染強(qiáng)度的變化

接種GV 60 d內(nèi)，丹參根系侵染頻率呈快速上升的趨勢(shì)，60 d丹參根系侵染頻率（F）達(dá)到86.30%；接種GV丹參整個(gè)根系侵染強(qiáng)度（m）在75 d顯著增加為（22.77±3.18）%（P<0.5，n=30），75 d后根系侵染強(qiáng)度變化不顯著；丹參根段侵染強(qiáng)度（m）75 d也顯著增加為（28.50±1.86）%（P<0.5，n=30），75 d后根段侵染率強(qiáng)度變化不顯著，見(jiàn)表1。

2.2 接種GV對(duì)丹參生長(zhǎng)情況的影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，接種GV真菌90 d后丹參地上部分鮮重顯著高于對(duì)照組，約為對(duì)照組的2.7倍，葉片數(shù)顯著高于對(duì)照組，約為對(duì)照組的1.96倍（P<0.05）；地下部分鮮重和分根數(shù)有高于對(duì)照組的趨勢(shì)，但是差異不顯著，見(jiàn)表2。

2.3 接種GV不同時(shí)期丹參內(nèi)源激素含量的變化

2.3.1 接種GV不同時(shí)期丹參地上部分內(nèi)源激素含量的變化 接種GV菌劑75 d時(shí)，丹參地上部分內(nèi)源激素ZR，GA，IAA，MeJA均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），分別約為對(duì)照組含量的73.81%，74.09%，63.14%，66.97%；接種GV菌劑130 d時(shí)，內(nèi)源激素ZR，GA均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），約低于對(duì)照組1.2，1.4倍。其余時(shí)間各個(gè)內(nèi)源激素變化不顯著，見(jiàn)圖1。

2.3.2 接種GV不同時(shí)期丹參地下部分內(nèi)源激素含量的變化 接種GV菌劑60 d時(shí)，丹參地下部分內(nèi)源激素ABA顯著高于對(duì)照組（P<0.05），約高于對(duì)照組的1.3倍，MeJA顯著低于對(duì)照組，約低于對(duì)照組的1.6倍，其他激素含量無(wú)顯著性差異；接種GV菌劑75 d時(shí)，ABA顯著高于對(duì)照組（P<0.05），約高于對(duì)照組的1.1倍，其他激素含量無(wú)顯著性差異；接種GV菌劑90 d時(shí)，ZR，GA，IAA，MeJA均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），分別約為對(duì)照組含量的80.01%，45.63%，78.21%，60.15%；接種GV菌劑105 d時(shí)，ABA，ZR，GA，IAA，MeJA均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），分別高于對(duì)照組的1.6，1.6，1.4，2.1，1.7倍；接種GV菌劑130 d時(shí)，ZR，MeJA均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），分別約為對(duì)照組含量的65.16%，71.09%，其他時(shí)間段內(nèi)各個(gè)激素含量無(wú)顯著性差異，見(jiàn)圖2。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，接種GV菌劑75 d內(nèi)，丹參根系侵染強(qiáng)度和根段侵染強(qiáng)度顯著增加，90 d侵染率達(dá)到了90%，故本研究選擇90 d作為丹參生物量測(cè)定。由生物量結(jié)果可以看出，接種AMF 90 d能顯著提高丹參地上部分鮮重和葉片數(shù)，而對(duì)于地下部分鮮重和分根數(shù)有提高的趨勢(shì)，但是差異不明顯，究其原因可能是地下部分植株生物量積累速度滯后于地上部分植株^[15]。

植物內(nèi)源激素能夠調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)植物的產(chǎn)量等有重要影響，而AM真菌在大多數(shù)條件下能提高植物激素類物質(zhì)的含量^[16]。研究結(jié)果表明，接種GV菌劑105 d時(shí)ZR，GA，IAA，MeJA均顯著增加，這與前期的研究結(jié)果一致。如丁建新等^[17]研究表明5種AM真菌均能提高番茄體內(nèi)IAA，GA，ZR含量，顯著地促進(jìn)番茄植株的鮮重，植株高度以及地上和地下部干重；劉潤(rùn)進(jìn)等^[18]利用室內(nèi)盆栽研究表明AM真菌在正常水分與干旱條件下均能顯著提高玉米以及棉花植株葉片和根中生長(zhǎng)素（IAA）、玉米素和赤霉素（GA）含量。

目前，AM真菌對(duì)ABA含量的影響尚存在爭(zhēng)論，丁建新等^[17]和Meixner等^[19]研究接種AM真菌能提高ABA含量；而劉潤(rùn)進(jìn)等^[18]研究發(fā)現(xiàn)，接種AM真菌6周后能顯著降低ABA含量。本研究結(jié)果表明，接種AM真菌60，75，105 d能顯著增加丹參地下部分ABA含量，課題組前期還研究接種AM真菌45 d能顯著降低地上部分和地下部分ABA含量^[20]，分析原因可能ABA在植物體內(nèi)的含量與AM真菌接種時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)。

研究結(jié)果也表明，接種GV菌劑不同時(shí)期植物丹參內(nèi)源激素含量的變化有所不同，但均處于動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，地下部分在接種GV菌劑90 d時(shí)顯著降低，105 d時(shí)顯著增加，之后恢復(fù)平衡狀態(tài)。究其原因是AM真菌能夠通過(guò)影響丹參內(nèi)源激素水平以及不相激素間的配比來(lái)影響宿主植物丹參的生理狀況^[21]，GV菌劑不同時(shí)期的侵染強(qiáng)度存在差異，促使丹參內(nèi)源激素含量出現(xiàn)不同的狀態(tài)，接種GV菌劑75 d時(shí)，丹參根系侵染率顯著增加，90 d時(shí)趨于平衡。植物激素在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及抗性反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，多種激素之間的作用不是獨(dú)立的，而是相互作用，在植物體內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，不同的植物激素通過(guò)不同途徑相互之間的協(xié)調(diào)來(lái)調(diào)控植物生長(zhǎng)抗病信號(hào)的網(wǎng)絡(luò)，從而刺激了宿主植物的生長(zhǎng)及對(duì)各種生物脅迫的防御反應(yīng)^[22]。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]