［摘要］目的探討環(huán)氧化酶-2（COX-2）及其靶向miRNA-137在扁平苔蘚（LP）中的表達及潛在作用。方法采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測40例LP皮損組織中miRNA-137表達情況，以35例正常皮膚組織作為對照。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測COX-2在LP組織及正常皮膚組織中的表達水平。結果與正常皮膚組織相比，LP組織樣本COX-2表達明顯升高（t=2.163，P=0.034），miRNA-137表達顯著下調(diào)（t=2.122，P=0.037）。Spearman秩相關分析結果顯示，LP組織中miRNA-137與COX-2的表達呈負相關（r=-0.244，P=0.035）。結論miRNA-137表達下調(diào)導致其靶蛋白COX-2的表達上調(diào)，這可能在LP發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，miRNA-137可能會成為LP分子治療的潛在工具。

［關鍵詞］扁平苔癬；微RNAs；環(huán)氧化酶2

［中圖分類號］R758.65［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2024）03-0425-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.096［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網(wǎng)絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.r.20240726.0915.003;2024-07-2913：25：01

Expression of miRNA-137 and its target protein cyclooxygenase-2 in lichen planus" LI Yuanyuan， WANG Jun， WANG Yingying， LIANG Shuya， LU Xiaoou （Department of Dermatology， Qingdao Women and Children’s Hospital， Qingdao University， Qingdao 266034， China）

［Abstract］ObjectiveTo investigate the expression and potential role of miRNA-137 and its target cyclooxygenase-2 （COX-2） in lichen planus （LP）. MethodsQuantitative real-time PCR was used to measure the expression of miRNA-137 in skin lesion tissue of 40 patients with LP， and 35 cases of normal skin tissue were selected as the control group. ELISA was used to measure the expression level of COX-2 in LP tissue and normal skin tissue. ResultsCompared with normal skin tissue， there was a significant increase in the expression level of COX-2 in LP tissue （t=2.163，P=0.034） and a significant reduction in the expression level of miRNA-137 （t=2.122，P=0.037）. The Spearman’s rank correlation analysis showed that the expression of miRNA-137 was negatively correlated with that of COX-2 in LP tissue （r=-0.244，P=0.035）. ConclusionThe downregulated expression of miRNA-137 leads to the upregulated expression of its target protein COX-2， which may play an important role in the pathogenesis of LP， and miRNA-137 may become a potential tool for molecular therapy in LP.

［Key words］lichen planus; microRNAs; cyclooxygenase 2

扁平苔蘚（LP）是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，典型的病理學特征為表皮過度增生、顆粒層楔形增厚、基底細胞液化變性和淋巴細胞浸潤[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，T細胞介導的免疫反應與特定miRNA表達的變化密切相關[2]。miRNA具有器官特異性或發(fā)育階段特異性表達模式，是人類炎癥和自身免疫性疾病的重要生物標志物。miRNA-137是miRNA家族中的一員，在口腔扁平苔蘚（OLP）中其表達降低[2-3]。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C環(huán)氧化酶-2（COX-2）是miRNA-137的潛在靶基因[4]。已有研究結果表明，LP皮膚組織COX-2 mRNA表達明顯增高[5]。在一項OLP回顧性研究中，COX-2蛋白表達陽性率高達81%（25/31）[6]。然而，miRNA-137靶向COX-2是否在LP的發(fā)病機制中發(fā)揮作用還未見報道。因此，本研究檢測了miRNA-137及其下游靶蛋白COX-2在LP病人及健康人皮膚組織中的表達，進一步探討miRNA-137、COX-2與LP發(fā)病的相關性。

1材料及方法

1.1研究對象

病例組40例標本選自2018年10月—2020年3月就診于青島大學附屬醫(yī)院皮膚科經(jīng)臨床和病理確診的LP病人皮膚組織，取材于四肢和軀干。40例病人，男20例，女20例，年齡為22～64歲，平均（43.42±11.44）歲；所有病人半年內(nèi)無系統(tǒng)用藥及局部用藥，且均無其他系統(tǒng)性疾病。對照組35例標本選自整形外科病人健康皮膚，其中男18例，女17例，病人年齡22～64歲，平均（38.97±11.52）歲。兩組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所取標本病人均知情同意。

1.2標本處理

獲取的新鮮組織標本，立即置于液氮中冷凍30 min，并放在-80 ℃冰箱中保存待用。

1.3實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測miRNA-137的表達

應用Trizol（Takara，批號為9108）從皮膚活檢樣本中分離出總RNA，使用Mir-XTM miRNA First Strand Synthesis and TB Green試劑盒（Takara，批號050919）對miRNA-137進行逆轉錄（37 ℃孵育60 min，85 ℃孵育5 min，12 ℃保溫）。實時PCR定量使用TB Green Premix Ex TaqTM II試劑盒（Takara，批號RR820A），采用20 μL反應體系（含2×SYBR Green PCR Master Mix 10.0 μL、cDNA 1.0 μL、上下游引物各0.4 μL、DEPC水8.2 μL）按設定的反應條件（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)）在 PCP 儀上進行擴增。miRNA-137引物（F：5′-CCTTATTGCTTAAGAATACGCG-3′）和U6引物（F：5′-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3′，R：5′-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3′）由上海生工生物工程公司合成。采用2－△△Ct法進行結果分析，ΔCt值=miRNA-137的Ct值－內(nèi)參U6的Ct值。

1.4酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測 COX-2的表達

用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗組織，去除殘留血液，稱質(zhì)量后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。組織研磨后液氮放置0.5 h，然后置于30 ℃水浴鍋中輕微振蕩使其迅速融化，此操作反復2次。最后將勻漿液于8 ℃、以4 000 r/min離心，取上清檢測。根據(jù)試劑盒（Elabscience Biotechnology公司，批號E-EL-H1846c）說明書步驟檢測COX-2的含量，同時設置空白對照孔。采用波長450 nm測量每孔吸光度，根據(jù)標準曲線計算出各因子的表達水平。

1.5統(tǒng)計學分析

所得數(shù)據(jù)應用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以±s形式表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，COX-2與miRNA-137的相關性分析采用Spearman相關性分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1LP組織中COX-2的表達水平

ELISA法檢測結果顯示，與對照組相比，LP病人皮膚組織中COX-2的表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.163，P=0.034）。見表1。

2.2LP組織中miRNA-137的表達水平

RT-PCR檢測結果顯示，與對照組相比，LP病人皮膚組織中miRNA-137的表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.122，P=0.037）。見表1。

2.3miRNA-137與COX-2表達的相關性

Spearman相關性分析結果顯示，LP組織中miRNA-137與COX-2的表達水平呈負相關（r=-0.244，P=0.035）。見圖1。

3討論

LP是一種免疫介導的丘疹鱗屑性疾病，該病發(fā)病無明顯性別差異[7]，其病因和發(fā)病機制尚未完全明了，有關病因包括感染（細菌或病毒）、自身免疫、代謝和遺傳等，而多數(shù)學者認為該病是一種自身免疫性疾病。LP在組織病理學上屬界面性皮炎，可能是對表皮某些抗原的異常遲發(fā)性過敏反應，主要以T淋巴細胞介導的免疫反應為特征[8-9]。miRNA可結合mRNA的部分互補識別序列，引起mRNA降解和翻譯抑制，從而有效沉默其靶基因。生物信息學研究結果表明，1/3的已知基因可能被miRNA調(diào)控[10-11]。miRNA在自身免疫和細胞增殖、分化、凋亡中發(fā)揮重要作用，大量數(shù)據(jù)證明，miRNA是人類惡性疾病發(fā)生和進展中的重要表觀遺傳調(diào)節(jié)因子[12-13]。miRNA存在于所有生物組織中，其表達對于維持正常的免疫功能至關重要，而miRNA的失調(diào)可能與自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)病機制有關，由于miRNA在細胞外環(huán)境中的穩(wěn)定性及在各種體液中的可及性，循環(huán)miRNA可成為診斷和評估疾病進展的理想生物標志物[14-16]。既往的miRNA與LP相關性研究主要集中于OLP，針對皮膚LP的研究相對較少，miRNA-137與皮膚LP發(fā)病的相關性研究尚未見報道。

AGHBARI等[2]研究表明，OLP病人口腔黏膜組織和唾液中miRNA-27b和miRNA-137的表達降低。AGHBARI等[3]在另一項研究中發(fā)現(xiàn)，OLP病人口腔黏膜組織CD8表達增加，miRNA-137表達減少，miRNA-137和CD8表達呈負相關，表明miRNA-137通過調(diào)控CD8表達發(fā)揮抗炎或免疫調(diào)節(jié)功能。此外，相關研究結果證實，miRNA-137可能還具有抗細胞增殖功能[17-18]。本研究結果顯示，miRNA-137在LP中表達下調(diào)，其靶蛋白COX-2的表達上調(diào)，二者表達水平呈負相關，推測miRNA-137可以抑制COX-2在LP中誘發(fā)的炎癥反應，提示miRNA-137的異常表達與LP發(fā)病相關。

環(huán)氧化酶（COX）亦可稱為前列腺素過氧化物合成酶，在前列腺素合成過程中起著至關重要的作用，前列腺素E2（PGE2）是COX-2的關鍵代謝產(chǎn)物，具有免疫調(diào)節(jié)作用。COX-2在大多數(shù)組織中呈誘導性表達，是炎癥治療的重要靶點。EL-RIFAIE等[5]的研究顯示，LP皮膚組織COX-2 mRNA和PGE2表達明顯增高，表明COX-2及其代謝產(chǎn)物PGE2在LP皮損中有較強的表達，認為COX-2及其代謝產(chǎn)物具有免疫調(diào)節(jié)作用，在LP發(fā)病機制中發(fā)揮一定作用。SINGH等[19]研究結果顯示，COX-2表達與肥大細胞計數(shù)有顯著的相關性，隨著COX-2表達強度從輕度增加到中度或重度，肥大細胞數(shù)量幾乎翻了一番。故他們認為，COX-2、肥大細胞與基底膜的相互作用形成惡性循環(huán)，與慢性疾病的本質(zhì)有關，COX-2抑制劑可減輕OLP免疫失調(diào)前的炎癥過程。此外，研究表明，COX-2抑制劑能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達，基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的明膠酶，二者表達與LP發(fā)病機制密切相關[20-22]。本研究結果顯示，LP病人皮膚組織中COX-2表達明顯升高，推測miRNA-137的低表達減弱了對COX-2的抑制作用，從而通過COX-2介導的免疫失調(diào)及炎癥反應在LP發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用。

ZHANG等[23]的研究表明，低氧降低miRNA-137的表達。此外，TIAN等研究[24]表明，miRNA-137通過抑制src基因依賴的MAPK信號通路來減弱氧化、凋亡和炎癥通路。還有研究表明，COX-2介導低氧誘導的HaCaT細胞毒性及炎癥損傷作用[25]。近年來研究表明，低氧微環(huán)境在免疫炎性疾病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[26]。因炎癥因子刺激，皮膚免疫性疾病微環(huán)境常處于低氧狀態(tài)，微環(huán)境低氧會使機體產(chǎn)生保護性生理生化反應以維持血氧穩(wěn)定[27]。因此作者推測，miRNA-137的上調(diào)能夠逆轉COX-2介導低氧誘導的細胞毒性以及炎癥損傷作用。ZHANG等[3]通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CCOX-2是miRNA-137的潛在靶基因，并證實COX-2的過表達可能反過來抑制miRNA-137的抗增殖作用。本研究結果顯示，在LP病人皮膚組織中，miRNA-137的表達減少，miRNA-137和COX-2的表達呈負相關關系。因此，miRNA-137可能是COX-2的潛在抑制劑。一項有關胃癌的研究表明，恢復miRNA-137功能可能是一種降低COX-2表達，從而在體內(nèi)外減弱腫瘤侵襲性的替代方法[28]。YUAN等[29]認為，相比傳統(tǒng)靶向單一蛋白的治療藥物，靶向miRNA（如miRNA-137）可能是一種改進的癌癥治療策略。這些研究結果為我們提供了一個新的視角，即通過調(diào)控miRNA的表達來調(diào)控其下游靶點。

綜上所述，miRNA-137可能是COX-2的一種有效抑制劑，通過調(diào)控COX-2在LP中發(fā)揮作用，miRNA-137可能會成為LP分子治療的潛在工具。

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（本文編輯馬偉平）