［摘要］目的探討殼聚糖基溫敏水凝膠載體（4D-CTH）對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）的生物相容性以及對(duì)全層皮膚創(chuàng)面的修復(fù)作用。方法采用酶消化法提取原代兔ADSCs，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和多向分化實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行鑒定。體外共培養(yǎng)4D-CTH和ADSCs，分別采用活/死細(xì)胞染色、CCK-8以及熒光劃痕方法測(cè)定4D-CTH的生物相容性。構(gòu)建皮膚全層缺損模型，隨機(jī)將兔分為Control組（用100 μL PBS緩沖液對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行處理）、ADSCs組（用100 μL ADSCs懸液對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行處理）以及4D-CTH＋ADSCs組（應(yīng)用4D-CTH轉(zhuǎn)載ADSCs對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行處理）。在治療14 d后，拍照觀(guān)察各組創(chuàng)面愈合率。結(jié)果提取的兔ADSCs呈長(zhǎng)梭形，其表面標(biāo)記分子CD44、CD90呈陽(yáng)性表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD45以及巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD11b呈陰性表達(dá)，ADSCs具備多向分化潛力?；?死細(xì)胞染色結(jié)果顯示，組別、時(shí)間、組別和時(shí)間的交互效應(yīng)對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響（F組別=0.716，Pgt;0.05；F時(shí)間=1.219，Pgt;0.05；F組別×?xí)r間=1.567，Pgt;0.05）。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，組別、組別和時(shí)間的交互效應(yīng)對(duì)細(xì)胞增殖率無(wú)影響（F組別=1.995，Pgt;0.05； F組別×?xí)r間=0.321，Pgt;0.05），不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間=1 408.000，Plt;0.01）。熒光劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，組別、組別和時(shí)間的交互效應(yīng)對(duì)細(xì)胞遷移率無(wú)影響（F組別=2.184，Pgt;0.05；F組別×?xí)r間=0.108，Pgt;0.05），不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞遷移率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間=50.110，Plt;0.01）。創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組創(chuàng)面愈合率差異有顯著意義（F=9.778～49.910，Plt;0.01），4D-CTH＋ADSCs組創(chuàng)面愈合率最高。結(jié)論4D-CTH轉(zhuǎn)載ADSCs可以加速皮膚創(chuàng)面愈合，促進(jìn)皮膚再生。

［關(guān)鍵詞］生物打印；干細(xì)胞；皮膚；再生

［中圖分類(lèi)號(hào)］R318.1［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號(hào)］2096-5532（2024）03-0376-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.082［開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240625.1417.005;2024-06-2609：11：11

Wound repair effect of adipose-derived mesenchymal stem cell-loaded bioprinted scaffoldSUN Xueqing， HAN Dan， WANG Mengyuan， QU Lijun， XU Wenhua （Institute of Textile and Apparel， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［Abstract］ObjectiveTo investigate the biocompatibility of chitosan-based thermosensitive hydrogel carrier （4D-CTH） with adipose-derived mesenchymal stem cells （ADSCs） and its repair effect on full-layer skin wounds.MethodsThe enzyme digestion method was used to extract primary rabbit ADSCs， and flow cytometry and multidirectional differentiation were used for identification. 4D-CTHand ADSCs were co-cultured in vitro， and live/death cell staining， CCK-8 assay， and fluorescent scratch assay were used to assess the biocompatibility of 4D-CTH. A model of full-layer skin defect was established， and rabbits were randomly divi-ded into Control group （wound was treated with 100 μL PBS buffer）， ADSCs group （wound was treated with 100 μL ADSCs suspension）， and 4D-CTH+ADSCs group （wound was treated with 4D-CTH-reproduced ADSCs）. After 14 d of treatment， photos were taken to observe the wound healing rate of each group.ResultsThe rabbit ADSCs sextracted were spindle-shaped， with positive expression of the surface marker molecules CD44 and CD90 and negative expression of the endothelial cell marker CD45 and the macrophage marker CD11b， and ADSCs had the potential of multidirectional differentiation. Live/dead cell staining showed that group， time，and the interaction effect of group and time had no effect on cell viability （Fgroup=0.716，Pgt;0.05;Ftime=1.219，Pgt;0.05;Fgroup×time=1.567，Pgt;0.05）. CCK-8 assay showed that group and the interaction effect of group and time had no effect on cell proliferation rate （Fgroup=1.995，Pgt;0.05;Fgroup×time=0.321，Pgt;0.05）， and there was a significant difference in cell proliferation rate between different time points （Ftime=1 408.000，Plt;0.01）. Fluorescent scratch assayshowed that group and the interaction effect of group and time had no effect on cell migration rate （Fgroup=2.184，Pgt;0.05;Fgroup×time=0.108，Pgt;0.05）， and there was a significant difference in cell migration rate between different time points （Ftime=50.110，Plt;0.01）. Wound healing assay showed that the 4D-CTH+ADSCs group had the highest wound healing rate （F=9.778-49.910，Plt;0.01）. Conclusion4D-CTH-reproduced ADSCs can accelerate skin wound healing and promote skin regeneration.

［Key words］bioprinting; stem cells; skin; regeneration

創(chuàng)面愈合是一個(gè)動(dòng)態(tài)且復(fù)雜的過(guò)程。當(dāng)創(chuàng)面損傷嚴(yán)重或人體處于疾病狀態(tài)時(shí)，創(chuàng)面難以愈合[1-3]。近年來(lái)，干細(xì)胞療法在加速創(chuàng)面愈合方面顯示出一定的潛力[4-5]。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）易于從脂肪組織中獲得，來(lái)源充足[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs可促進(jìn)血管生成、膠原蛋白沉積、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加速創(chuàng)面愈合[9-10]。但傳統(tǒng)的注射方法缺乏對(duì)干細(xì)胞的保護(hù)，導(dǎo)致干細(xì)胞駐留率、活力以及治療效果均大大降低[11-14]。我們的前期研究顯示，采用低溫生物打印技術(shù)制備孔徑均一的新型殼聚糖基溫敏水凝膠載體（4D-CTH）可以提高干細(xì)胞轉(zhuǎn)載率，增強(qiáng)干細(xì)胞療效[15]。本研究旨在利用4D-CTH來(lái)轉(zhuǎn)載兔ADSCs，評(píng)估4D-CTH的體外生物相容性，探討其對(duì)皮膚創(chuàng)面的修復(fù)效果，從而為皮膚創(chuàng)面的修復(fù)提供一種新型的治療方法。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

Ⅰ型膠原酶購(gòu)自Solarbio公司。磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素雙抗、AM/PI混合染色試劑、兔ADSCs的成脂以及成骨誘導(dǎo)試劑均購(gòu)自meilunbio公司。胎牛血清購(gòu)自ExCell生物公司。流式細(xì)胞術(shù)所用抗體均來(lái)自Thermo Fisher Scientific公司。CCK-8試劑來(lái)自TargetMol中國(guó)（陶術(shù)生物）公司。新西蘭大白兔購(gòu)自青島康大愛(ài)博生物科技有限公司。本研究經(jīng)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并嚴(yán)格按照《中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》中的建議進(jìn)行動(dòng)物處理。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1ADSCs的分離與培養(yǎng)取健康新西蘭大白兔1只，稱(chēng)質(zhì)量后，用10 g/L戊巴比妥鈉（3 mL/kg）經(jīng)耳緣靜脈注射進(jìn)行麻醉。常規(guī)術(shù)前準(zhǔn)備，無(wú)菌條件下取大白兔雙側(cè)腹股溝部脂肪組織放入培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，用含有體積分?jǐn)?shù)0.10雙抗的無(wú)菌 PBS清洗3遍，放入含有體積分?jǐn)?shù)0.001 Ⅰ型膠原酶的50 mL離心管中，放入搖床震蕩消化（37 ℃，140 r/min，60 min），離心后棄上清，用細(xì)胞篩過(guò)濾，將濾液接種至培養(yǎng)皿中，放入37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2ADSCs純度的鑒定采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定提取的ADSCs特異性標(biāo)記物CD44和CD90、內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD45和巨噬細(xì)胞CD11b的表達(dá)。當(dāng)分離培養(yǎng)后的細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時(shí)，消化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，用40 g/L多聚甲醛固定15 min，洗去多聚甲醛，加入含BSA的PBS（wash buffer）封閉20 min，然后加入100 μL稀釋好的直標(biāo)一抗，置4 ℃避光孵育30 min，wash buffer洗2遍后，wash buffer重懸后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。如果是非直標(biāo)一抗，4 ℃避光孵育30 min之后，wash buffer洗2遍，加入100 μL稀釋好的二抗，避光孵育30 min，用wash buffer洗2遍之后加入wash buffer 重懸，使用CytoFLEX流式細(xì)胞儀（Beckman，中國(guó)）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析，并使用FlowJoV10軟件生成直方圖。

1.2.3ADSCs多向分化能力的鑒定①ADSCs誘導(dǎo)成脂：將細(xì)胞以1×108個(gè)/L的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到100%時(shí)按照成脂誘導(dǎo)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行誘導(dǎo)成脂操作，3周后油紅O染色，顯微鏡下觀(guān)察。②A(yíng)DSCs誘導(dǎo)成骨：細(xì)胞以1×108個(gè)/L的密度接種于6孔板中，等待細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時(shí)，吸棄上清，PBS清洗2遍。按照成骨誘導(dǎo)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行誘導(dǎo)成骨操作，3周后茜素紅染色，顯微鏡下觀(guān)察。

1.2.44D-CTH載體的生物相容性檢測(cè)①采用活/死細(xì)胞染色法觀(guān)察載體對(duì)細(xì)胞活力的影響。將細(xì)胞接種于6孔板中，密度為1×108個(gè)/L，然后將4D-CTH載體浸入其中一組的培養(yǎng)液中。待連續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，加入AM/PI 混合染色工作液染色15 min，PBS清洗2遍后，用熒光顯微鏡觀(guān)察染色結(jié)果并拍照，應(yīng)用Image J軟件分析并計(jì)算活/死細(xì)胞的數(shù)量。②采用CCK-8法分析細(xì)胞毒性和細(xì)胞活力。在細(xì)胞與載體連續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h后，根據(jù)說(shuō)明書(shū)加入合適比例的CCK-8試劑，檢測(cè)兩組細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，應(yīng)用Image J軟件分析細(xì)胞活力。

1.2.5細(xì)胞遷移檢測(cè)采用熒光劃痕法檢測(cè)4D-CTH載體對(duì)ADSCs細(xì)胞遷移能力的影響。先將ADSCs接種于6孔板中，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，使用滅菌槍頭橫穿6孔板底，制成第一條劃痕，平行第一條劃痕的方向制作其余兩條劃痕。加入含有體積分?jǐn)?shù)0.02血清的培養(yǎng)液，一組加入4D-CTH載體，對(duì)照組不做處理，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)0、12、24 h后，加入AM染色工作液染色15 min，利用倒置顯微鏡觀(guān)察每孔細(xì)胞遷移的情況并拍照，應(yīng)用Image J軟件分析各孔劃痕愈合率。

378青島大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）60卷

1.2.6體內(nèi)傷口愈合研究取9只新西蘭大白兔，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，稱(chēng)質(zhì)量，在兔架上固定兔子，按照3 mL/kg的劑量在耳緣靜脈處注射10 g/L戊巴比妥鈉麻醉。麻醉后，將兔的背部皮膚剃毛，用5 g/L碘附消毒周?chē)つw，使用皮膚取樣器和鑷子在其背部中線(xiàn)兩側(cè)各造一個(gè)直徑為2 cm的圓形全層傷口。然后將兔隨機(jī)分為3組，每組3只：PBS組用100 μL PBS緩沖液對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行處理，ADSCs組用100 μL ADSCs懸液（1×106個(gè)細(xì)胞）對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行處理，4D-CTH+ADSCs組用4D-CTH轉(zhuǎn)載ADSCs對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行處理，隨后用無(wú)菌紗布覆蓋創(chuàng)面。分別于治療后第0、4、7、10和 14天對(duì)受傷區(qū)域拍照觀(guān)察損傷修復(fù)情況，并使用Image J軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用雙因素或單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1ADSCs的表征和鑒定

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，ADSCs CD44和CD90陽(yáng)性表達(dá)率分別為93.33%、90.11%，CD11b和CD45陰性表達(dá)，空白對(duì)照均為陰性表達(dá)。見(jiàn)圖1。成脂誘導(dǎo)結(jié)果顯示，ADSCs多數(shù)變?yōu)楸鈭A形或圓形的脂肪細(xì)胞，大量脂滴均被染為紅色。成骨誘導(dǎo)分化結(jié)果顯示，ADSCs 的形態(tài)變?yōu)槎嘟切?，骨結(jié)節(jié)形成明顯，多個(gè)骨結(jié)節(jié)被染為紅色。見(jiàn)圖2。

2.24D-CTH載體對(duì)細(xì)胞增殖和遷移、細(xì)胞相容性的影響

活/死細(xì)胞染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，ADSCs與4D-CTH 載體共培養(yǎng)24、48、72 h后，細(xì)胞能夠維持原有的形態(tài)（圖3A），而且細(xì)胞存活率在90%以上。對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行定量分析顯示，組別、時(shí)間、組別和時(shí)間的交互效應(yīng)對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響（F組別=0.716，Pgt;0.05；F時(shí)間=1.219，Pgt;0.05；F組別×?xí)r間=1.567，Pgt;0.05）（圖3B）。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，吸光度值增加，說(shuō)明細(xì)胞保持了良好的活力和增殖能力（圖3C）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，兩組細(xì)胞增殖率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組別=1.995，Pgt;0.05），不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間=1 408.000，Plt;0.01），組別和時(shí)間的交互效應(yīng)對(duì)細(xì)胞增殖率無(wú)明顯影響（F組別×?xí)r間=0.321，Pgt;0.05）。熒光劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，組別、組別和時(shí)間的交互效應(yīng)對(duì)細(xì)胞遷移率無(wú)影響（F組別=2.184，Pgt;0.05；F組別×?xí)r間=0.108，Pgt;0.05），不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞遷移率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間=50.110，Plt;0.01）。見(jiàn)圖4。

2.34D-CTH＋ADSCs對(duì)傷口愈合的影響

肉眼觀(guān)察顯示，隨著治療時(shí)間的增加，各組創(chuàng)面面積逐漸減小。方差分析顯示，皮膚創(chuàng)面修復(fù)率組別、時(shí)間、組別與時(shí)間交互作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組別=35.650，Plt;0.01；F時(shí)間=276.90，Plt;0.01；F組別×?xí)r間=2.815，Plt;0.05）。單獨(dú)效應(yīng)分析顯示，處理后的第4、7、10和14天時(shí)，各組間創(chuàng)面愈合率差異有顯著性（F=9.778～49.910，Plt;0.01），4D-CTH載體轉(zhuǎn)載ADSCs促進(jìn)了創(chuàng)面愈合。見(jiàn)圖5。

3討論

作為成體干細(xì)胞的一種，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源廣泛，易于提取，在組織損傷修復(fù)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其中ADSCs具有多向分化能力，既可以分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞，還能分化為皮膚相關(guān)的角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞等。但有研究發(fā)現(xiàn)，采用傳統(tǒng)局部注射方法移植后的ADSCs在創(chuàng)面的缺血低氧微環(huán)境中存活率不高，療效不佳。本研究利用課題組前期開(kāi)發(fā)的4D-CTH載體轉(zhuǎn)載兔ADSCs[15]，從在體實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩方面研究顯示4D-CTH轉(zhuǎn)載ADSCs對(duì)皮膚創(chuàng)面有修復(fù)作用。良好的生物相容性是確保生物材料進(jìn)行臨床應(yīng)用的必要條件。本文用于皮膚創(chuàng)面修復(fù)的生物支架4D-CTH會(huì)直接與血液和組織接觸，因此本研究利用活/死細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、CCK-8法以及劃痕實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了4D-CTH具有良好的生物相容性，為下一步將4D-CTH應(yīng)用于體內(nèi)創(chuàng)面修復(fù)奠定了基礎(chǔ)。

近年來(lái)的研究表明，ADSCs通過(guò)直接的細(xì)胞間接觸和旁分泌作用等兩種方式增加生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的分泌[16-17]。在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中，ADSCs不僅可以促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞的增殖，而且在血管生成和創(chuàng)面愈合的再上皮化階段中均扮演著不可或缺的角色，因此是治療慢性創(chuàng)面中使用最廣泛的間充質(zhì)干細(xì)胞類(lèi)型之一[18]。本研究通過(guò)創(chuàng)面修復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了4D-CTH作為干細(xì)胞載體的有效性，4D-CTH+ADSCs組的創(chuàng)面愈合率最高，愈合速度最快，說(shuō)明4D-CTH轉(zhuǎn)載ADSCs可以促進(jìn)皮膚基質(zhì)再生，加速皮膚創(chuàng)面愈合。

綜上所述，4D-CTH具有良好的生物相容性，可以保持ADSCs活力，促進(jìn)ADSCs增殖；應(yīng)用4D-CTH支架轉(zhuǎn)載ADSCs，4D-CTH提高了干細(xì)胞療效，顯著促進(jìn)了皮膚創(chuàng)面愈合。4D-CTH可以作為ADSCs治療創(chuàng)面的有效載體，通過(guò)提高創(chuàng)面細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平，最終改善創(chuàng)面修復(fù)和皮膚再生。

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（本文編輯黃建鄉(xiāng)）