［摘要］目的研究反復(fù)禁錮應(yīng)激（RRS）和單次延長(zhǎng)應(yīng)激（SPS）對(duì)小鼠恐懼記憶及其泛化的影響。方法將8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為4組，實(shí)驗(yàn)組分別采用RRS和SPS處理，相應(yīng)對(duì)照組未經(jīng)任何處理。利用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的焦慮水平，利用場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的恐懼記憶及其泛化。結(jié)果應(yīng)激處理7 d后，RRS組和SPS組小鼠與其對(duì)照組相比均表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為（t=5.043、5.364，Plt;0.01）。RRS組小鼠電擊24 h后在電擊場(chǎng)景的僵立時(shí)間與對(duì)照小鼠相比無明顯差別（Pgt;0.05），電擊7、14 d后RRS小鼠在電擊場(chǎng)景的僵立時(shí)間百分比仍明顯高于新場(chǎng)景（Plt;0.001）。SPS組小鼠電擊24 h后在電擊場(chǎng)景的僵立時(shí)間百分比明顯高于對(duì)照組（Plt;0.01），兩組小鼠在電擊場(chǎng)景的僵立時(shí)間百分比均高于新場(chǎng)景；電擊7 d后SPS小鼠在電擊場(chǎng)景的僵立時(shí)間與新場(chǎng)景相比無明顯差別，對(duì)照小鼠在電擊場(chǎng)景的僵立時(shí)間百分比仍明顯高于新場(chǎng)景。結(jié)論SPS可增強(qiáng)小鼠場(chǎng)景恐懼記憶并促進(jìn)其泛化，RRS對(duì)小鼠的場(chǎng)景恐懼記憶及其泛化無明顯影響。

［關(guān)鍵詞］應(yīng)激障礙，創(chuàng)傷后；焦慮；恐懼；記憶障礙；小鼠，近交C57BL

［中圖分類號(hào)］R749.72［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號(hào)］2096-5532（2024）03-0372-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.099［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240729.1543.003;2024-07-3015：53：52

Effects of different stress paradigms on fear memory and its generalization in miceWANG Dengxu， GAO Shanshan， LI Nan， CHEN Lei， LI Boyi， ZHOU Yu （Department of Physiology and Pathophysiology， Basic Medical College， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［Abstract］ObjectiveTo investigate the effects of repeated restraint stress （RRS） and single prolonged stress （SPS） on fear memory and its generalization in mice. MethodsEight-week-old male C57BL/6J mice were randomly divided into four groups. The experimental groups were treated with either RRS or SPS， while the corresponding control groups underwent no treatment. Anxiety levels were assessed using the elevated plus maze test， and fear memory and its generalization were evaluated using the fear conditioning test. ResultsSeven days after stress treatment， both RRS and SPS mice exhibited significant anxiety-like behaviors compared to control mice （t=5.043，5.364;Plt;0.01）. Twenty-four hours after shock， the freezing time in the shock context did not differ significantly between RRS mice and control mice （Pgt;0.05）. However， on days 7 and 14 after shock， the freezing time in the shock context was still significantly higher in RRS mice compared to a new context （Plt;0.001）. For SPS mice， their freezing levels in the shock context 24 hours post-shock were significantly higher than those in control mice （Plt;0.01）. Both groups showed higher freezing time in the shock context compared to a new context; however， 7 days post-shock， the freezing time in the shock context for SPS mice did not differ significantly from that in the new context， whereas control mice showed significantly higher freezing time in the shock context compared to the new context.ConclusionSPS enhances contextual fear memory and promotes its generalization in mice， while RRS has no significant impact on contextual fear memory or its generalization.

［Key words］stress disorders， post-traumatic; anxiety; fear; memory disorders; mice， inbred C57BL

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（PTSD）是個(gè)體在面臨強(qiáng)烈創(chuàng)傷性刺激（如戰(zhàn)爭(zhēng)、自然災(zāi)害、嚴(yán)重事故等）后產(chǎn)生的，嚴(yán)重影響人類身心健康的一種精神性疾病[1-3]。PTSD的病因復(fù)雜、機(jī)制不明[4-6]，目前尚未構(gòu)建出可以完全模擬PTSD的動(dòng)物模型，因此建立效應(yīng)好的動(dòng)物模型是研究其機(jī)制的關(guān)鍵。反復(fù)禁錮應(yīng)激（RRS）和單次延長(zhǎng)應(yīng)激（SPS）是目前認(rèn)同度比較高的PTSD建模方法，被應(yīng)用于大鼠PTSD發(fā)病機(jī)制的研究[7-10]。小鼠作為最常用的模型動(dòng)物，上述應(yīng)激模型能否有效模擬小鼠PTSD核心特征——恐懼記憶的過度泛化，目前并不清楚[11-13]。為此，本研究采用RRS和SPS兩種不同的應(yīng)激方式對(duì)小鼠進(jìn)行處理，通過高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的焦慮樣行為，隨后檢測(cè)小鼠的場(chǎng)景恐懼記憶及其泛化，對(duì)PTSD造模效果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為PTSD的研究和治療提供更多的新思路。

1材料與方法

1.1動(dòng)物及其分組

C57BL/6J小鼠（8周齡雄鼠，體質(zhì)量為25～30 g）飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部清潔級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，自由進(jìn)食和飲水，12 h-12 h晝夜循環(huán)光照，保持室內(nèi)恒濕（50±10）%、恒溫（21±2）℃狀態(tài)。在全部飼養(yǎng)過程及實(shí)驗(yàn)過程中小鼠均自由進(jìn)食和飲水，實(shí)驗(yàn)前對(duì)小鼠的健康狀況進(jìn)行評(píng)估，將小鼠隨機(jī)分分為4 組：RRS組7只及其對(duì)照組7只；SPS組8只及其對(duì)照組10只。所有行為學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均得到青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1RRS實(shí)驗(yàn)使用異氟烷輕度麻醉小鼠后，將其置入禁錮器中（直徑2.5 cm、長(zhǎng)度10.0 cm透明且通氣良好的塑料管），關(guān)閉禁錮器兩端，使小鼠身體和頭部活動(dòng)受限，期間密切關(guān)注小鼠的行為和生理狀態(tài)。每天禁錮1 h，連續(xù)4 d。

1.2.2SPS實(shí)驗(yàn)將小鼠置入禁錮器中持續(xù)禁錮2 h（方法同1.2.1）后，強(qiáng)迫小鼠在25 ℃溫水中游泳10 min。將小鼠放回干凈籠具中休息15 min后，使用異氟烷進(jìn)行短暫麻醉，再轉(zhuǎn)移至其固定飼養(yǎng)的籠具中休息30 min，然后將小鼠放入電擊箱進(jìn)行足底電擊。電擊時(shí)先讓小鼠在電擊箱中自由探索3 min，接著給予0.75 mA持續(xù)2 s的足底電擊，電擊結(jié)束后將小鼠放回固定飼養(yǎng)的籠具中。

1.2.3高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)高架十字迷宮由4個(gè)臂組成（高度45 cm），包括兩個(gè)閉合臂和兩個(gè)開放臂（長(zhǎng)度35 cm、直徑5 cm）。記錄小鼠行為的攝像頭位于迷宮中央正上方。實(shí)驗(yàn)之前，噴灑體積分?jǐn)?shù)0.70乙醇溶液消毒，確保環(huán)境清潔和無干擾。同時(shí)，調(diào)節(jié)燈光確保光線不影響小鼠在開放臂和閉合臂的活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，小鼠被放置在迷宮中央，面向開放臂。攝像頭記錄5 min內(nèi)小鼠在開放臂和閉合臂的停留時(shí)間，計(jì)算在開放臂停留時(shí)間百分比。每次實(shí)驗(yàn)后，用體積分?jǐn)?shù)0.70乙醇溶液清潔迷宮，以消除前一只小鼠留下的痕跡。

1.2.4場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)①場(chǎng)景恐懼訓(xùn)練：將小鼠放入實(shí)驗(yàn)箱中自由探索2.5 min以適應(yīng)環(huán)境，分別在2.5、3.5、4.5 min時(shí)進(jìn)行足底電擊1次。3次電擊強(qiáng)度相同，均為0.75 mA的電流持續(xù)2 s。電擊結(jié)束后，將小鼠放回固定飼養(yǎng)的籠具中。②場(chǎng)景恐懼測(cè)試：將小鼠依次放入電擊場(chǎng)景和新場(chǎng)景中自由探索5.0 min，分析小鼠在兩個(gè)場(chǎng)景中的僵立時(shí)間占總時(shí)間的百分比。當(dāng)小鼠在電擊場(chǎng)景的僵立時(shí)間百分比明顯高于新場(chǎng)景時(shí)，判定為小鼠恐懼記憶模型建立成功。而在更遠(yuǎn)時(shí)間點(diǎn)電擊場(chǎng)景和新場(chǎng)景中的僵立時(shí)間百分比無明顯差異時(shí)，說明小鼠無法正確區(qū)分兩個(gè)場(chǎng)景，即發(fā)生了恐懼記憶的泛化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Graph Pad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s形式表示，兩組高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；兩組場(chǎng)景恐懼行為學(xué)測(cè)試結(jié)果的均數(shù)比較采用兩因素析因設(shè)計(jì)方差分析。以Plt;0.05表示差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1RRS對(duì)小鼠焦慮、場(chǎng)景恐懼記憶及其泛化影響

高架十字迷宮測(cè)試結(jié)果顯示，RRS造模后第7天小鼠在開放臂停留時(shí)間百分比明顯低于對(duì)照組，差異有顯著性（t=5.364，Plt;0.01），表明RRS小鼠焦慮水平明顯提高。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行場(chǎng)景恐懼訓(xùn)練，在訓(xùn)練后第1、7和14天進(jìn)行場(chǎng)景恐懼記憶測(cè)試。3次測(cè)試結(jié)果的析因設(shè)計(jì)方差分析顯示，組別與場(chǎng)景之間交互效應(yīng)差異均無顯著性（F交互=1.043～1.801，P均gt;0.05），組別因素主效應(yīng)差異均無顯著意義（F組別=0.033～2.078， P均gt;0.05），場(chǎng)景因素主效應(yīng)差異均有顯著意義（F場(chǎng)景=34.700～165.500，P均lt;0.000 1）。單獨(dú)效應(yīng)分析顯示，在電擊場(chǎng)景下對(duì)照組與RRS組比較差異均無顯著性（F=0.265～2.717，P均gt;0.05），在新場(chǎng)景下對(duì)照組與RRS組比較差異均無顯著意義（F=0.036～0.346，P均gt;0.05）。在對(duì)照組組內(nèi)，電擊場(chǎng)景與新場(chǎng)景比較差異均有顯著性（F=7.597～30.105，P均lt;0.001）；在RRS組內(nèi)，電擊場(chǎng)景與新場(chǎng)景比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.926～77.131，P均lt;0.000 1）。在第1天測(cè)試中，兩組小鼠在電擊場(chǎng)景的僵立時(shí)間百分比與新場(chǎng)景比較，差異均有顯著性（P均lt;0.000 1），即兩組小鼠成功建立場(chǎng)景恐懼記憶。在第7和14天的僵立時(shí)間百分比測(cè)試中，兩組小鼠在電擊場(chǎng)景的僵立時(shí)間仍均高于新場(chǎng)景（Plt;0.001、0.01），表明兩組小鼠在成功建立場(chǎng)景恐懼記憶后的第7和14天并未發(fā)生泛化。提示RRS可提高小鼠焦慮水平，但不影響小鼠的場(chǎng)景恐懼記憶的形成及其泛化。見表1。

2.2SPS對(duì)小鼠焦慮、場(chǎng)景恐懼記憶及其泛化影響

在SPS造模后的第7天進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SPS組小鼠在開放臂停留時(shí)間更短（t=5.043，Plt;0.001），表明SPS小鼠的焦慮水平顯著提高。在完成場(chǎng)景恐懼訓(xùn)練后第1、7天進(jìn)行場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)。2次測(cè)試結(jié)果的析因設(shè)計(jì)方差分析顯示，不同組別與場(chǎng)景之間交互效應(yīng)差異均無顯著性（F交互=0.262、0.982，P均gt;0.05），組別因素主效應(yīng)差異均有顯著性（F組別=11.980、14.990，P均lt;0.01），場(chǎng)景因素主效應(yīng)差異均有顯著性（F場(chǎng)景=6.924、47.530，P均lt;0.01）。單獨(dú)效應(yīng)分析顯示，電擊場(chǎng)景下對(duì)照組與SPS組在第1天比較差異有顯著性（F=13.141，Plt;0.01），而在第7天比較差異無顯著性（F=2.846，Pgt;0.05）；新場(chǎng)景下對(duì)照組與RRS組在第1、7天比較差異均有顯著性（F=4.776、5.411，P均lt;0.05）。對(duì)照組在第1、7天的電擊場(chǎng)景與新場(chǎng)景比較差異均有顯著性（F=9.637、13.238，P均lt;0.01）；SPS組在第1天的電擊場(chǎng)景與新場(chǎng)景比較差異有顯著性（F=10.490，Plt;0.01），而在第7天比較差異無顯著性（F=1.434，Pgt;0.05）。第1天的測(cè)試結(jié)果顯示，兩組小鼠在新場(chǎng)景和電擊場(chǎng)景中的僵立時(shí)間百分比均存在顯著差異，表明兩組小鼠均成功建立場(chǎng)景恐懼記憶；而且SPS組小鼠在電擊場(chǎng)景中的僵立時(shí)間百分比明顯高于對(duì)照組，表明SPS應(yīng)激明顯提高小鼠的場(chǎng)景恐懼記憶。在完成場(chǎng)景恐懼訓(xùn)練后第7天的測(cè)試結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠在電擊場(chǎng)景的僵立時(shí)間百分比依舊明顯高于新場(chǎng)景，而SPS組小鼠在新場(chǎng)景的僵立時(shí)間百分比與電擊場(chǎng)景的差異已無顯著性，表明SPS促進(jìn)了小鼠場(chǎng)景恐懼記憶泛化。提示SPS不僅提高小鼠的焦慮水平，而且強(qiáng)化了小鼠的場(chǎng)景恐懼記憶并促其泛化。見表2。

3討論

恐懼記憶的泛化是指?jìng)€(gè)體在經(jīng)歷恐懼后，對(duì)于與恐懼刺激相似或相關(guān)的刺激也產(chǎn)生恐懼反應(yīng)的現(xiàn)象，這是PTSD等疾病中創(chuàng)傷重現(xiàn)和警覺性增高的重要原因[14-15]。PTSD病人經(jīng)常無法有效區(qū)分危險(xiǎn)與安全環(huán)境，在安全環(huán)境中依然表現(xiàn)出較高的恐懼反應(yīng)[16]，而這種不恰當(dāng)?shù)膽?yīng)激反應(yīng)給病人帶來了極大的痛苦和傷害[17-18]。因此，建立穩(wěn)定且有效的PTSD模型，對(duì)于深入探討PTSD病人恐懼記憶過度泛化的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。RRS和SPS是兩種常見的PTSD造模方式，以往的文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)激后經(jīng)過一定潛伏期，焦慮樣表型會(huì)更加明顯[19]。例如，小鼠在RRS剛結(jié)束后不會(huì)立即產(chǎn)生焦慮行為，而是在第7～12天時(shí)焦慮樣行為最明顯，具體表現(xiàn)為RRS小鼠在第7天后的高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，在開放臂的停留時(shí)間明顯縮短[19]；大鼠在SPS應(yīng)激后7 d表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為，具體表現(xiàn)為大鼠在高架十字迷宮中開放臂的停留時(shí)間明顯縮短[20]。本文結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，SPS組與RRS組小鼠均在第7天表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為。這與以往報(bào)道的結(jié)果相符。

已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，正常非應(yīng)激小鼠在恐懼記憶形成后3～4周才會(huì)逐漸出現(xiàn)記憶的泛化[21]，即在電擊場(chǎng)景和新場(chǎng)景中的僵立時(shí)間無差別。本文結(jié)果表明，SPS組小鼠在恐懼記憶形成后第1天表現(xiàn)為場(chǎng)景恐懼記憶的增強(qiáng)，并且在第7天就已經(jīng)出現(xiàn)了場(chǎng)景恐懼記憶的泛化，提示SPS導(dǎo)致小鼠發(fā)生恐懼記憶的過度泛化。但RRS組小鼠在恐懼記憶形成后第1～7天均未發(fā)生恐懼記憶的增強(qiáng)和泛化，究其原因可能是SPS的應(yīng)激源是多樣的，而RRS的應(yīng)激源是單一的且與誘發(fā)恐懼事件無直接關(guān)系。因此，SPS組小鼠在恐懼記憶形成后1周即出現(xiàn)明顯的記憶泛化，而RRS組小鼠在同一（第7天）或更遠(yuǎn)程的時(shí)間點(diǎn)（第15天）都沒有出現(xiàn)恐懼記憶的泛化，即RRS小鼠恐懼記憶泛化的時(shí)間點(diǎn)要遠(yuǎn)大于15 d。

綜上所述，RRS和SPS均能夠引起小鼠的焦慮樣行為，SPS可以顯著增強(qiáng)小鼠的恐懼記憶并促進(jìn)其泛化，RRS則對(duì)小鼠的恐懼記憶及其泛化無明顯影響。本研究結(jié)果進(jìn)一步說明不同應(yīng)激模式對(duì)恐懼記憶及其泛化的影響不同，SPS不僅能夠模擬小鼠PTSD焦慮樣行為，而且還能模擬PTSD恐懼記憶的過度泛化這一核心癥狀。本實(shí)驗(yàn)通過比較不同應(yīng)激方式對(duì)恐懼記憶及其泛化的影響，明確了SPS是更適用于小鼠恐懼記憶泛化研究的PTSD模型，為未來針對(duì)恐懼記憶泛化的神經(jīng)機(jī)制研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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