［摘要］目的探究1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）慢性帕金森病（PD）模型小鼠步態(tài)改變。方法模型組8周齡雄性C57BL/6小鼠給予腹腔注射MPTP（30 mg/kg體質(zhì)量，每周2次，共4周），對(duì)照組注射等量的生理鹽水，每組10只。采用動(dòng)物步態(tài)分析系統(tǒng)（CatWalk）分別檢測(cè)兩組注射后1、2、3和4周小鼠步態(tài)相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果步態(tài)分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，模型組的運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間、站立時(shí)間、腳步周期顯著增加，平均速度、身體速度顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.209～5.176，P＜0.05）。提示小鼠的步態(tài)發(fā)生改變。結(jié)論MPTP慢性模型可以引起小鼠步態(tài)變化。

［關(guān)鍵詞］帕金森?。?-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶；步態(tài)分析；模型，動(dòng)物；小鼠，近交C57BL

［中圖分類(lèi)號(hào)］R742.5;R442.9［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號(hào)］2096-5532（2024）03-0364-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.098［開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240729.1543.002;2024-07-3014：35：51

Gait changes in a mouse model of chronic Parkinson’s disease induced by 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridineXIU Min-xia， XIE Ruyi， XIE Junxia， SHI Limin （Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

［Abstract］ObjectiveTo investigate gait changes in a mouse model of chronic Parkinson’s disease （PD） induced by 1-met-hyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine （MPTP）.MethodsMale C57BL/6 mice， aged 8 weeks， were intraperitoneally injec-ted with MPTP （30 mg/kg） twice a week for 4 weeks， and the mice in the control group were injected with an equal volumeof normal saline， with 10 mice in each group. The animal gait analysis system （CatWalk） was used to measure gait-related parameters at 1， 2， 3， and 4 weeks after injection.ResultsThe results of gait analysis showed that compared with the control group， the model group had significant increases in run duration， stance， and step cycle and significant reductions in average speed and body speed （t=2.209-5.176，Plt;0.05）. These results suggested gait changes in mice. ConclusionGait changes are observed in a mouse model of chronic PD induced by MPTP.

［Key words］Parkinson disease; 1-methyl-4-phenyl-1， 2， 3， 6-tetrahydropyridine; gait analysis; models， animal; mice， inbred C57BL

帕金森?。≒D）是僅次于阿爾茨海默病的第二大神經(jīng)退行性疾病，60歲以上老年人口的發(fā)病率為1.5%～2.0%[1]。PD的主要病理特征是黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失，伴隨著路易小體的聚集、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生等[2-3]。臨床上，PD的主要癥狀包括靜止性震顫、僵硬、運(yùn)動(dòng)遲緩、姿勢(shì)不穩(wěn)和步態(tài)障礙等表現(xiàn)[1]。多種動(dòng)物模型的建立，有助于探索PD的發(fā)病機(jī)制和開(kāi)發(fā)有效的治療藥物[4-6]。神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)的小鼠模型是目前最常用的PD動(dòng)物模型之一[7-8]。根據(jù)給藥方案的不同，可將MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型大致分為急性、亞急性和慢性模型[9]。3種模型均可造成黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷及紋狀體多巴胺含量的降低，然而，小鼠是否會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙仍存在爭(zhēng)議[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)在C57BL/6小鼠腹腔注射MPTP制備慢性PD模型，采用更加直觀、精確、有效的動(dòng)物步態(tài)分析系統(tǒng)CatWalk，分別觀察小鼠在給藥1、2、3和4周后隨著疾病的進(jìn)展其步態(tài)的改變，為明確MPTP慢性PD模型小鼠運(yùn)動(dòng)功能的改變提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1材料與方法

1.1動(dòng)物及主要試劑

本實(shí)驗(yàn)選用的SPF級(jí)、7周齡、體質(zhì)量（22±2）g的雄性C57BL/6小鼠，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。將小鼠飼養(yǎng)于可自由攝食和飲水、12 h-12 h晝夜循環(huán)光照的SPF級(jí)清潔環(huán)境中1周后用于實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合青島大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)要求。MPTP購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，酪氨酸羥化酶（TH）抗體購(gòu)于美國(guó)Millipore公司，驢抗兔綠色熒光二抗購(gòu)于美國(guó) Thermo Fisher 公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2動(dòng)物分組及處理

動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周后，選取體質(zhì)量、大小大致相同的小鼠隨機(jī)分為8組（模型組和對(duì)照組各4組），每組10只，分別制備1、2、3和4周模型。模型組每周腹腔注射MPTP（30 mg/kg體質(zhì)量）2次，對(duì)照組注射等量的生理鹽水。分別在完成給藥或注射生理鹽水1、2、3和4周后的第2天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3步態(tài)分析

采用步態(tài)分析系統(tǒng)（CatWalk XT，Noldus，荷蘭）進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)前1 d對(duì)小鼠進(jìn)行訓(xùn)練，使小鼠能夠主動(dòng)且自由穿過(guò)設(shè)定長(zhǎng)度的檢測(cè)通道。實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)將小鼠置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)0.5 h以上。實(shí)驗(yàn)時(shí)，保持環(huán)境處于黑暗狀態(tài)，每只小鼠最少接受5次檢測(cè)，取其中3次（步幅、頻率較為均一）進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)其運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間（該Run采集持續(xù)時(shí)間）、站立時(shí)間（每一個(gè)爪子每一次與玻璃跑臺(tái)接觸的持續(xù)時(shí)間）、腳步周期（同一個(gè)爪子在初次與跑臺(tái)接觸到下一次與跑臺(tái)接觸的持續(xù)時(shí)間）、平均速度（該Run采集下小鼠身體跑過(guò)的平均速度）和身體速度（某一只特定爪子的一個(gè)腳步周期的身體速度）等。

1.4免疫熒光實(shí)驗(yàn)

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期的研究方法[11]，在步態(tài)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠進(jìn)行灌注取腦處理。將取出的鼠腦，放在盛有40 g/L多聚甲醛（PFA）的EP管中，4 ℃固定至少6 h。固定后，將鼠腦分別放置在200和300 g/L蔗糖溶液（用0.1 mol/L PBS 配制）中進(jìn)行梯度脫水，直至鼠腦沉到管底。梯度脫水結(jié)束后，進(jìn)行鼠腦冠狀切片。參照小鼠腦圖譜（第2版）確定黑質(zhì)所在區(qū)域，切成20 μm厚的連續(xù)冠狀組織切片，共收集4套（兩組每套各10張）腦片，存放于0.01 mol/L PBS溶液中，用于免疫熒光染色。取上述1套黑質(zhì)腦片進(jìn)行TH免疫熒光染色，經(jīng)過(guò)固定、封閉后置于TH一抗稀釋液（1∶3 000）中，4 ℃搖床過(guò)夜。次日，將腦片置于驢抗兔綠色熒光二抗稀釋液（1∶500）中，避光孵育2 h后漂洗。漂洗結(jié)束后，將腦片平鋪在防脫載玻片上，甘油封片。所有腦片均在Olympus數(shù)字病理切片掃描系統(tǒng)熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)TH陽(yáng)性細(xì)胞。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graph Pad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)所得計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s形式表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元免疫熒光染色比較

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目在注射1周后下降50%左右，并在第4周下降達(dá)80%～90%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.97～33.62，P＜0.001）。提示小鼠出現(xiàn)黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元損傷，建模成功。見(jiàn)圖1。

2.2MPTP對(duì)小鼠步態(tài)的影響

CatWalk系統(tǒng)檢測(cè)小鼠步態(tài)變化的結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠腳步步幅大小均一、步數(shù)穩(wěn)定；模型組小鼠腳步模式混亂、步態(tài)紊亂異常、步幅大小不一。與對(duì)照組相比，模型組出現(xiàn)步態(tài)參數(shù)改變，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.209～5.176，P＜0.05）。見(jiàn)表1。

3討論

MPTP及其作用機(jī)制的確定對(duì)PD的病理特性研究及新藥開(kāi)發(fā)產(chǎn)生了重大影響[12-13]。迄今為止，MPTP小鼠模型已成為最常用的PD動(dòng)物模型之一，并被廣泛用于研究多巴胺能神經(jīng)元變性的潛在分子機(jī)制。MPTP是一種親脂性很強(qiáng)的化合物，很容易穿過(guò)血-腦脊液屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在全身用藥后，MPTP 會(huì)在星形膠質(zhì)細(xì)胞中被單胺氧化酶B（MAO-B）轉(zhuǎn)化為1-甲基-4-苯基-2，3-二氫吡啶（MPDP+）。MPDP+是一種不穩(wěn)定的中間體，會(huì)發(fā)生自發(fā)氧化，生成1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）[14]。細(xì)胞外的MPP+隨后通過(guò)多巴胺能神經(jīng)元膜上的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（DAT）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，然后在線粒體中積聚，擾亂呼吸鏈復(fù)合物-Ⅰ，導(dǎo)致氧化應(yīng)激、ATP 生成減少，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[14-15]。MPTP制備的PD模型根據(jù)給藥時(shí)間的長(zhǎng)短主要分為3種：急性、亞急性和慢性。其中急性模型為MPTP每2 h腹腔注射1次，共注射4次[9]；亞急性模型為每天注射1次，共注射5 d[16]；慢性模型時(shí)間較長(zhǎng)，每周注射2次，共計(jì)4周。雖然不同實(shí)驗(yàn)室所采用的MPTP濃度略有不同[13]，但以上3種給藥方式均能造成黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元損傷。在本實(shí)驗(yàn)中，我們也首先通過(guò)免疫熒光染色計(jì)數(shù)黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目，觀察隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，多巴胺能神經(jīng)元的受損程度，以評(píng)估模型的建立是否成功。TH是多巴胺合成的限速酶，其功能缺失或表達(dá)不足直接影響多巴胺的合成與分泌。因此，檢測(cè)模型動(dòng)物TH陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目不僅可以反映多巴胺能神經(jīng)元的功能狀態(tài)，同時(shí)還可評(píng)估模型小鼠多巴胺水平[13]。本文研究結(jié)果表明，在注射MPTP后1周黑質(zhì)區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元已有受損，3、4周后損傷程度可達(dá)到80%～90%。因此，慢性模型的建立可導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元在黑質(zhì)紋狀體通路中的進(jìn)行性和穩(wěn)定性退變，更類(lèi)似于PD緩慢的和進(jìn)行性的神經(jīng)退行性變過(guò)程。

盡管MPTP可以造成明確的黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元損傷，然而動(dòng)物是否出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙目前還存在較多爭(zhēng)議[17]。有研究顯示，在轉(zhuǎn)棒和爬桿實(shí)驗(yàn)中，急性、亞急性和慢性模型與生理鹽水組相比沒(méi)有任何差異[18]。但也有文獻(xiàn)報(bào)道，在亞急性模型小鼠的轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中，小鼠的平衡力和協(xié)調(diào)能力均受損害[19]，在爬桿實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出明顯的運(yùn)動(dòng)遲緩[19]。在平衡木實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，急性模型小鼠與生理鹽水組相比沒(méi)有任何差異，慢性模型小鼠通過(guò)平衡木的時(shí)間增加，而亞急性模型小鼠所需時(shí)間減少[18]。為了對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠進(jìn)行更為直觀且準(zhǔn)確的檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)采用了CatWalk動(dòng)物行為分析技術(shù)，該技術(shù)不僅包括了傳統(tǒng)步態(tài)分析所需的運(yùn)動(dòng)速度和時(shí)間的檢測(cè)，也細(xì)化了動(dòng)態(tài)參數(shù)和靜態(tài)參數(shù)的指標(biāo)[20]。與傳統(tǒng)的曠場(chǎng)、爬桿、轉(zhuǎn)棒和平衡木等實(shí)驗(yàn)相比，CatWalk動(dòng)物行為分析技術(shù)的指標(biāo)更加全面、完善。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與生理鹽水組相比，模型組小鼠運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間、站立時(shí)間、腳步周期等均隨給藥時(shí)間的增長(zhǎng)顯著增加，平均速度、身體速度均隨給藥時(shí)間增長(zhǎng)顯著降低，這表明模型小鼠的步態(tài)發(fā)生改變。除上述指標(biāo)外，我們還觀察了小鼠的擺動(dòng)時(shí)間和擺動(dòng)速度，結(jié)果顯示在給藥第3周和第4周，小鼠前爪擺動(dòng)時(shí)間增加，4個(gè)爪的擺動(dòng)速度均降低，出現(xiàn)進(jìn)行性加重的現(xiàn)象。

此前研究聚焦于亞急性模型，對(duì)于慢性模型研究較少，且對(duì)于MPTP模型行為學(xué)上的研究存在許多爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)用CatWalk對(duì)小鼠不同給藥時(shí)間步態(tài)進(jìn)行分析，更加直觀、準(zhǔn)確地揭示了MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型步態(tài)的變化，為研究PD的運(yùn)動(dòng)障礙提供了依據(jù)。通過(guò)TH染色我們觀察到多巴胺能神經(jīng)元在MPTP注射1周后損傷在50%左右，到第4周損傷約90%，但其他病理特征尚不明確，仍需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)探究。

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（本文編輯于國(guó)藝）