摘要 利用生物信息學分析向日葵HaDGAT3編碼蛋白，預測HaDGAT3編碼蛋白是堿性和親水性蛋白，二級結構以ａ螺旋為主（47.11%），亞細胞定位預測顯示定位于細胞核。系統(tǒng)進化結果表明，HaDGAT3與小蓬草（Erigeron canadensis L.）DGAT3親緣關系最近，序列相似性為68%。熒光定量PCR結果表明，HaDGAT3在向日葵各組織部位表達量表現(xiàn)為管狀花>葉>種子，在莖、舌狀花、根中未見表達。HaDGAT3在種子發(fā)育中后期（開花后22～37 d）表達量明顯高于種子發(fā)育前期（開花后7～17 d），在開花后37 d最高。HaDGAT3基因表達量與種子油分和脂肪酸含量的相關性分析結果表明，HaDGAT3基因表達量與種子含油量呈顯著正相關，推測HaDGAT3是與向日葵種子油分積累相關的重要基因。

關鍵詞 向日葵；HaDGAT3；二酰甘油?；D移酶；生物信息學；表達分析

中圖分類號 S565.5 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）15-0107-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.15.023

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Bioinformatics and Expression Analysis of HaDGAT3 Gene in Sunflower

ZHOU Fei1，2

（1.Industrial Crops Institute，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin，Heilongjiang 150086;2.Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences Postdoctoral Programme，Harbin，Heilongjiang 150086）

Abstract In this study，HaDGAT3 encoded protein in sunflower was analyzed by bioinformatics.It was predicted that the protein encoded by HaDGAT3 was basic and hydrophilic protein.The secondary structure of the protein encoded by HaDGAT3 was dominated by α-helix （47.11%），and the subcellular localization was predicted in the nucleus.Phylogenetic analysis showed that HaDGAT3 was closely related to Erigeron canadensis L.DGAT3，with sequence similarity of 68%.The results of real-time PCR showed that the expression level of HaDGAT3 in various parts of sunflower tissues was as follows：tubular flowers> leaves> seeds，but no expression was found in stems，ligulate flowers and roots.The expression level of HaDGAT3 was significantly higher in the middle and late stage （22-37 d after flowering） than in the early stage （7-17 d after flowering） of seed development，and the highest level was at 37 d after flowering.Correlation analysis of the expression level of HaDGAT3 gene with seed oil and fatty acid content showed that the expression level of HaDGAT3 gene was significantly positively correlated with seed oil content.It was speculated that HaDGAT3 gene was an important gene related to oil content accumulation in sunflower seeds.The results of this study provided theoretical basis for revealing the function of HaDGAT3 gene.

Key words Sunflower;HaDGAT3;Diacylglycerol acyltransferase;Bioinformatics;Expression anaylsis

植物油脂的合成與代謝是一個復雜的生物反應過程，參與其中的酶種類繁雜，功能多樣。隨著科技的發(fā)展，油脂合成過程中相關酶的編碼基因逐漸被鑒定，如甘油-3-磷酸?；D移酶（glycerol phosphate acyltransferase，GPAT）［1］、ω-3脂肪酸去飽和酶（ω-3 fatty acid desaturase，F(xiàn)AD）［2］等。其中，二酰甘油?；D移酶（DGAT）催化二酰甘油加上脂肪酸酰基生成三酰甘油（TAG），是TAG合成途徑的關鍵限速酶［3］。在油菜、大豆和玉米中已證明DGAT的過量表達能夠提高油菜籽和玉米中的油脂含量［4］。迄今，共鑒定到4種亞型的DGAT，包括DGAT1、DGAT2、DGAT3及WS/DGAT。DGAT1、DGAT2在多數(shù)真核生物中普遍存在，是DGAT家族主要成員。相較于DGAT1和DGAT2，有關于DGAT3和WS/DAGT基因的研究報道較少。在花生發(fā)育種子中首先克隆AhDGAT3編碼可溶性DGAT蛋白［5］，目前DGAT3僅在花生、擬南芥或特定酵母中研究的較多［6-7］。

向日葵（Helianthus annuus L.）是世界上主要的油料作物之一，葵花油不飽和脂肪酸含量極高，因此具有較高的營養(yǎng)價值。目前，已從向日葵基因組中鑒定出18個DGATs基因［8］，但關于DGAT3基因的功能還尚不清楚。筆者利用高油酸向日葵種子發(fā)育過程中RNA-seq的分析結果［9］，在甘油脂類代謝通路中鑒定出HaDGAT3基因，利用生物信息學分析HaDGAT3基因編碼蛋白，并分析其在各組織部位的表達模式，為揭示HaDGAT3基因功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

國外引進的富含高油酸向日葵材料“L-1-OL-1”，種植于試驗基地（哈爾濱市康金鎮(zhèn)）。根據(jù)開花不同天數(shù)，從開花7～37 d，每5 d于同一時間段取葵花盤最外3圈籽粒，并取向日葵花期的葉、莖、根、管狀花和舌狀花，即刻放入液氮中，之后于超低溫冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1 基因的生物信息學分析。

將HaDGAT3蛋白序列利用軟件進行生物信息學分析（表1）。

1.2.2 熒光定量PCR分析。

利用天根植物總RNA提取試劑盒提取各組織部位RNA，使用東洋紡ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒生成cDNA。熒光定量PCR使用東洋紡THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix試劑盒，以向日葵β-actin（AF282624）為內(nèi)參基因，反應體系：模板1.2 μL，熒光染料10 μL，上、下游引物各0.6 μL，加水至20 μL?；虮磉_分析采用2-ΔΔCt法。內(nèi)參引物為F：GCAAAAAGCAGCTCGTCTGT，R：AGCAGCTTCCATTCCAATCA，HaDGAT3引物為F：GAAAACCGTCCCAACATCAAC，R：TTCTTACCACAATCCGCCTC。

1.2.3 基因表達量與油脂含量的相關性分析。

利用SPSS statistics 17.0軟件對種子發(fā)育不同時期基因表達量與5種基本脂肪酸含量、含油量進行pearson相關系數(shù)分析。

2 結果與分析

2.1 HaDGAT3生物信息學

2.1.1 HaDGAT3編碼蛋白理化性質(zhì)。

HaDGAT3基因開放閱讀框序列長度為990 bp，編碼329個氨基酸。HaDGAT3蛋白包含原子個數(shù)為4 982，化學式C1514H2514N430O495S29，相對分子質(zhì)量（Mr） 35.59 kD，蛋白質(zhì)等電點（pI）8.63，屬于堿性蛋白，HaDGAT3編碼蛋白由20種氨基酸組成（表2）。

2.1.2 HaDGAT3編碼蛋白二級結構預測。HaDGAT3編碼蛋白的二級結構包含α螺旋（47.12%），無規(guī)則卷曲（29.18%），延伸鏈（16.41%），β轉角（7.29%），因此該蛋白二級結構以α螺旋為主（圖1）。

2.1.3 HaDGAT3蛋白親/疏水性和亞細胞定位預測。

HaDGAT3蛋白序列分析表明，親水性大多為負數(shù)，因此推測HaDGAT3編碼蛋白大概率為親水性蛋白（圖2）。預測該蛋白亞細胞定位在細胞核。

2.1.4 進化樹構建與分析。

將HaDGAT3基因與芝麻（Sesamum indicum L.）、油棕（Elaeis guineensis Jacq.）等同結構域的DGAT3蛋白序列以及擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）和甘藍型油菜（Brassica napus L.）DGAT家族3個成員DGAT1、DGAT2、DGAT3構建進化樹（圖3），結果表明，HaDGAT3與這些物種的DGAT3聚在同一大分支上，其中與同屬菊科的小蓬草（Erigeron canadensis L.）DGAT3親緣關系最近，序列相似性為68%。

2.2 HaDGAT3基因表達分析

通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，HaDGAT3在向日葵種子、葉、管狀花中有不同程度的表達，在向日葵各組織部位表達量表現(xiàn)為管狀花>葉>種子，在莖、舌狀花、根中幾乎沒有表達。HaDGAT3在種子發(fā)育中后期（開花后22～37 d）表達量明顯高于種子發(fā)育前期（開花后7～17 d），在開花后37 d最高（圖4）。在向日葵種子發(fā)育不同時期，將HaDGAT3基因表達量與前期測定的種子油分和5種基本脂肪酸含量［10］進行相關性分析，結果發(fā)現(xiàn)HaDGAT3基因表達量與棕櫚酸、硬酯酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、種子含油量的P值分別為-0.376、-0.311、0.508、-0.470、-0.342、0.769，且與種子含油量呈顯著正相關（P<0.05）。

3 討論

植物中油脂合成過程主要包括脂肪酸的從頭合成、脂肪酸碳鏈脫飽和、脂肪酸碳鏈延長、TAG的生物合成，DGAT主要催化甘油二酯（DAG）形成TAG［11］，可以直接影響種子中脂肪酸的種類和含量。過表達DGAT1和DGAT2基因可促進種子油分積累。玉米中通過插入苯丙氨酸激活ZmDGAT1增加了玉米胚的含油量［12］。過表達麻瘋樹JcDGAT1和JcDGAT2基因可使油脂產(chǎn)量分別提高25.0%和29.6%［13］。

DGAT1和DGAT2的表達均能促進油菜種子含油量的積累，可調(diào)控DGAT1和DGAT2基因的表達來增加種子油含量［14］。DGAT3是一種植物胞質(zhì)可溶性的金屬酶，不包含跨膜結構與信號肽序列，與DGATl和DGAT2家族的序列同源性較低［15］。

植物DGAT3基因表達水平影響種子含油量和脂肪酸組成。

煙草中特異表達亞麻薺CaDGAT3-3基因可顯著促進種子中不飽和脂肪酸的合成［16］。轉AhDGAT3A和AhDGAT3B基因花生油酸含量提高了5.13%～21.26%，亞油酸含量降低了3.87%～31.18%，致使油酸/亞油酸比值提高5.01%～76.19%。這一結果可能歸因于AhDGAT3對油酸脂肪酰底物具有偏好性選擇，能夠在種子油脂中積累更多的油酸［17］。陸地棉GhDGAT3基因的表達量與棉籽油積累量呈正相關［18］，這與該研究向日葵HaDGAT3基因表達量與種子含油量呈顯著正相關的結果一致，推測向日葵DGAT3基因是與種子油分積累相關的重要基因。

DGAT3在不同植物中時空表達模式存在差異。大豆GmDGAT3亞家族的2個基因在大豆葉片和種子中表達量較高［19］。CsDGAT3基因亞麻薺在根、莖、葉、花和種子中均有表達，但CsDGAT3-1主要在根中表達，CsDGAT3-2主要在花和萌發(fā)的種子中表達，CsDGAT3-3則在發(fā)育中的種子中表達量最高［20］?；ㄉ鶤hDGAT3主要在種子發(fā)育后期表達［21］，NtDGAT3在不同組織中均有表達，且NtDGAT3的相對表達量在煙草葉部較高，其次是莖和花［3］。該研究發(fā)現(xiàn)，HaDGAT3在向日葵各組織部位表達量表現(xiàn)為管狀花>葉>種子，在種子發(fā)育中后期表達量明顯高于種子發(fā)育前期，這與前人研究結

果不同。張程等［8］研究發(fā)現(xiàn)，向日葵HaDGAT3主要在種子發(fā)育的早、中期表達，這可能由于試驗材料差異引起，該研究選用高油酸向日葵材料，說明HaDGAT3在油酸含量差異顯著的不同向日葵材料中表達模式有所不同，該研究結果可為進一步揭示HaDGAT3基因功能提供參考。

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