摘要 ［目的］對(duì)凡納濱對(duì)蝦大棚循環(huán)水養(yǎng)殖中后期底泥菌群多樣性及結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。［方法］在凡納濱對(duì)蝦大棚循環(huán)水養(yǎng)殖50、65、80、95、110 d時(shí)采集蝦塘底泥樣品，利用16S rRNA高通量測序技術(shù)分析其水體環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)特征及多樣性。［結(jié)果］養(yǎng)殖中后期，以變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主要優(yōu)勢菌，二者相對(duì)豐度分別在50、65 d時(shí)達(dá)到最高（分別為84.96%、38.08%）；屬水平上，養(yǎng)殖中期以遠(yuǎn)洋桿菌屬（Pelagibacter）、弓形桿菌屬（Arcobacter）、紅桿菌科未分類屬為優(yōu)勢屬，養(yǎng)殖后期（95、110 d）以α-變形菌綱的遠(yuǎn)洋桿菌屬（Pelagibacter）為共同的優(yōu)勢類群，且110 d時(shí)其相對(duì)豐度高達(dá)41.02%；80 d時(shí)，無明顯優(yōu)勢屬。Shannon-Wiener多樣性指數(shù)隨養(yǎng)殖時(shí)間的延長呈先升后降的趨勢，80 d時(shí)Shannon-Wiener多樣性指數(shù)達(dá)到最高（7.24）。通過主成分分析和聚類分析發(fā)現(xiàn)，80和95 d時(shí)采集的樣品菌群多樣性相似性最高；其余時(shí)間點(diǎn)樣品菌群多樣性無明顯差異。［結(jié)論］該研究結(jié)果表明循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)可以優(yōu)化凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體微生物菌群環(huán)境，改善水體菌群結(jié)構(gòu)及多樣性，對(duì)于凡納濱對(duì)蝦實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)作用。

關(guān)鍵詞 凡納濱對(duì)蝦；循環(huán)水養(yǎng)殖；多樣性；菌群結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào) S931 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）15-0097-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.15.021

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Diversity and Structure Analysis of Microbial Flora in Bottom Mud During the Middle and Late Stages of Culture in the Greenhouse Recycling Water Aquaculture of Litopenaeus vannamei

YOU Jiu-ju， XIA Feng-feng， WANG Lei-fei et al

（Zhoushan Fisheries Research Institute of Zhejiang Province，Zhoushan，Zhejiang 316021）

Abstract ［Objective］ To analyze the diversity and structure of sediment microbial flora in the middle and later stages of greenhouse recirculating-water aquaculture of Litopenaeus vannamei. ［Method］ The sediment samples were collected from the pond of L. vannamei on the 50， 65，80，95 and 110 days in the greenhouse recirculating-water aquaculture of L. vannamei. The characteristics and diversity of microbial communities in water environment were analyzed by using 16S rRNA high-throughput sequencing technology. ［Result］ In the middle and late stages of breeding， Proteobacteria and Bacteroidetes were the main dominant bacteria， and the relative abundance reached the highest values （84.96% and 38.08%） at 50 and 65 d respectively. At the level of the genus， Pelagibacter， Arcobacter， Rhodobacteraceae-unclassified were the dominant genera， Pelagibacter of Alphaproteobacteria was the common dominant group in the late stage of breeding （95 and 110 d）， and its relative abundance reached 41.02% at 110 d. There was no obvious dominant genus at 80 d. Shannon-Wiener diversity index showed a trend of first increase and then decrease， it reached the highest level at 80 d （7.24）. Principal component analysis and cluster analysis showed that the bacterial diversity of the samples collected at these two points had the highest similarity， and the bacterial diversity of the samples collected at other time points had no obvious difference. ［Conclusion］The research results showed that the circular water aquaculture system could optimize the microbial community environment in the aquaculture water of L. vannamei， improve the structure and diversity of the water microbial flora， which had an important guiding role for the actual aquaculture production of L. vannamei.

Key words Litopenaeus vannamei；Circular water aquaculture；Diversity;Microbial flora structure

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei），俗稱南美白對(duì)蝦，具有廣溫性、廣鹽性、生長速度快等優(yōu)點(diǎn)，可以進(jìn)行高密度集約化養(yǎng)殖生產(chǎn)，養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益顯著，是目前對(duì)蝦養(yǎng)殖品種中產(chǎn)量最高的三大優(yōu)良品種之一。凡納濱對(duì)蝦經(jīng)歷3～4個(gè)月的生長周期后可以上市。隨著對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展，產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化、工廠化和集約化程度大幅度提高，各種對(duì)蝦疾病頻繁暴發(fā)，病害已成為對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的主要瓶頸。凡納濱對(duì)蝦大棚循環(huán)水養(yǎng)殖模式是解決當(dāng)前對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)現(xiàn)有一系列問題的有效途徑之一，也是對(duì)蝦養(yǎng)殖模式發(fā)展的新方向。對(duì)蝦養(yǎng)殖中后期，重在改良底質(zhì)［1］，而底泥是水層營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源［2］。底泥微生物對(duì)于促進(jìn)底泥有機(jī)質(zhì)分解、減少有機(jī)物的堆積以及保持良好的水質(zhì)等方面發(fā)揮著重要作用［3］，在刺參［4］、克氏原螯蝦［5］、中華絨螯蟹［6］等品種養(yǎng)殖中已有學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)研究報(bào)道。了解養(yǎng)殖塘底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，掌握菌群多樣性變化規(guī)律，可為改善養(yǎng)殖水體、對(duì)蝦病害防治及規(guī)?；B(yǎng)殖中微生物資源的開發(fā)等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。已有學(xué)者對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體菌群等開展了相關(guān)研究［7-10］，但關(guān)于大棚循環(huán)水養(yǎng)殖模式下蝦塘底質(zhì)微生物菌群相關(guān)研究尚未見報(bào)道。筆者采用16S rRNA高通量測序方法對(duì)大棚內(nèi)循環(huán)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖塘底質(zhì)菌群情況進(jìn)行分析，以期為更高效的養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)控和健康養(yǎng)殖模式提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及預(yù)處理

凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖塘位于舟山市朱家尖科研基地，在原對(duì)蝦高位池大棚養(yǎng)殖塘的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，在面積1 000 m2大棚池塘內(nèi)新建流水水槽2個(gè)，長20 m、寬5 m、高2 m，建設(shè)面積200 m2，水槽采用鋼筋混凝土結(jié)構(gòu)，采用長方形傾斜底，于大棚外排水口處加裝蛋白分離器（加臭氧）進(jìn)行塘內(nèi)循環(huán)水質(zhì)的消毒處理，水處理主要流程為養(yǎng)殖區(qū)→凈化區(qū)→清水區(qū)→蛋白分離器（加臭氧）→養(yǎng)殖區(qū)，如圖1所示。

投放凡納濱對(duì)蝦苗種后50 d開始采樣。于養(yǎng)殖塘對(duì)蝦主養(yǎng)殖區(qū)中間位置，用采泥器采集蝦塘約5 cm厚度底泥置于無菌采樣袋中，立即置于4 ℃條件下帶至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌群DNA抽提。試驗(yàn)共設(shè)置50、65、80、95、110 d 5個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)，分別記作A1～A5。

1.2 總基因組DNA提取

按照Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit DNA分離試劑盒說明書，提取蝦塘底泥細(xì)菌群落總基因組DNA，測定DNA濃度和純度，最后利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)核酸抽提質(zhì)量。

1.3 PCR擴(kuò)增及高通量測序

以提取的總DNA為模板，用引物343F（5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′）和798R（5′-AGGGTATCTAATCCT-3′）擴(kuò)增微生物16S rRNA V3～V4區(qū)片段。擴(kuò)增體系包括10×PCR Buffer（Mg2+ Free）5.00 μL，MgCl2+（25 mmol/L）4.00 μL，dNTP（10 mmol/L）4.00 μL，F(xiàn)/R primer（10 mmol/L）各2.00 μL，DNA（50 ng/μL）2.00 μL，Ex Taq 0.25 μL，用ddH2O補(bǔ)足50.00 μL。擴(kuò)增程序如下：95 ℃變性5 min；然后，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min，于4 ℃下保存。利用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物后，進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化及回收。將純化后的PCR產(chǎn)物送交測序公司進(jìn)行Illumina Miseq高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行OTU聚類分析，OTU（可操作分類單元，operational taxonomic unit）是人為給某一分類單元設(shè)置的同一標(biāo)志。根據(jù)OTU聚類分析結(jié)果，評(píng)估底泥微生物菌落α多樣性；基于分類學(xué)信息，在門、綱、屬分類水平上對(duì)底泥群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌群多樣性分析

從5組底泥樣品中獲得的有效序列數(shù)分別為25 505、30 986、33 813、27 497、30 888條，去除嵌合體后得到的有效序列堿基長度為251～450 bp；OTU聚類分析發(fā)現(xiàn)，5組樣品獲得的總OTUs數(shù)目為988個(gè)，各樣品Tags和OTUs數(shù)目統(tǒng)計(jì)見表1。從不同養(yǎng)殖階段樣品的共有和獨(dú)有OTU數(shù)目（圖2）可以看出，大棚循環(huán)水系統(tǒng)能更好地優(yōu)化環(huán)境中的菌群結(jié)構(gòu)。

在該試驗(yàn)測序深度下，樣品的稀釋曲線趨于平緩，即隨著測序條數(shù)的增加，獲得的OTU數(shù)量變化不大（圖3），說明該試驗(yàn)測序深度夠大，足以覆蓋樣品的大多數(shù)微生物，測序數(shù)據(jù)量合理。通過香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener diversity index）對(duì)養(yǎng)殖塘底泥微生物群落多樣性進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖80 d時(shí)（A3）微生物Shannon-Wiener多樣性指數(shù)最高（7.24），110 d時(shí)（A5）底泥中微生物Shannon-Wiener多樣性指數(shù)降至4.87，接近50 d時(shí)（A1）的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（4.75）（圖4）。

2.2 菌群結(jié)構(gòu)特征分析

該研究采集的5個(gè)底泥樣品檢測到的細(xì)菌群落隸屬于26門59綱119目235科391屬。通過對(duì)細(xì)菌群落門水平上相對(duì)豐度的分析可知，養(yǎng)殖中后期養(yǎng)殖底泥中細(xì)菌群落以變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為優(yōu)勢類群，且這2個(gè)門在采樣期間一直是

主要類群，其中變形菌門在各采樣時(shí)間點(diǎn)（A1、A2、A3、A4、A5）相對(duì)豐度分別為84.96%（最高）、49.17%、57.43%、58.93%、66.94%，擬桿菌門相對(duì)豐度在65 d時(shí)達(dá)到最高（38.08%），厚壁菌門（Firmicutes）相對(duì)豐度隨采樣時(shí)間呈下降趨勢，110 d時(shí)相對(duì)豐度降至0.05%；放線菌門（Actinobacteria）、纖細(xì)菌門（Gracilibacteria）、螺旋體門（Spirochaetae）、酸桿菌門（Acidobacteria）在養(yǎng)殖中后期也占有一定比例，除了放線菌門相對(duì)豐度在80 d時(shí)達(dá)到12.29%外，其他養(yǎng)殖階段相對(duì)豐度均處于較低水平（圖5）。

主成分分析（Pcoa）（圖6ａ）顯示，80、95 d時(shí)采集的樣品可以很好地聚類在一起，菌群多樣性相似性較高，科水平的細(xì)菌群落heatmap（圖6b）和基于Unifrac的聚類分析（圖6c）結(jié)果也類似。80 d前和95 d后采集的樣品菌群多樣性差異較大。

整個(gè)采樣期間，屬水平上95、110 d時(shí)的優(yōu)勢類群均以α-變形菌綱的遠(yuǎn)洋桿菌屬（Pelagibacter）為共同的優(yōu)勢類群，且110 d時(shí)其相對(duì)豐度高達(dá)41.02%。弓形桿菌屬（Arcobacter，37.31%）和遠(yuǎn)洋桿菌屬（Pelagibacter，31.09%）為50 d時(shí)的優(yōu)勢屬，65 d時(shí)底泥中以紅桿菌科未分類屬（10.52%）為主；80 d時(shí)無明顯優(yōu)勢菌群（表2）。

3 討論

該文利用16S rRNA高通量測序方法對(duì)大棚循環(huán)水養(yǎng)殖模式的凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中后期底泥微生物多樣性和菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。5個(gè)采樣點(diǎn)得到的有效序列分析結(jié)果表明，采集的5組樣品共獲得有效序列數(shù)25 505～33 813條，操作分類單位380～636個(gè)，總OTUs數(shù)高達(dá)988個(gè)；檢測到的細(xì)菌群落屬于26門391屬，表明該大棚循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖后期蝦塘底泥中菌群多樣性較高；各樣品OTU稀釋曲線均趨于平緩，表明樣品測序深度足夠大，該測序結(jié)果可客觀反映養(yǎng)殖中后期底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。測序分析結(jié)果顯示，有效序列數(shù)占總序列數(shù)目的比例介于65.88%～84.07%，表明凡納濱對(duì)蝦大棚循環(huán)水養(yǎng)殖環(huán)境中存在大量的未知菌群。胡東等［9］利用高通量測序?qū)Ω＝ㄕ钠挚h海水養(yǎng)殖場高位池養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦中后期水體菌群結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，未鑒定序列數(shù)占總序列數(shù)的比例為0.86%。

該研究養(yǎng)殖中后期底泥樣品中的優(yōu)勢類群為變形菌門和擬桿菌門，這與金若晨［3］研究報(bào)道的水樣、 底泥和蝦腸道中主要的門類相一致。變形菌門相對(duì)豐度在50 d時(shí)最高（84.96%），在65 d時(shí)相對(duì)豐度最低（49.17%）；擬桿菌門在50 d時(shí)還未形成優(yōu)勢菌，相對(duì)豐度僅5.42%，但在65 d時(shí)達(dá)到最高（38.08%），此后養(yǎng)殖階段相對(duì)豐度維持在21.80%以上；除了放線菌門相對(duì)豐度在80 d時(shí)達(dá)12.29%外，其余養(yǎng)殖階段其他類群相對(duì)豐度均較低。一些學(xué)者對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖的研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門是海水養(yǎng)殖或高鹽湖泊環(huán)境中主要的細(xì)菌群落之一［11-12］。Zhang等［13］通過對(duì)凡納濱對(duì)蝦淡水養(yǎng)殖池微生物的研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門、變形菌門、放線菌門和藍(lán)細(xì)菌門是養(yǎng)殖水體中的主要微生物類群。胡曉娟等［14］通過對(duì)高位池養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦優(yōu)勢菌群的研究發(fā)現(xiàn)，高位池與海水池塘的養(yǎng)殖環(huán)境條件近似，變形菌和擬桿菌是凡納濱對(duì)蝦高位池養(yǎng)殖水體中的主要優(yōu)勢菌。該研究蝦塘底泥分析結(jié)果也反映了這一規(guī)律。

該研究Pcoa主成分分析和聚類分析結(jié)果均表明，養(yǎng)殖中后期（80和95 d）細(xì)菌群落多樣性相似度最高，而其他時(shí)間點(diǎn)相似度差異較大。在屬水平上，養(yǎng)殖中后期各階段細(xì)菌類群構(gòu)成變化較大。在養(yǎng)殖50 d時(shí)檢測到水生動(dòng)物潛在的條件性致病菌弓形桿菌屬的存在，且相對(duì)豐度為37.31%，稍高于α-變形菌綱的遠(yuǎn)洋桿菌屬（31.09%）；65 d后，養(yǎng)殖底泥中以遠(yuǎn)洋桿菌屬、黃桿菌屬、紅桿菌科未分類屬等為優(yōu)勢類群；95、110 d時(shí)優(yōu)勢菌群均以遠(yuǎn)洋桿菌屬為唯一優(yōu)勢菌群，且110 d時(shí)相對(duì)豐度高達(dá)41.02%，這對(duì)于改善底質(zhì)環(huán)境狀況、維持菌落穩(wěn)定等起著重要作用［15］，表明該循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)養(yǎng)殖中后期凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池處于健康的養(yǎng)殖狀態(tài)。在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中，尤其養(yǎng)殖中后期，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長，水體營養(yǎng)化程度不斷增高，潛在條件性致病菌引發(fā)病害的概率增加，循環(huán)水系統(tǒng)可以有效改善優(yōu)勢菌群的豐度，抑制有害菌的定殖，從而為凡納濱對(duì)蝦的健康生長創(chuàng)造良好的水體環(huán)境。

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