摘 要 為優(yōu)化枇杷葉中總黃酮提取工藝，探明總黃酮的抗氧化活性，以枇杷葉總黃酮提取量為考察指標(biāo)，以提取方式、甲醇與乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度為考察因素，采用單因素和BoX-Behnken響應(yīng)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，同時(shí)檢測(cè)枇杷葉總黃酮對(duì)DPPH·清除能力和ABTS+清除能力。乙醇超聲提取效果最好，4個(gè)因素對(duì)枇杷葉總黃酮提取量的影響排序?yàn)樘崛r(shí)間＞提取溫度＞料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)，其中4個(gè)因素均有極顯著影響（p＜0.01），料液比與提取時(shí)間的交互作用影響極顯著（p＜0.01）；乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間交互作用影響顯著（p＜0.05）。枇杷葉總黃酮最佳提取工藝參數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)48%，料液比1∶26，提取時(shí)間66 min，提取溫度63 ℃，實(shí)際測(cè)得枇杷葉總黃酮提取量為69.389 mg·g-1，與理論值差異小。在該工藝下，枇杷葉總黃酮對(duì)DPPH·與ABTS+最大清除率分別為34.396%、27.680%，雖然比Trolox清除率低，但仍有一定的清除能力。

關(guān)鍵詞 枇杷葉；總黃酮；響應(yīng)曲面法；抗氧化活性

中圖分類(lèi)號(hào)：TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.11.001

枇杷葉為薔薇科植物枇杷[Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.]的干燥葉，具有清肺止咳、降逆止嘔的功效，用于治療肺熱咳嗽、氣逆喘急、胃熱嘔逆、煩熱口渴[1]?，F(xiàn)代研究表明，枇杷葉中含有黃酮成分[2]，是其主要藥效成分。藥理研究表明，枇杷葉具有抗氧化、抗炎、降血脂、止咳、增強(qiáng)免疫[3-5]等作用，同時(shí)枇杷葉也是藥食同源植物，其保健功能越來(lái)越受到健康產(chǎn)業(yè)的關(guān)注[6-7]。目前，對(duì)于枇杷葉的研究多集中在三萜酸[8]，文獻(xiàn)報(bào)道顯示，枇杷葉中總黃酮類(lèi)化合物對(duì)減少自由基的產(chǎn)生和清除自由基都有良好的作用，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血脂的功效[9-12]。因此，優(yōu)化枇杷葉總黃酮提取工藝，提高總黃酮提取量對(duì)枇杷葉有效成分開(kāi)發(fā)利用具有重要意義[13]。目前提取枇杷葉總黃酮的方法主要為熱浸法，但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、成本高且黃酮在提取過(guò)程中易分解[14]。超聲波提取中藥材中的黃酮，具有破碎時(shí)間短、提取率高、提取時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)[15-17]。

本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取枇杷葉總黃酮工藝，并檢測(cè)枇杷葉總黃酮對(duì)DPPH清除能力和ABTS+清除能力，探討其抗氧化能力，為枇杷葉開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

枇杷葉采于重慶市萬(wàn)州區(qū)（經(jīng)度108.451 5°，緯度30.754 3°，海拔395 m），樣品鑒定為薔薇科植物枇杷的葉，洗凈，45 ℃恒溫干燥至恒重，粉碎過(guò)60目篩，備用。

1.2" 試驗(yàn)方法

1.2.1" 總黃酮含量測(cè)定

總黃酮含量測(cè)定采用硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色法[13]。吸取一定量的樣品溶液于試管中，加入0.3 mL5% NaNO2溶液，搖勻；6 min后加入0.3 mL10% A1（NO3）3溶液，靜置6 min，加入4.0 mL 4% NaOH溶液，用60%乙醇定容至10 mL，靜置10 min，于510 nm處測(cè)定吸光值。以吸光值A(chǔ)（x）和蘆丁含量C（y），繪制總黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線y=13.916x-0.002 7（R2= 0.999 2）。

P=n×ρ×v/m （1）

式中，P為總黃酮含量，mg·g-1；ρ為蘆丁質(zhì)量濃度，mg·mL-1；v為提取液的體積，mL；n為稀釋倍數(shù)。

1.2.2" 提取方式試驗(yàn)

超聲供試品溶液制備，稱(chēng)取枇杷葉粉末10 g，置于150 mL錐形瓶中，與60%乙醇50 mL混勻（盡量潤(rùn)濕粉末），60 ℃下超聲提取60 min（超聲功率300 W，工作頻率40 kHz），搖勻，紗布過(guò)濾后用布氏漏斗濾紙抽濾，濃縮液以60%定容至5 mL量瓶中，即得。

回流供試品溶液制備，稱(chēng)取枇杷葉粉末10 g，置于150 mL燒瓶中，與60%乙醇50 mL混勻（盡量潤(rùn)濕粉末），60 ℃水浴鍋中回流提取1 h，搖勻，紗布過(guò)濾后用布氏漏斗濾紙抽濾，濃縮液以60%定容至5 mL量瓶中，即得。

索式回流供試品溶液制備，稱(chēng)取枇杷葉粉末10 g，用濾紙包裹置于索氏提取器中，精確加60%乙醇50 mL，50 ℃下提取4 h，紗布過(guò)濾后用布氏漏斗濾紙抽濾，濃縮液以60%定容至25 mL量瓶中，即得。

1.2.3" 單因素試驗(yàn)

在乙醇體積60%、料液比1∶15（g·mL^-1）、超聲溫度60 ℃、超聲時(shí)間60 min的基本工藝條件下，考察這4個(gè)因素對(duì)枇杷葉總黃酮提取量的影響。

1.2.4" 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采取4因素3水平設(shè)計(jì)Box-Behnken Design試驗(yàn)（見(jiàn)表1）。

1.2.5" 抗氧化活性試驗(yàn)

1.2.5.1" " DPPH自由基的清除能力

參考Yu等[18]的方法并加以改進(jìn)，取DPPH 2.0 mg用無(wú)水乙醇定容至50 mL，低溫避光反應(yīng)30 min，得到0.04 mg·mL^-1的DPPH溶液。用40%乙醇稀釋配制濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL^-1樣品。精確吸取樣品溶液0.1 mL與2.0 mL的DPPH溶液，避光反應(yīng)30 min。在517 nm下測(cè)定吸光值，同時(shí)以相同質(zhì)量濃度Trolox做對(duì)照試驗(yàn)。每個(gè)樣品做3個(gè)平行，取均值。

清除率=1-A₁-A₂/A₀ （2）

式中，A0為溶劑與DPPH·混合液吸光值；A1為樣品/標(biāo)準(zhǔn)品與DPPH·混合液吸光值；A2為樣品/標(biāo)準(zhǔn)品與乙醇混合液吸光值。

1.2.5.2" " ABTS+自由基的清除能力

參考Liu等[19]的方法并加以改進(jìn)，ABTS儲(chǔ)備液的制備：取7.0 mmol·L^-1的ABTS和2.4 mmol·mL^-1過(guò)硫酸鉀等體積避光混合12 h后，即得ABTS溶液，使用前蒸餾水稀釋?zhuān)沟?34 nm處吸光值為0.70±0.02。用40%乙醇稀釋配制濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL^-1樣品。吸取樣品溶液0.05 mL與2.0 mL ABTS溶液，搖勻反應(yīng)10 min，在734 nm下測(cè)定吸光值，同時(shí)以相同質(zhì)量濃度Trolox做對(duì)照試驗(yàn)。

清除率=1-A1/A0 （3）

式中，A₀為乙醇與ABTS+混合液吸光值；A₁為樣品/標(biāo)準(zhǔn)品與ABTS+混合液吸光值。

1.3" 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 12進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，Excel 16與Origin 2018對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析及繪圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1" 提取方式對(duì)總黃酮提取量的影響

由圖1可知，超聲提取、索氏提取、回流提取等3種方式提取的總黃酮含量具有顯著差異（p＜0.05，下同），其中超聲提取效果最好（26.284 5 mg·g^-1），可能是因?yàn)槌曁崛?qiáng)震動(dòng)，增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率與速度，增加溶劑穿透力，從而其總黃酮提取量高于索式提取和回流提取，后期試驗(yàn)均采用超聲提取。

2.1.2" 溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取量的影響

由圖2可知，甲醇提取的總黃酮含量低于乙醇提取的總黃酮含量。乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)低，枇杷葉總黃酮的提取量低；乙醇體積分?jǐn)?shù)在0～40%時(shí)，總黃酮提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高而升高；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到40%時(shí)，枇杷葉總黃酮提取量接近最高值（51.023 4 mg·g^-1）；乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)40%后，枇杷葉總黃酮提取量呈顯著下降趨勢(shì)。說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)低時(shí)，樣品溶出能力較弱，提取效果較差，總黃酮提取量較低；乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，由于總黃酮與乙醇極性相差較大，總黃酮不能溶解充分，或是乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大，溶出更多雜質(zhì)，導(dǎo)致總黃酮提取量低。因此，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、40%、50%作為后續(xù)試驗(yàn)水平。

2.1.3" 料液比對(duì)總黃酮提取量的影響

由圖3可知，在料液比1∶5至1∶25之間，隨著料液比的升高，總黃酮提取量呈升高趨勢(shì)，整體呈山峰狀，其中料液比為1∶25時(shí)，枇杷葉總黃酮提取量接近最高值（50.394 3 mg·g^-1）?？赡苁怯捎谌軇┻^(guò)少，枇杷葉總黃酮無(wú)法完全溶解，從而影響提取量；當(dāng)溶劑過(guò)多時(shí)，多余的溶劑阻礙了枇杷葉與溶劑的溶解，導(dǎo)致提取量降低。因此，選取料液比1∶20、1∶25、1∶30作為后續(xù)試驗(yàn)水平。

2.1.4" 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

由圖4可知，提取時(shí)間在45～60 min時(shí)，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，總黃酮提取量增大；當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，枇杷葉總黃酮提取量接近最高值（55.484 6 mg·g^-1）；時(shí)間超過(guò)60 min后，枇杷葉總黃酮提取量呈顯著下降趨勢(shì)。可能是由于總黃酮溶出后容易被空氣氧化，或者超聲對(duì)溶出的總黃酮產(chǎn)生了破壞，導(dǎo)致總黃酮提取量降低。因此，提取時(shí)間45、60、75 min作為后續(xù)響應(yīng)試驗(yàn)水平。

2.1.5" 提取溫度對(duì)總黃酮提取量的影響

由圖5可知，溫度在40～60 ℃時(shí)，總黃酮提取量隨溫度增高而增加；當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，枇杷葉總黃酮提取量接近最高值（61.922 1 mg·g^-1）；溫度超過(guò)60 ℃后，枇杷葉總黃酮提取量呈顯著下降趨勢(shì)。可能是由于溫度升高，物質(zhì)分子活躍度不斷增加，與枇杷葉得到充分接觸，促進(jìn)總黃酮的溶解；溫度過(guò)高時(shí)，乙醇揮發(fā)，分子結(jié)構(gòu)被破壞或揮發(fā)，導(dǎo)致總黃酮提取量降低。因此，選取溫度50、60、70 ℃作為后續(xù)試驗(yàn)水平。

2.2" 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1" 響應(yīng)面回歸模型建立

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用4因素3水平的響應(yīng)面中心試驗(yàn)（見(jiàn)表2），運(yùn)用Design-Expert 12分析，得到二次回歸方程模型：

Y=66.11+6.34×A+5.44×B+4.99×C+5.02×D+2.37×AB+3.93×AB+3.93×AC+2.49×AD+2.88×BC-0.46×BD-0.35×CD-12.24×A2-13.93×B2-9.78×C2-12.36×D2

由表3可知，模型F=51.365，p＜0.001，模型極顯著，故對(duì)枇杷葉總黃銅提取量的影響較為顯著；失擬項(xiàng)F=4.67，p=0.075 3，失擬項(xiàng)不顯著，表明模型擬合程度良好。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.980 9，表明回歸方程相關(guān)性良好，校正決定系數(shù)R2Adj為0.961 8，說(shuō)明模型可以解釋96.18%的總黃酮提取量變化，表明模型方程能夠較好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值。影響枇杷葉總黃酮提取的因素中，A、B、C、D、AC、A2、B2、C2和D2影響極顯著，BC交互作用影響顯著，都達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義水平。由F值可以判斷出，四因素影響排序?yàn)椋篊＞D＞B＞A。

2.2.2" 交互作用分析

交互作用分析如圖6，響應(yīng)曲面坡度及響應(yīng)面投影的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，響應(yīng)曲面越陡及響應(yīng)面投影為橢圓形表示兩因素交互作用顯著，響應(yīng)曲面越平緩及響應(yīng)面投影為圓形則與之相反。

從圖6中看出，料液比與提取時(shí)間的交互作用響應(yīng)曲面圖陡峭，響應(yīng)曲面投影為橢圓形，交互作用極顯著；乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比響應(yīng)曲面圖較陡，投影為橢圓形，兩因素交互作用顯著；乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比、提取溫度的響應(yīng)曲面投影中橢圓程度明顯，但交互作用較弱，未達(dá)到顯著水平，這與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3" 最佳提取工藝的驗(yàn)證

本試驗(yàn)以總黃酮提取量為指標(biāo)，得出枇杷葉總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇濃度為47.323%，料液比為1∶26.3，提取時(shí)間為65.445 min，提取溫度為62.297 ℃，此條件下的提取量預(yù)測(cè)值為69.465 mg·g^-1。結(jié)合實(shí)際情況，提取參數(shù)乙醇體積分?jǐn)?shù)47%，料液比1∶26，提取時(shí)間66 min，提取溫度62 ℃，重復(fù)3次，實(shí)際測(cè)得枇杷葉總黃酮提取量為69.459 mg·g^-1，這與理論預(yù)測(cè)值結(jié)果差異小。因此，該方法準(zhǔn)確可靠。

2.3" 枇杷葉總黃酮抗氧化活性分析

2.3.1" DPPH清除能力

由圖7可知，在0.1～0.8 mg·mL^-1范圍內(nèi)，枇杷葉總黃酮提取液有清除DPPH能力，隨著提取液濃度增加，清除能力提升，且上升趨勢(shì)緩慢，DPPH清除率為29.272%～34.396%，Trolox對(duì)DPPH的清除率隨著濃度增大而提升。Trolox的DPPH清除能力高于枇杷葉總黃酮的清除能力。通過(guò)分析可知，枇杷葉總黃酮對(duì)DPPH有清除能力，說(shuō)明枇杷葉總黃酮成分有較好的抗氧化活性。

2.3.2" ABTS+清除能力

由圖8可知，在0.1～0.8 mg·mL^-1濃度范圍內(nèi)，枇杷葉總黃酮提取液有一定的ABTS+清除能力，清除能力隨著提取液濃度增加而提升，ABTS+清除率為11.545%～27.680%，Trolox對(duì)ABTS+的清除率隨著Trolox的濃度增大而提升，在相同濃度下，Trolox的ABTS+清除能力高于枇杷葉總黃酮的清除能力。通過(guò)分析可知，枇杷葉總黃酮對(duì)ABTS+有一定的清除能力，說(shuō)明枇杷葉總黃酮成分有較好的抗氧化活性。

3" 小結(jié)與討論

黃酮成分多采用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，本試驗(yàn)對(duì)比了3種提取方式，發(fā)現(xiàn)超聲提取效果好、操作簡(jiǎn)單，最終選用超聲提取。徐久婷等研究表明乙醇對(duì)枇杷葉主要功能成分提取效果良好，與本試驗(yàn)結(jié)果一致[16]。本試驗(yàn)結(jié)果得出枇杷葉總黃酮提取工藝條件為：參數(shù)設(shè)置為溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)47%，料液比1∶26，提取時(shí)間66 min，提取溫度62 ℃，在此條件下，枇杷葉總黃酮提取量為69.459 mg·g^-1。吳媛琳等對(duì)枇杷葉、枝條進(jìn)行研究，所得枇杷葉提取率為枇杷枝條總黃酮提取率（3.21%）的2倍[20]；高偉城等研究表明，不同產(chǎn)地的枇杷葉總黃酮提取量在6.21～14.23 mg·g^-1[21]。本研究采用超聲提取法對(duì)枇杷葉總黃酮的提取量高于熱回流法[2]，可能因?yàn)槌曒o助提取對(duì)樣品的破碎能力強(qiáng)，能夠讓物質(zhì)間充分接觸，使得黃酮類(lèi)成分能更好地溶出。孫運(yùn)奇等在水浴加熱條件下提取牡丹籽粕的總黃酮成分，所得總黃酮提取率為1.45%，結(jié)果乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%左右時(shí)，對(duì)牡丹籽粕的總黃酮提取效果最優(yōu)[22]，本研究結(jié)果與其類(lèi)似，進(jìn)而說(shuō)明并非乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，總黃酮有效成分溶出效果越好，這可能與乙醇和總黃酮的極性有關(guān)。

有學(xué)者研究枇杷葉的多糖、多酚、總?cè)扑岬然钚猿煞?，并具有抗氧化活性[11，23-25]。張敏杰等對(duì)響應(yīng)曲面試驗(yàn)后的石韋總黃酮提取物的抗氧化活性進(jìn)行了比較，在石韋總黃酮最大質(zhì)量濃度下測(cè)得DPPH清除率為30%[26]，本試驗(yàn)枇杷葉在最大質(zhì)量濃度下測(cè)得的DPPH清除率為34.396%，表明不同物種不同質(zhì)量濃度下的抗氧化活性具有相似性?；粲詈降葘?duì)測(cè)得不同品種枇杷葉的ABTS+清除率最高達(dá)23.90%[11]，本試驗(yàn)枇杷葉總黃酮的ABTS+清除率為27.68%，說(shuō)明重慶萬(wàn)州的枇杷葉抗氧化活性可能更好，并且枇杷葉不同活性成分的抗氧化活性能力有相似性。余菲等[27]、陳海娟等[28]研究不同濃度下總黃酮對(duì)DPPH的清除能力優(yōu)于ABTS+清除能力，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)DPPH和ABTS+清除自由基體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，同樣發(fā)現(xiàn)枇杷葉總黃酮清除DPPH效果優(yōu)于清除ABTS+，這可能與兩者測(cè)定抗氧化能力的原理有關(guān)，可能是枇杷葉中總黃酮的含量較低，后期也可進(jìn)一步做純化試驗(yàn)。本研究表明枇杷葉總黃酮提取物具有一定的抗氧化活性，但未進(jìn)行不同月份、不同地區(qū)及不同品種的總黃酮含量及抗氧化活性比較，后續(xù)有必要進(jìn)一步研究。

基于響應(yīng)面法優(yōu)化提取枇杷葉總黃酮方法可靠，測(cè)得枇杷葉總黃酮提取量為69.459 mg·g^-1，通過(guò)研究DPPH清除能力、ABTS+清除能力，表明枇杷葉總黃酮具有抗氧化活性，可開(kāi)發(fā)枇杷葉在食品、中藥及化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯：易" 婧）