【摘 要】 目的：應(yīng)用高效液相色譜法測定止咳枇杷顆粒中桑皮苷A和綠原酸含量。方法：色譜柱為C18色譜柱，以乙腈-0.3%磷 酸（9∶91）為流動相，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量 10 μL，檢測波長326 nm。結(jié)果：桑皮苷A在16.12～806.0 μg/mL（r=1.0000）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為101.65%，RSD為2.10%（n=6）；綠原酸在4.122～206.1 μg/mL（r=1.0000）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為99.81%，RSD為0.56%（n=6）。結(jié)論：該方法測定結(jié)果準確、靈敏、重復性好，可用于止咳枇杷顆粒中桑皮苷A和綠原酸的含量測定。

【關(guān)鍵詞】 止咳枇杷顆粒；桑皮苷A；綠原酸；高效液相色譜法

【中圖分類號】R284.1

【文獻標志碼】A 【文章編號】1007-8517（2024）12-0051-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.12.zgmzmjyyzz202412011

Determination of Mulberroside A and Chlorogenic Acid in Zhike Pipa Granules

JIANG Liping LIANG Jinwei LI Chuyuan LI Linyuan KUANG Yanhui*

Guangzhou Baiyunshan Hutchison Whampoa Chinese Medicine Co.， Ltd.， Guangzhou 510515， China

Abstract：Objective To determine the content of Mulberroside A and Chlorogenic acid in Zhike Pipa granules by High-performance liquid chromatography.Method The chromatographic column is C18， with acetonitrile 0.3% phosphoric acid （9∶91） as the mobile phase， flow rate of 1 mL/min， column temperature of 30 ℃， and injection volume of 10 μL. The detection wavelength is 326nm. Result The linear relationship of mulberry skin Mulberroside A was good within the range of 16.12-806.0 μg/mL （r=1.0000）， with an average recovery rate of 101.65% and an RSD of 2.10% （n=6）; The linear relationship of Chlorogenic acid is good within the range of 4.122-206.1 μg/mL （r=1.0000）， the average sample adding recovery is 99.81%， and the RSD is 0.56% （n=6）.Conclusion The method is accurate， sensitive， and has good repeatability in determining results， and can be used for the determination of Mulberroside A and Chlorogenic acid in Zhike Pipa granules.

Key words：Zhike Pipa granules; Mulberroside A; Chlorogenic Acid; High-Performance Liquid Chromatography

止咳枇杷顆粒是中藥復方制劑，由枇杷葉、白前、桔梗、桑白皮、百部、薄荷腦六味藥物組成，具有清肺、止咳、化痰的功效，用于咳嗽多痰的治療［1］?，F(xiàn)行質(zhì)量標準收載于部頒標準中藥成方劑第二冊【W(wǎng)S3-B-0212-90】［2］，該標準只作了化學定性鑒別，無定量檢測方法，文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)僅采用氣相色譜法對薄荷腦一種揮發(fā)性成分進行質(zhì)量控制［3］，而止咳枇杷顆粒的工藝為水提取后濃縮制粒，該藥中富含有豐富的水溶性有效成分，為了能更好地提升該藥質(zhì)量標準，明確該藥中相關(guān)有效成分的含量，擬采用HPLC法對止咳枇杷顆粒中的水溶性成分進行測定。

方中枇杷葉中含有黃酮類、有機酸類、揮發(fā)油類等化學成分，其中綠原酸作為枇杷葉中主要的水溶性有機酸，是止咳枇杷顆粒中主要藥理活性物質(zhì)之一，具有抗炎、抗菌、抗病毒等廣泛的生物活性。文獻［4-5］研究表明桔梗、百部也含有綠原酸。桑白皮含有特征性成分桑皮苷A，具有鎮(zhèn)咳、消炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、降血脂、調(diào)控代謝酶和轉(zhuǎn)運體等作用［6-10］。綠原酸和桑皮苷A均是止咳枇杷顆粒中重要的抗炎活性成分，且都是水溶性成分。本研究以桑皮苷A和綠原酸兩種水溶性成分為指標，采用高效液相色譜法進行含量測定方法的建立，為完善止咳枇杷顆粒質(zhì)量標準提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與試藥 Thermo Ultimate 3000（3）高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司）；MSA6.6S微量天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；BSA224S電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；桑皮苷A對照品（上海詩丹德標準技術(shù)服務(wù)有限公司，批號：14821，純度大于98.0%）；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-202119，含量為96.3%）；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，其他為分析純。

1.2 樣品 止咳枇杷顆粒共8批，分別為2302001、2302002、2302003、2302004、2103001、2103002、2106001、2106002，均為廣州白云山和記黃埔中藥有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Thermo Hypersil GOLDTM （250 mm × 4. 6 mm，5 μm），以乙腈-0.3%磷酸（9∶91）為流動相，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量 10 μL，檢測波長326 nm。

2.2 對照品溶液的制備 取桑皮苷A、綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含桑皮苷A 150 μg、綠原酸 15 μg的混合溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取止咳枇杷顆粒適量，研細，取約4.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（250 W，40 KHZ）10 min，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關(guān)系 取桑皮苷A、綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含桑皮苷A 806.0 μg、綠原酸206.1 μg的混合溶液，搖勻，即得。吸取混合對照品溶液，用50%甲醇稀釋制得不同濃度的混合標準品溶液，進樣量10 μL，以各標準峰面積為y軸，濃度為x軸繪制標準曲線，結(jié)果表1，表明各成分在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.4.2 精密度試驗 取“2.2”項下的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次。計算各成分峰面積的RSD，考察儀器精密度。桑皮苷A、綠原酸峰面積的RSD均小于1%。表明該儀器精密度良好，結(jié)果見表2。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h進樣，按2.1色譜條件測定，記錄色譜峰峰面積。桑皮苷A和綠原酸峰面積RSD均小于1%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見表3。

2.4.4 重復性試驗 精密稱取同一批樣品，按2.3項方法平行制備6份供試品溶液，按2.1色譜條件進行檢測。桑皮苷A和綠原酸平均含量RSD分別均小于1%，表明該方法的重復性良好，結(jié)果見表4。

2.4.5 耐用性試驗 分別用兩種品牌（Thermo Hypersil GOLDTM 250 mm × 4.6 mm，5 μm和Agilent ZORAX SB-C18 250 mm × 4.6 mm，5 μm）的色譜柱測定同一供試品溶液，考察不同色譜柱對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果桑皮苷A和綠原酸的含量相對偏差均小于3%；另用兩種品牌（Thermo Ultimate 3000和 Agilent 1200）的高效液相色譜儀測定同一供試品溶液，考察不同儀器對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果桑皮苷A和綠原酸的含量相對偏差均小于3%，表明該方法的耐用性良好。結(jié)果見表5、表6。

2.4.6 專屬性試驗 按處方比例稱取除桑白皮的其余藥味，加水煎煮2 h，過濾，取續(xù)濾液，作為桑白皮陰性溶液。另按處方比例稱取除枇杷葉、桔梗、桑白皮、百部的其余藥味，加水煎煮2 h，過濾，取續(xù)濾液，作為枇杷葉、桔梗、桑白皮、百部陰性溶液。精密吸取供試品溶液、桑皮苷A和綠原酸對照品混合溶液、兩種陰性溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.1色譜條件進行測定。供試品溶液色譜中，在與桑皮苷A和綠原酸對照品相同保留時間處有吸收峰，而桑白皮陰性溶液在相同保留時間處未出現(xiàn)桑皮苷A的吸收峰，枇杷葉、桔梗、桑白皮、百部陰性溶液在相同保留時間處未出現(xiàn)綠原酸的吸收峰，表明該方法的專屬性良好，結(jié)果如圖1所示。

2.4.7 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品（批號：2302001，桑皮苷含量為1.10 mg/g，綠原酸含量為0.20 mg/g），研細，取2.0 g，精密稱定，分別精密加入桑皮苷A、綠原酸對照品適量，按2.3供試品溶液制備方法制備樣品，按2.1色譜條件測定，計算回收率。結(jié)果見表7，表明該方法具有良好回收率。

2.5 樣品測定 取8批止咳枇杷顆粒，按2.3項方法制備供試品溶液，每批樣品平行制備 2份，分別將對照品溶液和供試品溶液按2.1色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并計算含量，結(jié)果見表8。本研究考察了8批止咳枇杷顆粒，結(jié)果顯示均含有桑皮苷A和綠原酸，桑皮苷A平均值為1.01 mg/g，綠原酸平均值為0.14 mg/g，但不同批次中成分的含量有一定的差異，最高含量與最低含量之間相差約5倍，如果按照平均值下調(diào)70%制定質(zhì)量標準限度，桑皮苷A和綠原酸分別為0.7 mg/g和0.1 mg/g，將有2批止咳枇杷顆粒的桑皮苷A不符合要求，2批的綠原酸不符合要求，總計4批不符合標準要求，故在生產(chǎn)過程中應(yīng)關(guān)注指標成分的變化，確保藥品的均一穩(wěn)定。

3 討論

本研究對不同的流動相（乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.3%磷酸）和洗脫程序進行了考察分析，當采用乙腈-0.3%磷酸（9∶91）時，桑皮苷A和綠原酸均能夠達到良好分離，滿足分析要求。

為確定檢測波長，本實驗采用二極管陣列檢測器，在波長 200～400 nm范圍內(nèi)對桑皮苷A、綠原酸對照品溶液和供試品溶液進行全掃描。結(jié)果桑皮苷A在波長325 nm處有最大吸收，綠原酸在波長326 nm處有最大吸收，供試品溶液在與桑皮苷A和綠原酸對照品相同保留時間處有吸收峰且無干擾，最終選擇326 nm作為本實驗的檢測波長。

本研究比較了不同的提取溶劑（水、30%甲醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇）、提取方法（超聲、回流）、提取時間（10 min、20 min、30 min）對樣品中桑皮苷A和綠原酸提取效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取溶劑為水時，色譜峰分離度良好，且基線平穩(wěn)。在提取方法方面，超聲比回流的提取效率更高，提取時間對提取桑皮苷A和綠原酸的影響較小，綜合提取效能，提取方式選擇超聲，提取時間為10 min。建立的止咳枇杷顆粒中桑皮苷A和綠原酸含量測定方法簡單可行，穩(wěn)定可控，可用于止咳枇杷顆粒的含量測定。

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（收稿日期：2023-10-07 編輯：劉 斌）