孫博 鄭海云 王超超 劉玉洋 王夢曉 田孟堯 王慧君 趙海譽

摘要 ［目的］對2種藥食同源中藥飲品（香蜂悅顏飲、參杞固元飲）成分進行初步分析，并利用斑馬魚功效模型評價2種飲品的抗氧化和抗疲勞作用。［方法］通過UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，用反相C18色譜柱，采用雙壓線性離子阱質(zhì)譜正/負離子雙重掃描方式，對樣品進行成分分析；對水溶給予甲萘醌方法建立的斑馬魚氧化損傷模型加入梯度濃度（25、50、100 μg/mL）的香蜂悅顏飲稀釋液干預，同時設置正常組、陽性藥組，處理24 h后，Cell ROX避光染色，在熒光顯微鏡下觀察拍照，計算斑馬魚的卵黃囊熒光強度；選擇5日齡野生型斑馬魚，加入梯度濃度（25、50、100 μg/mL）參杞固元飲稀釋液干預，同時設置正常對照組和陽性藥對照組，處理18 h后，給藥組水溶給予無水亞硫酸鈉建立斑馬魚疲勞模型，并利用行為分析儀分析斑馬魚總運動距離。［結(jié)果］根據(jù)質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)，香蜂悅顏飲、參杞固元飲分別檢測出63和60個化合物。與模型組相比，香蜂悅顏飲干預下的斑馬魚卵黃囊熒光強度顯著變?nèi)酰≒＜0.01）；與模型對照組相比，參杞固元飲干預下的斑馬魚總運動距離顯著更遠（P＜0.05）。［結(jié)論］2種藥食同源中藥飲品分別具有明確的抗氧化和抗疲勞作用。

關(guān)鍵詞 斑馬魚；藥食同源；液質(zhì)聯(lián)用；抗氧化；抗疲勞

中圖分類號 TS 275.4? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）12-0158-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.12.034

Study on Anti-oxidation and Anti-fatigue Effects of Medicinal and Edible Homologous Beverage for TCM Based on Zebrafish Model

SUN Bo1， ZHENG Hai-yun2， WANG Chao-chao1 et al

（1. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medicinal Sciences， Beijing 100700;2. Science and Technology Collaborating Center for Chinese Medicine， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700）

Abstract ［Objective］To analyze the chemical constituents in 2 medicinal and edible homologous beverage（Xiangfeng Yueyan Drink and Shenqi Guyuan decoction）， and evaluate the anti-oxidant and anti-fatigue effects. ［Method］UHPLC-TQ-Orbitrap-MS mass spectrometer and reverse phase C18 column were used to analyze the composition of the samples. The oxidative stress model established by aqueous menadione administration method was added with different gradient concentrations （25，50，100 μg/mL） of Xiangfeng Yueyan Drink dilution. Meanwhile， a normal group and a positive drug control group were set up. After treatment for 24 h， the Cell ROX was stained without light， and the fluorescence intensity of yolk sac was calculated by fluorescence microscope. Select 5-day-old wild type zebrafish and add different gradient concentrations （25， 50， 100 μg/mL） of Shenqi Guyuan decoction diluent. A normal control group and a positive drug group were set up at the same time. After treatment for 18 h， the fatigue model of zebrafish was established by aqueous solution of anhydrous sodium sulfite in the administration group， and the total movement distance of zebrafish was analyzed by behavior analyzer. ［Result］According to the mass spectrometry data， 63 compounds were detected in Xiangfeng Yueyan Drink and 60 compounds were detected in Shenqi Guyuan Drink. Compared with the model group， the fluorescence intensity of zebrafish yolk sac significantly weakened under the intervention of Xiangfeng Yueyan Drink （P＜0.01）;compared with the model control group， the total movement distance of zebrafish under the intervention of Shenqi Guyuan Drink was significantly longer （P＜0.05）.［Conclusion］The 2 kinds of medicinal and edible homologous beverage have clear anti-oxidation and anti-fatigue effects respectively.

Key words Zebrafish;Homology of medicine and food;LC-MS;Anti-oxidation;Anti-fatigue

基金項目 中國中醫(yī)科學院科技創(chuàng)新工程項目（CI2021A04012）。

作者簡介 孫博（1994—），男，黑龍江牡丹江人，博士研究生，研究方向：中藥活性成分及中藥新藥開發(fā)。

*通信作者，研究員，博士，從事中藥活性成分及生物學表征研究。

收稿日期 2023-07-11

近年來，中醫(yī)藥功能食品的研發(fā)在《“健康中國”2030綱要》等一系列政策文件出臺下受到廣泛關(guān)注［1］。作為助力人類健康發(fā)展、推動藥食同源產(chǎn)業(yè)升級的重要抓手，藥食同源品類中藥材被開發(fā)成飲品，以期通過獨特風味、清新口感、飲用方便和明確功效走進人們生活［2］。目前市場上的功能飲品的主要功用包括抗氧化、增強免疫力［3］和抗疲勞［4］。因此評價藥食同源類功能性飲品有必要引入抗氧化、抗疲勞能力的生物學評價方法，直觀反映產(chǎn)品的功效定位。

斑馬魚體型小，易飼養(yǎng)，繁殖迅速，所產(chǎn)幼卵能在72 h內(nèi)完成胚胎發(fā)育。一方面，斑馬魚具有體外試驗高效、快速、價低等優(yōu)勢；另一方面，作為一種完整的動物模型，斑馬魚可以對中藥功效進行全方面、深層次的評價。目前，模式動物斑馬魚已在中藥活性成分高通量篩選、藥效評價等方面發(fā)揮重要作用［5-6］。

氧化劑甲萘醌可以產(chǎn)生活躍的半醌，通過體內(nèi)氧化循環(huán)產(chǎn)生大量活性氧，從而誘導斑馬魚發(fā)生氧化損傷［7-8］；無水亞硫酸鈉能與氧氣反應，限制機體耗氧量從而構(gòu)建斑馬魚疲勞模型［9］。該研究利用斑馬魚抗氧化評價模型、抗疲勞評價模型，分別評價2種藥食同源的功能性飲品，同時利用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對2種飲品中的成分進行了鑒定，為后續(xù)中藥類藥食同源性產(chǎn)品（飲品）的功效評價和功效物質(zhì)基礎研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器。

Ultimate 3000超高效液相色譜儀（含自動進樣器、柱溫箱、在線真空脫氣機、低壓四元梯度泵、PDA檢測器），雙壓線性離子肼串聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀，LTQ Orbitrap Velos Pro，美國Thermo Fisher公司；KQ-250B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；高速冷凍離心機，美國Thermo Scientific公司；SZX7體式顯微鏡，奧林巴斯-中國有限公司；VertA1-CCD相機，上海土森視覺科技有限公司；Zebra Lab行為分析儀，法國ViewPoint公司；6孔板，中國Nest Biotech生物科技有限公司；CP214型精密電子天平，美國OHAUS公司。

1.1.2 試劑。

N-乙酰-L-半胱氨酸（批號I2016139，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；中華跌打丸［批號191112，廣西梧州制藥（集團）股份有限公司］；無水亞硫酸鈉（批號I1428128，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲基纖維素（批號C2004046，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二甲基亞砜（批號BCCD8942，美國西格瑪奧德里奇公司）；甲萘醌（批號I1817117，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；Cell ROXTM Green Reagent熒光染料（批號2387260，美國英杰生命技術(shù)有限公司）。甲醇為美國Fisher公司色譜級甲醇；乙腈為美國Fisher公司色譜級乙腈；水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.1.3 樣品信息。

試驗所用的2種藥食同源中藥產(chǎn)品香蜂悅顏飲、參杞固元飲，均為北京食喜健康科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 試驗動物。

斑馬魚來源于杭州環(huán)特生物科技股份有限公司，為野生型AB品系?？寡趸钚栽u價選用3日齡斑馬魚，抗疲勞活性評價選用5日齡斑馬魚。試驗用斑馬魚飼養(yǎng)于28 ℃水溫的專門水族箱，飼養(yǎng)用水的水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，pH為6.5～8.5，電導率為450～550 μS/cm，硬度為50～100 mg/L CaCO3。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液制備。

1.2.1.1 陽性藥溶液。取N-乙酰-L-半胱氨酸用超純水配制成12.5 mg/mL母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。中華跌打丸粉碎后用超純水溶解，并配制成200 mg/mL母液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.1.2

供試品溶液。分別取香蜂悅顏飲、參杞固元飲原液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后，分別按照不同濃度比例稀釋，即得。

1.2.2 LC-MS 分析條件。

1.2.2.1 色譜條件。

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸-水溶液（A）- 乙腈（B）；梯度洗脫（0～5 min，2%～12% B，5～20 min，12%～30% B，20～27 min，30%～50% B，27～32 min，50%～95% B）；流速0.3 mL/min；進樣量4 μL。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件。

采用電噴霧離子源（ESI）；正、負離子檢測模式，掃描時間35 min；蒸發(fā)溫度350 ℃；毛細管電壓為-35 V，噴霧電壓為-3.5 kV；鞘氣流速35 L/min，輔助氣流速10 L/min；噴霧電流100.00 kV；供試品和對照品溶液一級質(zhì)譜在FT模式下進行全掃描，掃描范圍m/z 100～1 200，二級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴性掃描；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Xcalibur軟件采集和分析。

1.2.3

抗氧化活性評價。隨機選取3日齡野生型斑馬魚于6孔板中，每孔容量為3 mL并放置30尾斑馬魚，分別設置正常組、模型組、陽性藥組和香蜂悅顏飲組（試驗組）。純凈水對樣品原液進行稀釋，水溶給藥。除正常組外，其余各組均水溶給予甲萘醌建立斑馬魚氧化損傷模型。香蜂悅顏飲組的給藥濃度分別為25、50、100 μL/mL。陽性藥組選擇的陽性藥為N-乙酰-L-半胱氨酸，給藥濃度為125 μg/mL。干預后，放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，24 h后收集斑馬魚。利用Cell ROXTM Green Reagent熒光染料對斑馬魚內(nèi)活性氧染色，30 min 后純凈水清洗3遍。各組隨機選取10尾斑馬魚置于熒光顯微鏡下拍照，以斑馬魚卵黃囊熒光強度的統(tǒng)計學分析結(jié)果評價樣品抗氧化功效。

1.2.4

抗疲勞活性評價。隨機選取5日齡斑馬魚于6孔板中，每孔容量為3 mL并放置30尾斑馬魚，分別設置正常對照組、模型對照組、陽性藥對照組和參杞固元飲組（試驗組）。純凈水對樣品原液進行稀釋，水溶給藥。參杞固元飲組的給藥濃度分別為25、50、100 μL/mL。陽性藥對照組選擇的陽性藥為中華跌打丸，給藥濃度為1 000 μg/mL。干預后，放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱。靜置18 h后，除正常對照組外，其余各試驗組均水溶給予無水亞硫酸鈉造成斑馬魚疲勞狀態(tài)。樣品與無水亞硫酸鈉共同處理后，每組隨機選取10尾斑馬魚置于行為分析儀采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚總運動距離，以該指標的統(tǒng)計學分析結(jié)果評價樣品緩解體力疲勞功效。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計學處理結(jié)果用mean ± SEM表示，P<0.05表明組間存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蜂悅顏飲成分分析

采用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術(shù)對香蜂悅顏飲的化學成分進行分析，結(jié)果見圖1。通過測得的精確相對分子質(zhì)量及二級質(zhì)譜的碎片離子推測化合物的結(jié)構(gòu)式，結(jié)合文獻進一步比對，共鑒定推斷出63個化合物，見表1。其中包括糖苷、皂苷、苯酚、環(huán)烯醚萜、黃酮等。這些成分主要來源于甘草、香蜂草、當歸、梔子等。

2.2 參杞固元飲成分分析

采用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術(shù)對參杞固元飲的化學成分進行分析，結(jié)果見圖2。通過測得的精確相對分子質(zhì)量及二級質(zhì)譜的碎片離子推測化合物的結(jié)構(gòu)式，結(jié)合文獻進一步比對，共鑒定推斷出60個化合物，見表2。這些成分主要來源于人參、甘草、紫蘇籽、山藥、覆盆子、黃精、茯苓、猴頭菇、針葉櫻桃、枸杞。

2.3 香蜂悅顏飲的抗氧化活性評價

正常組和模型組斑馬魚卵黃囊熒光強度統(tǒng)計結(jié)果表明（圖3～4），斑馬魚幼魚經(jīng)甲萘醌處理后，卵黃囊熒光強度顯著上升（P<0.001），表明造模成功。香蜂悅顏飲組斑馬魚卵黃囊熒光強度統(tǒng)計結(jié)果表明，25～100 μL/mL的香蜂悅顏飲對模型斑馬魚存在抗氧化作用，并且隨著干預濃度的上升，抗氧化作用逐漸加強。

2.4 參杞固元飲的抗疲勞活性評價

從圖5～6可以看出，模型對照組斑馬魚的總運動距離明顯比正常對照組有所縮短（P<0.001），表明造模成功。經(jīng)中華跌打丸和參杞固元飲干預的斑馬魚（陽性藥對照組和參杞固元飲組）總運動距離顯著遠于模型組，其中參杞固元飲100 μL/mL干預濃度下的斑馬魚運動距離最遠且最顯著（P<0.001）。

3 結(jié)論與討論

該試驗結(jié)果表明，通過甲萘醌建立的斑馬魚氧化損傷模型能夠有效評價陽性藥N-乙酰-L-半胱氨酸和香蜂悅顏飲的抗氧化作用，并體現(xiàn)出隨干預濃度上升抗氧化能力也在上升的趨勢。香蜂悅顏飲主要由香蜂草、甘草、當歸、梔子等中藥提取而成。香蜂草中迷迭香酸［10］、咖啡酸［11］、兒茶素［12］、原兒茶酸［13］均有明確的抗氧化作用。其中香蜂草中的香蜂草苷、木犀草素［14］以及甘草中的黃酮類化合物也是天然的抗氧化劑，有效清除體內(nèi)自由基，防止不飽和脂肪酸過量氧化，減緩衰老。

無水亞硫酸鈉影響機體耗氧量，從而減弱斑馬魚活動能力，但經(jīng)陽性藥中華跌打丸和參杞固元飲干預的斑馬魚，運動距離減弱較緩。特別是100 μL/mL參杞固元飲干預濃度下，斑馬魚無論活動距離和活動速度均基本與未經(jīng)無水亞硫

酸鈉干預的斑馬魚相當，一方面體現(xiàn)了抗疲勞模型對不同濃

度樣品評價的靈敏度，另一方面也體現(xiàn)了樣品有效性。參杞固元飲主要由人參、枸杞、甘草、黃精、猴頭菇、茯苓等藥食同源中藥組成。其中人參皂苷類成分可促進血液循環(huán)、增加心臟供血量、提高心臟功能［15-16］，并且枸杞、黃精、茯苓、猴頭菇中的多糖類成分也可以改善斑馬魚機體的血乳酸、血清尿素氮水平，提高抗疲勞能力以及增加運動耐力。

藥食同源是中醫(yī)藥文化的重要組成，其研究和開發(fā)既有助于滿足大眾保健養(yǎng)生、健康生活的期許，也推動產(chǎn)品經(jīng)濟的發(fā)展。其中飲品類產(chǎn)品的發(fā)展?jié)摿薮螅壳爸兴庮惖拇祟惍a(chǎn)品認知度較低，對此類引入建立合理且普遍適應的功效評價模型，可以直觀反映產(chǎn)品功效定位，來推動其市場潛力的充分發(fā)揮。

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