吳連周 程玉琦 陳敏氡 王彬 劉建汀 林錦輝 葉新如 曾美娟 溫慶放 朱海生

摘要 ［目的］通過分析干旱脅迫下“蜜本”南瓜基因CmGolS1（肌醇半乳糖苷合成酶基因1）的表達(dá)情況和可溶性糖含量的變化，解析干旱條件下南瓜的生理生化及基因水平變化，提高南瓜耐干旱能力。［方法］選用南瓜屬品種‘蜜本南瓜作為試驗(yàn)材料，干旱處理2～7 d。通過熒光定量PCR和可溶性糖含量測定，獲得CmGolS1基因表達(dá)量的變化和細(xì)胞可溶性糖含量的變化。［結(jié)果］ CmGolS1在未干旱處理的對照組幾乎不表達(dá)，隨著干旱處理時(shí)間延長，表達(dá)量上調(diào)，在處理第3天達(dá)到峰值，隨后在干旱處理3～7 d出現(xiàn)一定波動(dòng)，但始終相對對照組維持在高表達(dá)。對照組南瓜第一片真葉的可溶性糖含量在220 μg/g左右；在干旱處理第3天開始顯著上升，隨后維持在320～330 μg/g，可溶性糖含量在干旱處理中后期維持相對穩(wěn)定。［結(jié)論］干旱脅迫下，CmGolS1上調(diào)表達(dá)，其合成產(chǎn)物半乳糖是多種可溶性糖的前體，可能與生理生化中可溶性糖的上調(diào)有關(guān)?？扇苄蕴堑姆e累是植物抗旱過程中的一項(xiàng)重要生理反應(yīng)，有助于降低細(xì)胞水勢，抵御干旱環(huán)境。CmGolS1基因可為南瓜干旱脅迫下的生理生化變化及抗旱育種的分子機(jī)制提供重要信息。

關(guān)鍵詞 南瓜；干旱；GolS；可溶性糖

中圖分類號 S 642.1? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）12-0066-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.12.013

Changes of CmGolS1 Expression and Related Physiological Indexes in Pumpkin Under Drought Stress

WU Lian-zhou1，2，3，4， CHENG Yu-qi1，2，3，4，CHEN Min-dong2，3，4 et al

（1.College of Horticulture，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002;2.Crop Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350013;3.Fujian Key Laboratory of Vegetable Genetics and Breeding， Fuzhou， Fujian 350013;4.Fujian Engineering Technology Research Center for Vegetable， Fuzhou， Fujian 350013）

Abstract ［Objective］ By analyzing the expression of CmGolS1（galactinol synthase1） and the changes of soluble sugar content in ‘Miben pumpkin under drought stress， the physiological， biochemical and gene level changes of pumpkin under drought stress were analyzed， so as to improve the drought tolerance of pumpkin. ［Method］ The Cucurbita cultivar ‘Miben was selected as the research material and treated with drought for 2-7 days. The changes of CmGolS1 gene expression and soluble sugar content were detected by fluorescence quantitative PCR and soluble sugar content assay. ［Result］ CmGolS1 was almost not expressed in the control group， but with the progress of drought treatment， its expression level increased significantly， reached a significant high value on the third day of drought treatment， and then fluctuated within 3-7 days of drought treatment， but remained high compared with the control group. The soluble sugar content of the first true leaf of pumpkin in the control group was maintained at about 220 μg/g;it began to increase significantly at 3 days after drought treatment， and then maintained at 320-330 μg/g. The soluble sugar content remained relatively stable in the middle and late stage of drought treatment. ［Conclusion］ Under drought stress， the expression of CmGolS1 is up-regulated， and its synthetic product galactose is the precursor of a variety of soluble sugars， which may be related to the up regulation of soluble sugars in physiology and biochemistry. The accumulation of soluble sugar is an important physiological response in the process of plant drought resistance， which helps to improve cell water potential and resist drought environment. CmGolS1 gene can provide important information for physiological and biochemical changes of pumpkin under drought stress and molecular mechanism of drought resistance breeding.

Key words Pumpkin;Drought;GolS;Soluble sugar

基金項(xiàng)目 福建省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)（2022R1031007）；福建省農(nóng)科院科技創(chuàng)新平臺專項(xiàng)（CXPT2021001）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2021J01494）；國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系福州綜合試驗(yàn)站（CARS-23-G-53）。

作者簡介 吳連周（1992—），男，福建福州人，研究實(shí)習(xí)員，從事蔬菜育種與生物技術(shù)研究。

*通信作者，研究員，從事蔬菜育種與生物技術(shù)研究。

收稿日期 2023-07-04

南瓜（Cucurbita ssp.）在世界各地普遍栽培。其果實(shí)作肴饌，亦可替代糧食，營養(yǎng)豐富，果肉富含果膠、戊聚糖、甘露糖、多種氨基酸、維生素C、胡蘿卜素及多種礦物質(zhì)，其耐旱性、適應(yīng)性強(qiáng)，是我國人民喜愛的傳統(tǒng)蔬菜，在我國廣泛種植。我國是世界上南瓜最大的生產(chǎn)和消費(fèi)國［1-2］。我國廣大的北方地區(qū)常年缺水，南方丘陵地區(qū)也同樣存在季節(jié)性干旱問題。如果植物水分供給不足，將會(huì)嚴(yán)重限制植物生長發(fā)育，影響產(chǎn)量。而灌溉用水不斷增加，將會(huì)激化水資源的供需矛盾，也必然會(huì)使當(dāng)前已經(jīng)存在的水資源失衡問題進(jìn)一步惡化，這將成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的障礙。不利的干旱環(huán)境，不僅會(huì)影響作物內(nèi)在的許多生理代謝過程，也會(huì)影響作物體內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸及植物的光合效率，影響產(chǎn)量和品質(zhì)。在實(shí)際生產(chǎn)過程中夏季南瓜常會(huì)遇到干旱環(huán)境的影響。當(dāng)蔬菜受到干旱環(huán)境影響時(shí)，其光合作用減弱，根系的吸收能力下降，并出現(xiàn)生理生化代謝紊亂，從而導(dǎo)致蔬菜作物出現(xiàn)發(fā)育不良或早衰、生長停滯和間歇性結(jié)果。

植物受到環(huán)境脅迫時(shí)，可以迅速合成并積累不同種類的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來維持植物細(xì)胞內(nèi)正常的生理機(jī)能，避免植物受到脅迫傷害，棉子糖系列寡糖即為一種小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。正常生長條件下，棉子糖系列寡糖在植物體內(nèi)積累量相對較少，而受到外界脅迫時(shí)，其含量會(huì)迅速增加。肌醇半乳糖苷合成酶是棉子糖合成過程中的關(guān)鍵酶，因此，認(rèn)為GolS是植物應(yīng)對環(huán)境脅迫的關(guān)鍵基因［3］。目前，在GolS的研究上，研究者從表達(dá)分析、生理研究到遺傳轉(zhuǎn)化均做了大量工作，主要研究其在大豆［4-5］、芝麻［6］、巴西橡膠［7］、擬南芥［8-9］、巨桉［10］、刺齒報(bào)春［11］、玉米［12］、棉花［13］、新疆沙冬青［14］、梅花［15］等植物體內(nèi)的表達(dá)情況。在對大豆的研究中發(fā)現(xiàn)，在多種非生物脅迫作用下，GolS的表達(dá)量均受到影響，其中尤其以干旱脅迫下的表達(dá)變化最為顯著，推測該基因受干旱脅迫影響顯著［4］。

CmGolS1基因是一個(gè)糖類合成的關(guān)鍵基因，在先期轉(zhuǎn)錄組測序研究中，發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)變化大，前人研究發(fā)現(xiàn)，該基因是干旱脅迫的關(guān)鍵基因，且在南瓜中尚未有研究。

筆者通過結(jié)合可溶性糖含量的變化，來解釋該基因在干旱脅迫下的表達(dá)變化以及相關(guān)的干旱生理反應(yīng)，以初步揭示該基因參與的南瓜干旱的生理生化和基因表達(dá)進(jìn)程，為抗旱育種和栽培管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為福建金品農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)苗期正常生長狀態(tài)下的南瓜屬（Cucurbita）品種“蜜本”南瓜。

1.2 試驗(yàn)方法

選取苗期兩葉一心時(shí)期，干旱脅迫2、3、4、5、7 d，分別記作D2、D3、D4、D5、D7，對照組選用處理0天的幼苗，記作D0。培養(yǎng)環(huán)境見表1。處理第0天14：00將每個(gè)穴盤中加入1 L水，1 h后將水倒去，瀝干，并記作第0天，此后不再澆水。以后每次取樣時(shí)間均為15：00。穴盤選用28孔穴盤苗，邊取樣，邊疏苗。

1.3 可溶性糖含量的測定

1.3.1

蒽酮乙酸乙酯的制備。將1 g蒽酮溶解于50 mL乙酸乙酯中，備用。

1.3.2

可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。選取50 mL離心管若干，分別加入0、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 100 μg/mL的蔗糖溶液，用水補(bǔ)齊至2 mL編號后分別加入0.5 mL的蒽酮乙酸乙酯和5 mL濃硫酸。密封后快速充分振蕩，振蕩后立即將試管放入100 ℃水浴中加熱10 min，而后取出冷卻至室溫，以不加蔗糖溶液的對照管在630 nm波長下調(diào)零，其他各管依次測定吸光值，求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.3.3

樣品可溶性糖含量測定。剪下待測南瓜第一片真葉0.3 g，剪碎后加入15 mL玻璃試管中，向管中加入5 mL超純水，密封后快速充分振蕩，振蕩后立即將試管放入100 ℃水浴中加熱10 min，加熱之后用漏斗和濾紙將提取液過濾到25 mL有刻度的試管中，用蒸餾水洗滌漏斗上殘留2次并收集清洗之后的液體，將試管中液體定容至25 mL，得到的溶液即為樣品提取液。吸取樣品提取液1 mL，并用玻璃試管盛放，依表2進(jìn)行加樣，提取液代替蔗糖溶液，蒸餾水體積均調(diào)整為1 mL。取出冷卻至室溫，在630 nm波長下測樣品管的吸光值，重復(fù)測定，數(shù)值穩(wěn)定后，取最后一次數(shù)值。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算可溶性糖含量。

1.4 葉片水勢的測定

使用未受干旱脅迫的南瓜葉片進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定未受干旱脅迫下南瓜葉片的水勢，并設(shè)置不同水勢梯度對應(yīng)的蔗糖濃度范圍。

標(biāo)準(zhǔn)濃度的蔗糖溶液配制：取若干干燥試管，給各管依次編號并排在試管架上。配制好預(yù)設(shè)的不同濃度的蔗糖溶液，并分別取20 mL作為標(biāo)準(zhǔn)蔗糖濃度試驗(yàn)用液體，剩余液體保存供不同干旱程度的南瓜葉片測定用。

選擇不同干旱時(shí)期的南瓜第一片真葉，液氮冷凍粉碎后，取0.1 g放入試管中，分別倒入4 mL不同濃度的蔗糖溶液，靜置或抽真空，待南瓜葉片完全沉入溶液底部。向各管加入一滴甲烯藍(lán)溶液，輕輕振蕩后溶液呈藍(lán)色。使用20 μL槍頭，彎折后從各管中按蔗糖溶液濃度從小到大依次吸取適量少許著色的液體，然后伸入與之相對應(yīng)的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蔗糖溶液，輕輕擠壓毛細(xì)滴管使其尖端橫向流出一滴著色液體，并觀察著色液滴的移動(dòng)方向。若液滴上移則表示試驗(yàn)組蔗糖溶液濃度降低，即葉片水勢對應(yīng)蔗糖濃度大于蔗糖溶液濃度，葉片失水，反之亦然，若液滴高度不變，則該濃度下的蔗糖溶液水勢即為葉片水勢。

水勢的計(jì)算公式：Ψw=－iCRT（MPa）

1.5 熒光定量PCR

1.5.1 內(nèi)參基因的篩選。

通過NCBI獲得南瓜18S rRNA序列，使用primer premier 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，獲得備選的內(nèi)參基因引物。對備選的引物進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，觀察備選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性及其溶解曲線，最終選定內(nèi)參基因。

1.5.2 引物設(shè)計(jì)。

對CmGolS1基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，挑選出3對引物，送往生物公司進(jìn)行引物合成。對合成的引物，進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，觀察備選基因的溶解曲線，最終確定所使用引物。

1.5.3 基因表達(dá)情況驗(yàn)證。

（1）RNA提取。對不同干旱處理時(shí)期的南瓜第一片真葉總RNA的提取，采用諾唯贊公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒。提取后，對總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測。

RNA濃度測定。取南瓜RNA提取樣品，用超微量分光光度計(jì)測定每管南瓜葉片RNA樣品的OD230/260、OD260/280及RNA濃度。

RNA質(zhì)量檢測。配制1% TAE電泳膠，以120 V電壓進(jìn)行電泳，約30 min，通過凝膠成像儀檢測RNA電泳結(jié)果。

（2）反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產(chǎn)的試劑盒，流程見表2。

（3）qPCR反應(yīng)。為防止試驗(yàn)出現(xiàn)的操作誤差，試驗(yàn)過程中設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)反應(yīng)做2個(gè)復(fù)孔，結(jié)果使用方法計(jì)算，以濃度100 ng/mL的cDNA為模板，分別在PCR管中加入2×ChamQ Universal SYBR q PCR Master mix 10.0 μL，

Primer 1（10 μmol/L）0.4 μL，

Primer 2（10 μmol/L）0.4 μL，

Template DNA/cDNA 100 ng，加ddH2O至20.0 μL。qPCR反應(yīng)流程見表3。

對于任一處理DX的基因，其相對表達(dá)量的計(jì)算方法為2^（CT內(nèi)參-CTDX），每一個(gè)處理天數(shù)下的內(nèi)參基因均與該處理天數(shù)下的所有基因同時(shí)進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，用以校正單日的基因表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對南瓜幼苗可溶性糖含量的影響

使用標(biāo)準(zhǔn)濃度蔗糖溶液制作可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1，可溶性糖含量回歸方程為y=224.18x，其中y為可溶性糖含量（μg），x為溶液620 nm處吸光值。

由圖2可知，對照組南瓜第一片真葉的可溶性糖含量在220 μg/g左右；在干旱處理3 d開始顯著上升，隨后維持在320～330 μg/g。

2.2 干旱脅迫對南瓜幼苗葉片水勢的影響

由圖3可知，對照組葉片水勢在-0.60 MPa左右；隨著干旱脅迫的加劇，干旱處理2 d，南瓜第一片真葉水勢下降至-0.75 MPa；干旱處理3 d，葉片水勢下降至低點(diǎn)，此后一直在-1.00 MPa以下。

2.3 干旱脅迫下南瓜CmGolS1表達(dá)量的變化

由圖4可知，CmGolS1基因在對照組中幾乎不表達(dá)，而隨著干旱脅迫的加劇，其表達(dá)量大幅提高，在第2天即表達(dá)量顯著提高，第3天之后在較高值附近波動(dòng)。

2.4 干旱脅迫下南瓜基因表達(dá)變化和生理生化變化的相關(guān)性分析

由表4與圖5可知，CmGolS1基因在干旱處理下的mRNA相對表達(dá)量與第一片真葉中可溶糖含量呈顯著正相關(guān)（P<0.01），相關(guān)系數(shù)為0.88。

由表5與圖6可知，葉片可溶性糖含量在干旱處理下與葉片水勢呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），相關(guān)系數(shù)為0.92。

3 討論

肌醇半乳糖苷合成酶（GolS）是植物在抵御多種非生物脅迫過程中合成棉子糖的第一個(gè)限速酶，其催化蔗糖逐步疊加半乳糖基團(tuán)而合成棉子糖家族低聚糖（RFOs），并參與植物對低溫、干旱、非選擇性接觸性除草劑、機(jī)械傷害和活性氧等非生物脅迫過程的防御和應(yīng)答［16］，目前多在參與種子或葉片等組織器官中RFOs的積累與抗性的關(guān)系中有研究。因此，RFOs代謝途徑與植物抗逆性之間關(guān)系密切，而GolS是RFOs生物合成起始的關(guān)鍵限速酶，其催化肌醇半乳糖苷的合成，并以此為供體，在棉籽糖合成酶和水蘇糖合成酶的作用下，將蔗糖合成為棉籽糖和水蘇糖等寡糖［17］。這些可溶性糖不僅可以在細(xì)胞中作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，還可以作為植物響應(yīng)環(huán)境的信號物質(zhì)［18］。而正常生長條件下，棉子糖系列寡糖在植物體內(nèi)積累量相對較少，在受到外界的脅迫時(shí)，含量迅速增加。將大豆GmGolS1克隆并進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GmGolS1基因的過表達(dá)，可以提高煙草的耐高溫性［19］。因此，認(rèn)為GolS是植物應(yīng)對環(huán)境脅迫的關(guān)鍵基因。

在對南瓜可溶性糖含量的測定中發(fā)現(xiàn)，南瓜在干旱第3天即在葉片內(nèi)大量積累可溶性糖，隨后維持在較高水平。這與前人在干旱對興安落葉松［20］、小葉錦雞兒幼苗［21］以及刺槐幼苗［22］干旱脅迫下可溶糖含量變化的研究結(jié)果相一致，且研究表明，可溶性糖含量的增加來源于淀粉的分解。結(jié)合可溶性糖的抗旱作用，表明南瓜植株在干旱脅迫下表現(xiàn)出比較穩(wěn)定的抗旱性，且反映出南瓜在干旱第3天已經(jīng)出現(xiàn)抗旱生理反應(yīng)。對水勢的觀察中發(fā)現(xiàn)，南瓜葉片水勢響應(yīng)干旱脅迫較為迅速，在干旱脅迫初期的第3天，其第一片真葉水勢便下降至低點(diǎn)，以響應(yīng)干旱脅迫，隨后水勢維持在較低水平，推測這可能與可溶性糖的積累有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下葉片水勢的變化，與氣孔閉合存在一定關(guān)系［23-24］，而水勢的高低，不僅意味著植株抗旱能力的強(qiáng)弱，也預(yù)示著植株吸水潛能的強(qiáng)弱。較低的水勢，往往伴隨著較高的吸水潛能［25］，吸水潛能越高，則植株在復(fù)水后，往往可以越快地恢復(fù)生長［26］。可溶性糖含量的增加，加強(qiáng)了植株的抗旱能力；淀粉作為可溶性糖的前體，在水中的溶解度較低［27-30］，故淀粉的減少對水勢下降的影響較少。在qPCR驗(yàn)證中，發(fā)現(xiàn)CmGolS1基因的上調(diào)表達(dá)，與生理生化試驗(yàn)中可溶性糖含量增加和水勢下降變化高度一致，推測CmGolS1基因的上調(diào)表達(dá)與可溶性糖含量的積累和水勢的下降高度相關(guān)，并最終作用于植株，使植株具有一定的抗旱性。

相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)，CmGolS1基因表達(dá)量變化與可溶性糖含量變化的P值小于0.01，且相關(guān)性R值為0.88，呈顯著相關(guān)；可溶性糖含量變化與葉片水勢變化的P值小于0.01，且相關(guān)性R值為0.92，呈顯著相關(guān)。因此推測，CmGolS1基因在干旱脅迫中表達(dá)量的提高，引起了可溶性糖的大量積累，繼而引起葉片水勢下降，以使葉片維持在較高的滲透壓下不易失水，以應(yīng)對干旱脅迫。

CmGolS1受多種逆境條件誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，該試驗(yàn)驗(yàn)證了其受干旱脅迫上調(diào)表達(dá)。但具體受干旱脅迫上調(diào)表達(dá)的原因尚不明晰，推測其上游啟動(dòng)子中可能存在響應(yīng)給干旱脅迫及其他脅迫的元件，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。前人研究中發(fā)現(xiàn)，AtTGA7［31］、Atpmyb35［32］、Oshox24P［33］基因都是重要的干旱誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，MYB家族［34］、WRKY家族［35-36］中亦有許多干旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，可作為未來研究的突破口。

4 結(jié)論

通過“蜜本”南瓜干旱脅迫的可溶性糖含量變化、葉片水勢變化和CmGolS1基因表達(dá)量變化的研究發(fā)現(xiàn)，2項(xiàng)生理指標(biāo)與CmGolS1含量的變化均高度相關(guān)。可溶性糖含量在第3天升高之后穩(wěn)定于高點(diǎn)，而葉片水勢在第3天降低之后穩(wěn)定于低點(diǎn)，推測可溶性糖為植株抗旱的重要物質(zhì)，其在干旱脅迫進(jìn)程中持續(xù)為植株提供抗旱能力，避免細(xì)胞過量失水，并造成細(xì)胞處于低水勢，可以用作衡量南瓜抗旱性的指標(biāo)之一，可以作為其他品種南瓜抗旱性的鑒定指標(biāo)。

“蜜本”南瓜干旱脅迫過程中的生理指標(biāo)，結(jié)合CmGolS1基因表達(dá)量的變化，可為南瓜抗旱育種的分子機(jī)制提供重要信息，并可以進(jìn)行后續(xù)敲除、過表達(dá)等試驗(yàn)，驗(yàn)證其基因功能。

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