畢思遠(yuǎn) 羅傲 廖建珍 房志家 羊世成 李新紅 趙聰

摘要 經(jīng)過16S rDNA以及各項(xiàng)菌株生理生化特性研究試驗(yàn)，尋找一種耐熱性較好的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌（HN-AD）菌株，并將菌株接種至模擬污水環(huán)境的硝酸鹽氮培養(yǎng)基中，研究其在不充足碳源及充足碳源的情況下菌株的脫氮效率及硝酸鹽氮去除率。結(jié)果表明，在溫泉中篩選出一種可使污水的pH更適合自身反硝化作用的HN-AD菌株，經(jīng)鑒定所篩選出的HN-AD菌為斯氏假單胞菌。該菌株在模擬污水環(huán)境下反硝化最適pH為8.0，在充足碳源的情況下，其硝酸鹽氮去除率能到達(dá)93%以上。菌株不僅擁有著較為高效的脫氮效率以及較高的硝酸鹽氮去除率，而且擁有著自我調(diào)節(jié)環(huán)境pH的能力，能在充足碳源的情況下調(diào)節(jié)至最佳氮降解的pH。

關(guān)鍵詞 污水處理；耐高溫異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌；分離鑒定；脫氮特性

中圖分類號 X 703 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）12-0007-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.12.002

Isolation， Identification and Denitrification Characteristics of High-temperature Tolerant Heterotrophic Nitrification and Aerobic Denitrification

BI Si-yuan1，2，3，LUO Ao2，LIAO Jian-zhen2 et al

（1.College of Materials and Chemical Engineering， Hezhou University， Hezhou， Guangxi 542899;2.College of Food Science and Technology， Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong 524088;3.Shenzhen Jinyue Testing Technology Co.， Ltd.， Shenzhen， Guangdong 518100）

Abstract Through the study of 16S rDNA and physiological and biochemical characteristics of various strains， a heterotrophic nitrification and aerobic denitrification bacteria （HN-AD） strain with good heat resistance was found. The strain was inoculated into a nitrate nitrogen culture medium simulating sewage environment to study its denitrification efficiency and nitrate nitrogen removal rate under insufficient and sufficient carbon sources.The results showed that HN-AD strain that could make the pH of wastewater more suitable for its own denitrification was screened in hot springs， and the identified HN-AD strain was Pseudomonas stutzeri.The optimal pH for denitrification of this strain in a simulated wastewater environment was 8.0，with sufficient carbon source， its nitrate nitrogen removal rate could reach over 93%.The strain not only had a relatively efficient denitrification efficiency and a high nitrate nitrogen removal rate， but also had the ability to self regulate the environmental pH， which could be adjusted to the optimal pH for nitrogen degradation under sufficient carbon sources.

Key words Sewage treatment; High temperature tolerant heterotrophic nitrification and aerobic denitrification bacteria（HN-AD）;Isolation and identification;Denitrification characteristics

基金項(xiàng)目 廣西博士后專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（202320）；湛江市科技計劃項(xiàng)目（2022A01014）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（62205221）。

作者簡介 畢思遠(yuǎn)（1983—），男，山東濟(jì)南人，副研究員，博士，從事食品安全工程研究。*通信作者，副教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事食品質(zhì)量安全研究。

收稿日期 2023-08-17

隨著社會發(fā)展，污水排放等環(huán)境問題逐漸受到重視。城市污水、工業(yè)污水、廚余污水等未經(jīng)處理直接排放到自然中，其中的含氮化合物蓄積并導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，藻類生長過于旺盛，致使水體中含氧量下降，水生動植物大面積死亡，人類攝入嚴(yán)重超標(biāo)含氮化合物飲用水會致癌［1］。目前處理污水中含氮化合物的最有效的方法為生物法，利用微生物的硝化及反硝化過程對污水進(jìn)行脫氮處理。但傳統(tǒng)的微生物處理有一定局限性，因其將完整脫氮處理流程分為好氧硝化和厭氧反硝化兩部分，說明傳統(tǒng)微生物脫氮法具有啟動時間長、處理場地大等缺陷［2］。針對這一局限提出了一種新型的微生物脫氮方法，即異養(yǎng)硝化-好氧反硝化（heterotrophic nitrification and aerobic denitrification，HN-AD），其克服了傳統(tǒng)微生物脫氨法的局限，尋找出能同時進(jìn)行異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的菌株，并讓其在好氧條件下不但可完成硝化過程，還能進(jìn)行反硝化過程［3］。未經(jīng)處理的污水一般環(huán)境都不適合普通微生物生長，如污水內(nèi)的pH過酸或過堿、溫度偏高等，而一般的硝化反硝化微生物也只能在溫度和pH適合時才能保持高效的脫氮反應(yīng)［4］。盡管此前已有許多研究者發(fā)現(xiàn)有些HN-AD菌能在較高溫度中進(jìn)行異養(yǎng)硝化-好氧反硝化脫氮功能，但其活躍溫度仍在40 ℃，且對污水的pH具有嚴(yán)格要求，致使需要在污水進(jìn)行異養(yǎng)硝化-好氧反硝化脫氮前對污水進(jìn)行降溫以及調(diào)節(jié)pH以便能讓HN-AD菌能保持最大活性進(jìn)行脫氮作業(yè)［5］。而在污水的各種含氮化合物中，又以硝酸鹽氮最難去除，所以該試驗(yàn)?zāi)康脑谟趯ふ乙环N能夠耐高溫的HN-AD菌，并研究其在不同溫度和pH中對硝酸鹽氮的去除效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 篩菌樣品。

為得到耐熱性好的HN-AD菌，該研究采集了湛江市霞山區(qū)天然火山溫泉進(jìn)行后續(xù)的篩菌樣品。

1.1.2 試驗(yàn)試劑與培養(yǎng)基。

氯化鈉、濃鹽酸、硝酸鈉、無水乙醇、瓊脂粉、硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液、丁二酸鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、七水硫酸亞鐵、七水硫酸錳、磺胺、可溶性淀粉、碘、過氧化氫、無水葡萄糖、溴百里酚藍(lán)、甲基紅均為國產(chǎn)分析純。

反硝化培養(yǎng)基：用于前期篩選能利用硝基鹽氮作為氮源的培養(yǎng)基，其配方為KNO3 2.00 g、丁二酸鈉5.00 g、K2HPO4 1.00 g、MgSO4·7H2O 0.02 g、K2HPO4 1.00 g、蒸餾水1 000 mL。

反硝化鑒別細(xì)菌培養(yǎng)基：用于鑒別篩選出的菌株是否具有反硝化功能，其配方為丁二酸鈉5.00 g、KNO3 2.00 g、Na2HPO4 1.00 g、MgSO4·7H2O 0.02 g、K2HPO4 1.00 g、1%溴百里酚藍(lán)3 mL、蒸餾水1 000 mL。

維氏鹽溶液：用于提供微生物生長活動所需的各項(xiàng)微量元素，其配方為NaCl 2.50 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、K2HPO4 6.50 g、MgSO4·7H2O 2.50 g、FeSO4·7H2O 0.05 g、蒸餾水1 000 mL。

硝酸鹽氮培養(yǎng)基：用于檢測菌株的反硝化效率，其配方為NaNO3 0.51 g、丁二酸鈉8.50 g、維氏鹽溶液50 mL、蒸餾水1 000 mL。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：用于菌株增殖以及活化，其配方為蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 mL。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：用于觀察菌株生長形態(tài)和后續(xù)鏡檢使用，其配方為蛋白胨10 g、瓊脂17 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 mL。

甲基紅培養(yǎng)基：用于檢測菌株甲基紅試驗(yàn)，其配方為蛋白胨7 g、NaCl 5 g、葡萄糖5 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

淀粉酶培養(yǎng)基：用于檢測菌株淀粉酶試驗(yàn)，其配方為NaCl 5 g、牛肉膏3 g、胰蛋白胨10 g、可溶性淀粉20 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.3 試驗(yàn)儀器。

高速離心機(jī)，H1650-W，湘潭湘儀儀器有限公司；超凈工作臺，SW-CJ-1G，上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；紫外可見光分光光度計，TU-1901，北京普析通用儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，ZY-50F，浙江新豐儀器有限公司；pH計，PHS-3C，上海儀電科學(xué)儀器有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，BSD-YX3200，北京博訊科技有限公司；電子顯微鏡，BM-500T，南京南派科技有限公司；生化培養(yǎng)箱，BSD-YX2400，上海一恒儀器有限公司；電子精密天平，Ar224CN，奧豪斯儀器有限公司；恒溫水浴鍋，HWS-26，上海五相儀器儀表有限公司；多功能酶標(biāo)儀，Varioskan LUK，賽默科技儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 HN-AD菌分離與篩選。

1.2.1.1 涂布。取2 mL溫泉水，80 ℃水浴10 min，采用梯度稀釋法稀釋樣品后，取0.1 mL樣品涂布至反硝化鑒別培養(yǎng)基固體平板中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將樣品涂布至反硝化鑒定培養(yǎng)基中，觀察培養(yǎng)基中的顏色變化。

1.2.1.2 劃線純化。將涂布培養(yǎng)出培養(yǎng)基附近藍(lán)色的單菌落用接種環(huán)挑取少許在反硝化鑒別細(xì)菌培養(yǎng)基固體平板中進(jìn)行劃線純化，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.1.3 保菌。劃線后反硝化培養(yǎng)基固體平板有明顯菌落長出時，隨機(jī)挑選單菌落轉(zhuǎn)移至5 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，放入37 ℃，150 r/min恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)2 d。混勻菌液后于離心管中，8 000 r/min離心1 min，棄去上清液，剩余菌液與甘油以1∶1的比例混勻后，置于-80 ℃冰箱中進(jìn)行菌株保存。

1.2.2 菌株生理生化特征鑒定試驗(yàn)。

1.2.2.1 菌落觀察。將篩選出的菌株通過平板劃線的方法接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)基上菌株清晰可見且生長狀況良好時，對培養(yǎng)基上的菌株進(jìn)行形態(tài)特征觀察，如菌落色彩、形狀、透明度等。

1.2.2.2 基因測序。

對菌株的16S rDNA基因測序，測序結(jié)果于NCBI和EzBioCloud的基因數(shù)據(jù)庫（16S-based）比對分析，利用Mega 5軟件中neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過系統(tǒng)發(fā)育樹大致確定菌株的屬名。

1.2.2.3

革蘭氏染色。取少量菌株于反硝化培養(yǎng)基進(jìn)行平板劃線，有明顯單菌落時，取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色。

1.2.2.4

甲基紅試驗(yàn)。接種菌株至甲基紅培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)條件為37 ℃、150 r/min，在試管中滴入1滴甲基紅試劑。

1.2.2.5

淀粉酶試驗(yàn)。將菌株活化后涂布至淀粉酶試驗(yàn)培養(yǎng)基中，置于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，將碘液滴加至淀粉酶培養(yǎng)基。

1.2.2.6

接觸酶試驗(yàn)。用接種環(huán)取已活化好的菌株涂抹在載玻片上，滴加2～3滴過氧化氫溶液。

1.2.3 不同環(huán)境因子對菌株反硝化效率的影響。

設(shè)置7個梯度pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），6個梯度溫度（30、40、50、60、70、80 ℃），每個單獨(dú)梯度設(shè)置3個平行。將硝酸鹽氮培養(yǎng)基升溫至設(shè)定的溫度后，將OD600為0.2的菌株接入至培養(yǎng)基中，模擬菌株直接接入高溫污水，待培養(yǎng)基降至室溫后放入37 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12 h取出部分培養(yǎng)基進(jìn)行硝酸根含量檢測，探究菌株在不同環(huán)境因子下對硝酸鹽氮的利用效率。

1.2.4 培養(yǎng)基中硝酸根含量檢測。采用紫外分光光度法檢測培養(yǎng)基中硝酸根含量，即取1 mL的1 g/L硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中定容，制成10 mg/L的硝酸鉀工作液；分別取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL比色管中定容后分別測量其A220、A275，通過差值A(chǔ)=A220-A275計算硝酸根含量（C）并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程為A=4.646 8C-0.089 2（R2=0.993 1）。

取1.5 mL培養(yǎng)基放入2 mL離心管中進(jìn)行8 000 r/min離心1 min，取1 mL上清液于25 mL比色管中進(jìn)行定容后分別測量其 A220、A275，并結(jié)合硝酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出培養(yǎng)基中硝酸根含量［6］。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐熱 HN-AD 菌的分離篩選結(jié)果

觀察培養(yǎng)基中的顏色變化，培養(yǎng)基附近藍(lán)色的單菌落有4株，如圖1所示。

2.1.1 耐熱HN-AD菌效率篩選。

利用HN-AD菌將無機(jī)氮轉(zhuǎn)換為氣態(tài)氮過程中會產(chǎn)堿，使培養(yǎng)基中的pH升高。將目標(biāo)菌單獨(dú)接種至反硝化鑒別細(xì)菌培養(yǎng)基中，觀察培養(yǎng)基中的顏色變化程度，選擇反硝化效率最高的菌株，反硝化鑒別細(xì)菌培養(yǎng)基前后對比如圖2所示。

2.1.2 耐熱 HN-AD 菌形態(tài)特征觀察。

通過觀察圖3，菌株形態(tài)為圓形，白色有稍黃，菌株表面光滑圓潤，有光澤，邊緣有稍微皺褶。

2.1.3 耐熱HN-AD菌16S rDNA鑒定。

對目標(biāo)菌株的16S rDNA進(jìn)行測序，該測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對分析表明，目的

菌株與Pseudomonas stutzeri ATCC 17588（T）菌株的相似性最高，根據(jù)16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析（圖4）以及生理生化特性，確定該細(xì)菌為斯氏假單胞菌（Paenibacillus swuensis），并命名為S2-51。

2.1.4 革蘭氏染色。

菌株革蘭氏染色結(jié)果為紅色桿狀菌，革蘭氏染色陰性，鏡檢結(jié)果如圖5所示。

2.1.5 甲基紅試驗(yàn)。

菌株甲基紅試驗(yàn)結(jié)果為陰性，接菌培養(yǎng)基滴加甲基紅試劑后變黃，如圖6所示。

2.1.6 淀粉酶試驗(yàn)。

菌株淀粉酶試驗(yàn)結(jié)果為陽性，菌株附近培養(yǎng)基接觸碘液變藍(lán)，如圖7所示。

2.1.7 接觸酶試驗(yàn)。

微生物接觸到過氧化氫后產(chǎn)生了大量氣泡，接觸酶試驗(yàn)結(jié)果為陽性，如圖8所示。

2.2 不同pH對耐熱HN-AD菌反硝化效率的影響

pH對微生物生長繁殖和脫氮功能有很大的影響，具體表現(xiàn)為不同pH條件下菌株內(nèi)的酶活性不同，或會影響菌株生物膜上的電荷變化，嚴(yán)重會導(dǎo)致菌株細(xì)胞內(nèi)電荷失衡而造成膜破裂甚至死亡。一般耐熱HN-AD菌在硝化作用下生成H+，以及反硝化作用下消耗H+，所處環(huán)境的pH對其脫氮效率影響較大，因此探尋其最適pH加快其脫氮速度十分有必要［7-9］。

將硝酸鹽氮反硝化培養(yǎng)基加熱到設(shè)定溫度后，將OD600為0.2的耐熱HN-AD菌接種至培養(yǎng)基中，并等待其冷卻到室溫后放入至恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每12 h取出部分培養(yǎng)基進(jìn)行硝酸根含量檢測，以鑒定菌株在硝酸鹽氮中的脫氮效率和去除率。各溫度下pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的硝酸鹽氮去除率平均值分別為7.0%、14.7%、59.8%、59.0%、78.9%、76.4%和68.3%。由此得知，在pH 8.0時，硝酸鹽氮的去除率最高，而pH 9.0次之。此外根據(jù)圖9可知，在不同溫度處理下pH 8.0的組別中硝酸鹽氮脫氮效率最快。分析數(shù)據(jù)得知，在pH 4.0和5.0的情況下，其脫氮效率及硝酸鹽氮去除率較低，若將菌株用于異養(yǎng)硝化-好氧反硝化脫氮工藝中，需提前將污水的pH調(diào)至堿性以加快菌株的脫氮效率。而在pH 8.0和9.0的情況之外，其硝酸鹽氮的去除率并不明顯，但通過數(shù)據(jù)分析，菌株在生長繁殖以及脫氮過程中會自行改變環(huán)境的pH至最適合反硝化脫氮工藝的pH，硝酸鹽氮培養(yǎng)基經(jīng)48 h培養(yǎng)后，原pH由4.13、5.09、6.01、7.07、8.17、9.12、10.03分別變化為4.47、7.89、8.21、8.32、8.43、8.42、8.16。綜上所得污水原始pH在5～10，只要向污水中投入足夠的碳源菌株會自行改變其中的pH至8.0附近，這節(jié)省了大量人力去定時調(diào)整污水中的pH以讓耐熱HN-AD菌一直保持著最佳效率。

2.3 不同溫度對耐熱HN-AD菌反硝化效率的影響

微生物的生長繁殖以及生命活動都與所處環(huán)境的溫度息息相關(guān)，具體表現(xiàn)為溫度會影響著微生物體內(nèi)的酶活性以及微生物細(xì)胞內(nèi)的各類蛋白質(zhì)物質(zhì)。過低的溫度會抑制微生物體內(nèi)的蛋白酶活性，導(dǎo)致微生物體內(nèi)的各項(xiàng)反應(yīng)變慢進(jìn)而影響到微生物的生長繁殖以及生命活動；而過高的溫度會對微生物體內(nèi)的蛋白酶及其蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)造成不可逆損傷，使微生物體內(nèi)的蛋白酶及其蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)變性，進(jìn)而導(dǎo)致微生物的死亡［6，10-11］。該研究目的是找尋出能在高溫污水中耐高溫的HN-AD菌，因此將所尋找到的菌株進(jìn)行高溫檢測并記錄其數(shù)據(jù)探討其耐熱性是否符合要求是十分有必要的。將硝酸鹽氮反硝化培養(yǎng)基加熱到設(shè)定溫度后，將OD600值為0.2的耐熱HN-AD菌接種至培養(yǎng)基中，并等待其冷卻到室溫后放入至恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每12 h取出部分培養(yǎng)基進(jìn)行硝酸根含量檢測，以鑒定菌株在硝酸鹽氮中的去除率。從圖10可以看出，S2-51菌株在不同的pH硝酸鹽氮培養(yǎng)基中各溫度去除率相差不大，在投入指定溫度的硝酸鹽氮培養(yǎng)基后其脫氮率并沒有過多減弱，其脫氮速度也只是前期與室溫處理菌株稍落后，后期其速度與室溫處理硝酸鹽氮幾乎沒有差別。

2.4 充足碳源下 HN-AD 菌硝酸鹽氮去除率

通過試驗(yàn)探尋出菌株反硝化的最佳pH為8.0，將pH 8.0的硝酸鹽氮培養(yǎng)基中丁二酸鈉從原培養(yǎng)基的8.5 g提升至17.0 g，模擬向污水中投入充足碳源的情況下研究S2-51菌株的硝酸鹽氮去

除率及其脫氮效率。將菌株分別接種至已升溫到30、40、50、60、70、80 ℃的培養(yǎng)基中，待其冷卻放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12 h測一次培養(yǎng)基中的硝酸根含量。如圖11所示，30、40、50、60、70、80 ℃的硝酸鹽氮去除率分別為95%、95%、93%、93%、93%和93%，表明在碳源充足的情況下，菌株經(jīng)過短暫的高溫后，硝酸鹽氮去除率有所下降，但其下降程度并不明顯，且仍能保持較高除氮效率。

3 結(jié)論與討論

該研究成功尋找到耐熱性較好的 HN-AD 菌株，經(jīng)過 16S rDNA 以及各項(xiàng)菌株生理生化特性研究試驗(yàn)，鑒定所篩選出的 HN-AD 菌為斯氏假單胞菌，后續(xù)將菌株接種至模擬污水環(huán)境的硝酸鹽氮培養(yǎng)基中，研究其在不充足碳源及充足碳源的情況下菌株的脫氮效率及硝酸鹽氮去除率。菌株不僅擁有著較為高效的脫氮效率以及較高的硝酸鹽氮去除率，還擁有著自我調(diào)節(jié)環(huán)境pH的能力，能在充足碳源的情況下調(diào)節(jié)至最佳氮降解的pH。

HN-AD 菌擁有著生長發(fā)育速度快、對極端環(huán)境耐受性強(qiáng)、數(shù)量種群龐大等優(yōu)點(diǎn)，但現(xiàn)今研究因 HN-AD 菌的多

樣性仍未真正地探尋出硝化/反硝化的本質(zhì)機(jī)理。目前大多數(shù)的 HN-AD 菌在試驗(yàn)中有著較高的脫氮效果，在實(shí)際應(yīng)用中卻因各種特殊情況表現(xiàn)欠佳。因此今后的研究重點(diǎn)可以集中在以下3個方面：①在各種環(huán)境中繼續(xù)分離出更多具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化功能的菌株，并研究其在不同環(huán)境中的生長發(fā)育和脫氮特性，加深異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株耐受極端環(huán)境的特性；②利用更多的研究手段去探尋檢測 HN-AD 菌的氮代謝途徑，補(bǔ)充對 HN-AD 菌氮代謝機(jī)理并探索其本質(zhì)氮代謝理論；③增加在實(shí)驗(yàn)室設(shè)定環(huán)境中對 HN-AD 菌的污水脫氮處理的研究，探尋其對污水的脫氮特性，并將其嘗試至實(shí)際應(yīng)用中記錄其數(shù)據(jù)，為日后規(guī)?；度胫廖鬯幚響?yīng)用提供理論支持。

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