［摘 要］PCR技術(shù)是基因工程中獲取和擴(kuò)增目的基因的常用方法之一，其中?？疾榈降闹R(shí)點(diǎn)有與引物相關(guān)的問題、酶切片段分析及變性、復(fù)性、延伸等環(huán)節(jié)的相關(guān)分析等。文章結(jié)合典型考題對(duì)這幾個(gè)問題進(jìn)行歸納分析。

［關(guān)鍵詞］基因工程；PCR技術(shù)；?？贾R(shí)點(diǎn)

［中圖分類號(hào)］??? G633.91??????? ［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］??? A??????? ［文章編號(hào)］??? 1674-6058（2024）14-0080-04

【名師簡(jiǎn)介】曾凡洪，中學(xué)高級(jí)教師，武漢市學(xué)科帶頭人，曾擔(dān)任高中生物奧賽主教練。先后在《生物學(xué)教學(xué)》《中學(xué)生物教學(xué)》《中學(xué)教學(xué)參考》《高中生學(xué)習(xí)》等報(bào)紙雜志上發(fā)表文章50余篇，并參與多本著作的編寫。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，其最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA，就能用PCR加以放大后進(jìn)行比對(duì)，這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。PCR的理論依據(jù)是DNA復(fù)制，一般的中學(xué)實(shí)驗(yàn)室很難具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和操作條件，因此對(duì)于這塊知識(shí)，基本上是以理論講解為主。目前的一些考題涉及的PCR知識(shí)已經(jīng)比較具體和深入了，具有一定的難度。本文結(jié)合典型考題對(duì)基因工程中PCR技術(shù)?？贾R(shí)點(diǎn)進(jìn)行歸納分析。

一、與引物相關(guān)的問題

引物是一小段單鏈DNA或RNA，是DNA復(fù)制的起始點(diǎn)。在引物的3＇—OH上，核苷酸以酯鍵形式進(jìn)行加成，因此引物的3＇—OH必須是游離的。引物分為兩種：存在于自然生物的DNA復(fù)制引物（RNA引物）和PCR中人工合成的引物（通常為DNA引物）。一般所說的引物是指DNA引物。PCR中的引物是人工合成的兩段寡脫氧核苷酸序列。

（一）設(shè)計(jì)引物的基本要求

根據(jù)DNA復(fù)制原理和引物的作用，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，要注意以下幾個(gè)基本問題。

1. 引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列

若引物自身存在互補(bǔ)序列，引物自身就會(huì)折疊成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。一般要求引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。

2.引物與引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列

兩個(gè)引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3＇端的互補(bǔ)重疊，以防止引物二聚體的形成。一般要求引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。

3.引物中G+C堿基應(yīng)占一定的比例

G+C堿基含量盡量控制在40%到60%之間，解鏈溫度（Tm值）最好貼近72 ℃，G+C堿基含量太低會(huì)導(dǎo)致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于增強(qiáng)PCR的特異性；G+C堿基含量太高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增。

4. 一對(duì)引物中G+C堿基占比最好基本相等

一對(duì)引物中G+C堿基占比基本相等可防止引物對(duì)在退火、延伸等環(huán)節(jié)反應(yīng)差別太大。

（二）帶有一個(gè)引物和帶有一對(duì)引物的比例問題（放射性DNA含量的比例分析）

在設(shè)計(jì)引物時(shí)，若用放射性同位素標(biāo)記，則產(chǎn)物中也會(huì)出現(xiàn)放射性，分為一條鏈帶有放射性和兩條鏈帶有放射性兩種情況，對(duì)應(yīng)的是產(chǎn)物帶有一個(gè)引物和帶有一對(duì)引物。

（三）兩條鏈等長(zhǎng)的DNA分子最先出現(xiàn)在第幾輪循環(huán)及所占的比例問題

引物結(jié)合到模板鏈上時(shí)，一般會(huì)從模板鏈的3＇端靠近內(nèi)側(cè)段結(jié)合上去，導(dǎo)致剛擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA分子兩條鏈不等長(zhǎng)。隨著擴(kuò)增輪數(shù)的增加，會(huì)逐漸出現(xiàn)兩條鏈等長(zhǎng)的DNA分子，且其比例會(huì)逐漸增加。

【典例1】（2011·江蘇，第33題節(jié)選）請(qǐng)回答基因工程方面的有關(guān)問題：

（1）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似（如圖1所示）。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。

①從理論上推測(cè)，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為???????????????????? 。

②在第????????????? 輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段。

圖1

解析：PCR擴(kuò)增（或DNA復(fù)制）時(shí)，一對(duì)引物分別結(jié)合到兩條模板鏈上，根據(jù)半保留復(fù)制的特點(diǎn)，只有1個(gè)DNA分子不含有引物A（含引物B），經(jīng)過四輪循環(huán)，產(chǎn)生24（16）個(gè)DNA分子，含有引物A的DNA片段有15個(gè)。

DNA分子復(fù)制時(shí)，每次只有用上一輪新形成的DNA單鏈為模板，所合成的DNA分子的長(zhǎng)度才會(huì)逐漸縮短，直到出現(xiàn)兩條鏈等長(zhǎng)的DNA分子為止。因此，可以用圖2來表示DNA復(fù)制的輪數(shù)與DNA分子長(zhǎng)度之間的關(guān)系：從上往下，上面的一條鏈?zhǔn)悄０彐?，下面的一條鏈?zhǔn)切潞铣傻淖渔?，下一輪?fù)制時(shí)始終是以下面這條鏈為模板所形成的DNA分子才是最短的，則經(jīng)過第三輪復(fù)制后，出現(xiàn)了兩條鏈等長(zhǎng)的DNA分子。且以一條鏈為模板時(shí)，到第三輪就會(huì)出現(xiàn)1個(gè)兩條鏈等長(zhǎng)的DNA分子，因此，一個(gè)DNA分子經(jīng)過第三輪循環(huán)后就會(huì)出現(xiàn)2個(gè)兩條鏈等長(zhǎng)的DNA分子，所占的比例為2/23=1/4。

圖2

答案：15/16??? 三

（四）需要的引物數(shù)與循環(huán)次數(shù)之間的關(guān)系

PCR擴(kuò)增過程中，循環(huán)了n次，則得到的DNA分子數(shù)為2n，脫氧核苷酸鏈數(shù)為2×2n，其中只有2條模板鏈不帶有引物，則循環(huán)n次時(shí)，所需要的引物數(shù)為2×2n-2。

（五）引物末端修飾問題

在基因工程中，有時(shí)為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加恰當(dāng)?shù)南拗泼盖悬c(diǎn)，或?yàn)榱孙@示目的基因所在位置、產(chǎn)生定向變異等，需要對(duì)引物進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?。引物?＇端決定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性；而引物的延伸是從3＇端開始的，該端不能進(jìn)行任何修飾。引物的5＇端修飾包括加酶切位點(diǎn)、加標(biāo)記熒光、引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列、引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列、引入啟動(dòng)子序列等。

【典例2】（2021·山東，第25題節(jié)選）人類γ基因啟動(dòng)子上游的調(diào)控序列中含有 BCL11A 蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合 BCL11A 蛋白后， γ基因的表達(dá)被抑制。通過改變?cè)摻Y(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對(duì)γ基因表達(dá)的抑制，可對(duì)某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療?？蒲腥藛T擴(kuò)增了γ基因上游不同長(zhǎng)度的片段，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測(cè)，以確定 BCL11A 蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信息如圖3所示。

圖3

（1）為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，需在引物末端添加限制酶識(shí)別序列。據(jù)圖3可知，在 F1～F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是?????????????? ，在 R 末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是?????????????? 。本實(shí)驗(yàn)中，從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過程共需要?????????????? 種酶。

解析：此題具有一定的難度，首先應(yīng)讀懂題意。要在熒光蛋白基因前面插入γ基因上游不同長(zhǎng)度的片段，并能使熒光蛋白表達(dá)，只能分別用MunⅠ和XhoⅠ來對(duì)熒光蛋白基因的前面部位進(jìn)行切割，且根據(jù)F1～F7片段表達(dá)的方向（左→右）和熒光蛋白基因表達(dá)的方向（右→左），只能F1～F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶與XhoⅠ產(chǎn)生的黏性末端相同，R末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶與MunⅠ產(chǎn)生的黏性末端相同，再根據(jù)圖3中提供的五種限制酶識(shí)別序列及切割位點(diǎn)可知，與XhoⅠ產(chǎn)生相同的黏性末端的限制酶只能是[SalⅠ，]與MunⅠ產(chǎn)生相同的黏性末端的限制酶只能是EcoRⅠ。從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過程需要Taq DNA聚合酶、限制酶[SalⅠ、][EcoRⅠ、][XhoⅠ、][MunⅠ、]DNA連接酶共6種酶參與。

答案：SalⅠ EcoRⅠ 6

（六）引物結(jié)合位置的確定問題

為了獲得符合要求的PCR產(chǎn)物，不僅要求引物設(shè)計(jì)合理，還應(yīng)考慮引物與模板鏈的結(jié)合部位的恰當(dāng)性。

【典例3】（2020·江蘇，第33題節(jié)選）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡(jiǎn)捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖4（以EcoRⅠ酶切為例）：

圖4

請(qǐng)據(jù)圖回答問題：

（3）若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是????????????????????????? （從引物①②③④中選擇，填編號(hào)）。

[????? DNA序列（虛線處省略了部分核苷酸序列）? 已知

序列?????? [5＇-AACTATGCGCTCATGA……GCAATGCGTAGCCTCT-3＇][3＇-TTGATACGCGAGTACT……CGTTACGCATCGGAGA-5＇]???? PCR

引物?????? ①5＇-AACTATGCGCTCATGA-3＇

②5＇-GCAATGCGTAGCCTCT-3＇

③5＇-AGAGGCTACGCATTGC-3＇

④5＇-TCATGAGCGCATAGTT-3＇??? ]

解析：此題難度較大，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，引物①②③④結(jié)合到已知序列上的位置及延伸方向如下表所示（“→”方向表示延伸方向）：

[????? DNA序列（虛線處省略了部分核苷酸序列）? 已知

序列?????? ????????????????????????????????????? ←④??????? ????????????????????????????????????←③

[5＇-AACTATGCGCTCATGA……GCAATGCGTAGCCTCT-3＇][3＇-TTGATACGCGAGTACT……CGTTACGCATCGGAGA-5＇

]

①→???????????????????????????????????????????? ②→

PCR

引物?????? ①5＇-AACTATGCGCTCATGA-3＇

②5＇-GCAATGCGTAGCCTCT-3＇

③5＇-AGAGGCTACGCATTGC-3＇

④5＇-TCATGAGCGCATAGTT-3＇??? ]

分別以①②③④為引物合成的片段F如圖5所示：

圖5

以①（或③）為引物合成的片段F經(jīng)DNA連接酶連接成的環(huán)狀DNA如圖6甲所示，以④（或②）為引物合成的片段F經(jīng)DNA連接酶連接成的環(huán)狀DNA如圖6乙所示。

甲???????? ?????????????????乙

圖6

圖6甲顯示以①（或③）為引物擴(kuò)增形成的環(huán)狀DNA的末端為未知序列，再次擴(kuò)增時(shí)，無法構(gòu)建與之互補(bǔ)配對(duì)的引物，因而無法擴(kuò)增出片段F的完整序列，而圖6乙顯示以④（或②）為引物擴(kuò)增形成的環(huán)狀DNA的起始端和末端均為已知序列，因此，可以根據(jù)已知序列來設(shè)計(jì)引物，從而擴(kuò)增出片段F的完整序列。

答案：②④

（七）目的基因的長(zhǎng)度控制

在PCR中，含有目的基因的片段的長(zhǎng)度，也是由引物與模板鏈結(jié)合的位置來決定的。引物分別從兩條模板鏈的3＇端結(jié)合上去，根據(jù)典例1解析中的圖示，擴(kuò)增到第三輪時(shí)出現(xiàn)了兩條鏈等長(zhǎng)的DNA片段，這也是最短的DNA片段。隨著循環(huán)次數(shù)的增加，這樣的DNA片段越來越多，當(dāng)循環(huán)次數(shù)較多時(shí)，最終只有2個(gè)DNA片段的兩條鏈不等長(zhǎng)，其余均為兩條鏈等長(zhǎng)的DNA片段，而兩條鏈等長(zhǎng)的DNA片段的每條鏈的5＇端分別為引物A和引物B，即此DNA片段的長(zhǎng)度是由一對(duì)引物與模板鏈結(jié)合的位置來決定的。

二、酶切片段分析

酶切片段分析涉及幾種不同的限制酶在切割質(zhì)粒時(shí)彼此之間相對(duì)位置的確定、酶切后所產(chǎn)生的片段長(zhǎng)度等。

【典例4】圖7是限制酶BamHⅠ與BglⅡ的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)示意圖；圖8表示質(zhì)粒pZHZ11（總長(zhǎng)為3.8 kb，1 kb=1000對(duì)堿基）的結(jié)構(gòu)，其中Apr為鏈霉素抗性基因；lacZ為藍(lán)色顯色基因（基因表達(dá)的產(chǎn)物將無色化合物X-gal轉(zhuǎn)化為一種藍(lán)色物質(zhì)，菌落呈藍(lán)色，否則為白色），請(qǐng)分析回答問題：

圖7???? ?????????????????????????????????圖8

（1）圖8中若將兩端分別用限制酶BamHⅠ和BglⅡ切開的單個(gè)目的基因片段置換pZHZ11中0.5 kb的BamHⅠ酶切片段，形成4.9 kb的重組質(zhì)粒，則目的基因的長(zhǎng)度為?????????????????? kb。

（2）上述4.9 kb的重組質(zhì)粒有兩種形式，若用BamHⅠ和EcoRⅠ聯(lián)合酶切其中一種，只能獲得1.6 kb和3.3 kb兩種DNA片段；那么用聯(lián)合酶切同等長(zhǎng)度的另一種重組質(zhì)粒，則可獲得????????????????? ?kb和?????????????????? kb兩種DNA片段。

解析：（1）質(zhì)粒pZHZ11的總長(zhǎng)為3.8 kb，將兩端分別用限制酶BamHⅠ和BglⅡ切開的單個(gè)目的基因片段置換pZHZ11中0.5 kb的BamHⅠ酶切片段，形成4.9 kb的重組質(zhì)粒，則目的基因的長(zhǎng)度=4.9 kb-（3.8 kb-0.5 kb）=1.6 kb。

（2）BamHⅠ酶切產(chǎn)生的黏性末端為[-G?????????? -CCTAG]和[GATCC-??????????? G-]，BglⅡ酶切產(chǎn)生的黏性末端為[-A?????? ????-TCTAG]和[GATCT-?????????? A-]，可見這兩種限制酶切割DNA分子后，產(chǎn)生的黏性末端是相同的，DNA連接酶能將它們切割產(chǎn)生的DNA片段連接起來，但在連接處形成的DNA片段為[-GGATCT--CCTAGA-]，它不能再被限制酶BamHⅠ和BglⅡ識(shí)別和切割了。因此，重組質(zhì)粒有兩種類型：一種是目的基因被BamHⅠ酶切產(chǎn)生的黏性末端與圖8質(zhì)粒pZHZ11上右側(cè)的BamHⅠ酶切產(chǎn)生的黏性末端相連接，另一種是目的基因被BamHⅠ酶切產(chǎn)生的黏性末端與圖8質(zhì)粒pZHZ11上左側(cè)的BamHⅠ酶切產(chǎn)生的黏性末端相連接，分別形成圖9和圖10兩種重組質(zhì)粒。

圖9

圖10

答案：（1）1.6 （2）1.7 3.2

三、變性、復(fù)性、延伸等環(huán)節(jié)的相關(guān)分析

PCR反應(yīng)過程的基本環(huán)節(jié)一般包括高溫變性（90～95 ℃）→低溫退火（復(fù)性）（55～60 ℃）→適溫延伸（70～75 ℃）。一般要經(jīng)歷30多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。

（一）變性與預(yù)變性的目的及要求

PCR在進(jìn)行循環(huán)之前，常常要進(jìn)行一次預(yù)變性。預(yù)變性一般為95 ℃ ，1～9 min；變性一般為95 ℃，20～30 s。變性的目的是促使模板DNA分子的兩條鏈打開成為兩條單鏈，而預(yù)變性的目的也是增加大分子模板DNA徹底變性的概率。那可否直接在高溫變性環(huán)節(jié)延長(zhǎng)時(shí)間呢？很明顯，不可以。如果在高溫變性環(huán)節(jié)時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致DNA聚合酶的活性降低甚至失活，而在預(yù)變性之后加入DNA聚合酶，然后再設(shè)置變性、復(fù)性、延伸的溫度、時(shí)間及循環(huán)次數(shù)，就可避免這種影響。

（二）復(fù)性（退火）的目的及要求

復(fù)性，又稱為退火，目的是當(dāng)溫度下降到55 ℃左右，使兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。復(fù)性一般為55～60 ℃ ，20～40 s。

（三）延伸的目的及要求

延伸是指溫度上升到70～75 ℃，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。延伸一般為72 ℃ ，5～15 min。很明顯，延伸環(huán)節(jié)是所有環(huán)節(jié)中用時(shí)最長(zhǎng)的，這樣可以讓DNA聚合酶有充分的時(shí)間來催化DNA的合成。延伸環(huán)節(jié)為何選用處于三個(gè)環(huán)節(jié)的中間溫度72 ℃左右呢？其一，DNA聚合酶為耐高溫的Taq DNA聚合酶，為了保證其活性，溫度不能過低；其二，高溫會(huì)導(dǎo)致引物與模板脫落，因此溫度不能過高。而PCR在最后一步，往往被設(shè)置成4 ℃，目的是讓DNA在從整個(gè)熱循環(huán)儀中取出來之前保持穩(wěn)定。

［?? 參?? 考?? 文?? 獻(xiàn)?? ］

［1］? 任志鴻.十年高考分類解析與應(yīng)試策略［M］.北京：知識(shí)出版社，2022.

［2］? 任志鴻.十年高考分類解析與應(yīng)試策略［M］.海南：南方出版社，2013.

［3］? 楊建雄.分子生物學(xué)［M］.北京：化學(xué)化工出版社，2009.

（責(zé)任編輯 羅 艷）