劉芹，孔維麗，崔筱，牛森園，師子文，吳杰，梁雪迪，劉陽

摘? ? 要：為揭示糙皮側(cè)耳原基發(fā)育的潛在調(diào)控物質(zhì)，采用代謝組學(xué)的方法對糙皮側(cè)耳菌絲體和原基細(xì)胞代謝物進(jìn)行檢測分析。結(jié)果表明，菌絲體與原基細(xì)胞的代謝物具有顯著差異。采用正交偏最小二乘判別分析（OPLS‐DA），以VIP（varible importance in the projection）≥1和倍數(shù)變化≥ 2或≤ 0.5為條件共篩選到400種差異代謝物。調(diào)控通路分析表明，這些差異物質(zhì)涉及33條代謝通路，其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、氨酰tRNA生物合成、嘌呤代謝等8條代謝通路具有極顯著影響。谷氨酸和谷氨酰胺涉及p < 0.01的大部分代謝通路，可能在糙皮側(cè)耳原基發(fā)育過程中具有重要調(diào)控作用。研究結(jié)果為糙皮側(cè)耳以及其他大型真菌原基發(fā)育機(jī)制的探索提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：糙皮側(cè)耳；原基發(fā)育；代謝組學(xué)；差異代謝物；代謝通路

中圖分類號： S646.1+41 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）06-052-09

Analysis of associated substances and metabolic pathways involved in primordium development of Pleurotus ostreatus

LIU Qin1， KONG Weili1， CUI Xiao1， NIU Senyuan2， SHI Ziwen3， WU Jie3， LIANG Xuedi3， LIU Yang2

（1. Institute of Edible Fungi， Henan Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Evaluation and Utilization of Edible Fungi Germplasm Resources in Huang-Huai-Hai Region， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. College of Life Science and Technology， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan， China; 3. College of Life Sciences， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： In order to reveal the potential regulatory substances involved in primordium development of Pleurotus ostreatus， the metabolomics was used to detected the cellular metabolites in mycelium and primordium. The results showed that there were significant differences between the cellular metabolites in mycelium and primordium. A total of 400 differential metabolites were screened under the condition of VIP（varible importance in the projection）≥1 and fold change≥2 or ≤0.5 using orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA）. According to pathway analysis， these differential substances might involve 33 metabolic pathways， among which 8 metabolic pathways， including alanine， aspartate and glutamate， aminoacyl tRNA biosynthesis and purine metabolism， had extremely significant effects. Glutamate and glutamine involved in most of the metabolic pathways with p< 0.01， therefore they might play an important regulatory role in primordium development of P. ostreatus. This study provides a theoretical basis for exploring the development mechanism of P. ostreatus and other macrofungus.

Key words： Pleurotus ostreatus; Primordium development; Metabolomics; Differential metabolite; Metabolic pathways

大型真菌因其獨(dú)特的香氣、風(fēng)味、質(zhì)地和藥用特性而廣受消費(fèi)者喜愛[1]。目前，世界上可食用的大型真菌有近2000種，因?yàn)榉Q之為食用菌，其中有不少于35種已經(jīng)實(shí)現(xiàn)在全球范圍內(nèi)大規(guī)模種植[2]。糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）是世界上最廣泛種植和消費(fèi)的食用菌之一，具有栽培技術(shù)簡單、栽培原料來源廣泛的優(yōu)點(diǎn)[3]。糙皮側(cè)耳可將農(nóng)業(yè)廢棄物轉(zhuǎn)化為高營養(yǎng)價值的食品，能有效提高種植者的收益[4]。此外，糙皮側(cè)耳含有大量的多糖（β-葡聚糖）、膳食纖維、不飽和脂肪酸、多肽、糖蛋白和抗氧化化合物，也是鈉、鉀、鈣、鎂、磷等礦物質(zhì)和維生素的重要來源[5]。研究表明，糙皮側(cè)耳還具有顯著的抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等活性，深受消費(fèi)者青睞[6-8]。

糙皮側(cè)耳的生長發(fā)育一般分為兩個階段：第一階段為營養(yǎng)生長階段，從接種直至菌絲生理成熟；第二階段為生殖生長階段，即子實(shí)體發(fā)生和發(fā)育階段，從原基形成到子實(shí)體成熟[9]。食用菌原基發(fā)生是子實(shí)體形成和產(chǎn)量效益的前提和基礎(chǔ)，目前對食用菌的研究主要集中在營養(yǎng)生理、風(fēng)味物質(zhì)以及功能物質(zhì)方面，對原基發(fā)生和發(fā)育的研究非常有限[9-11]。陳鵬至等[12]研究表明，富馬酸、琥珀酸、6-磷酸葡萄糖酸、甜菜堿等13種僅在原基中檢測到的小分子物質(zhì)可能對亞洲蘭茂牛肝菌（Lanmaoa asiatica）原基的發(fā)育具有至關(guān)重要的作用。楊曉敏等[13]采用核磁共振、氣相質(zhì)譜和液相質(zhì)譜3種檢測技術(shù)對亞洲蘭茂牛肝菌的菌絲體及原基的小分子物質(zhì)進(jìn)行比較分析，推測谷氨酸在原基發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用。李玉等[14]研究表明，茉莉酸甲酯可促進(jìn)金針菇原基的形成。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后迅速發(fā)展起來的一門新學(xué)科[15]，旨在檢測特定條件下有機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性代謝物的整體軌跡，以反映生物體的病理或生理過程，而檢測到的一些差異代謝物已成為表征生物體病理或生理狀態(tài)的潛在標(biāo)記物[16]。代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、藥物開發(fā)、微生物代謝、動植物代謝等多個領(lǐng)域[17-19]。近年來，代謝組學(xué)技術(shù)逐漸應(yīng)用于食用菌領(lǐng)域，研究食用菌在特定環(huán)境條件下的代謝機(jī)制。Zhao等[20]基于GC–MS非靶向和靶向代謝組分析鑒定了高溫脅迫下香菇菌絲代謝組的變化

2.4 差異代謝物篩選

采取將Fold change、OPLS-DA模型的VIP值相結(jié)合的方法來篩選具有差異性表達(dá)的代謝物，篩選標(biāo)準(zhǔn)為VIP ≥ 1和Fold change ≥2 或≤ 0.05。共篩選出400種差異代謝物，差異代謝物占總代謝物的74.91%，說明菌絲體組和原基組代謝物質(zhì)差異顯著。其中氨基酸及其衍生物80種、酚酸類33種、核苷酸及其衍生物46種、木脂素和香豆素3種、其他類46種、鞣質(zhì)1種、生物堿43種、有機(jī)酸63種和脂質(zhì)85種（圖5-a）。原基組和菌絲體組相比，顯著上調(diào)的代謝物有310種，顯著下調(diào)的有90種（圖5-b）。對篩選到的差異代謝物的差異倍數(shù)進(jìn)行l(wèi)og2處理，變化最顯著的20種（上調(diào)和下調(diào)）差異代謝物見圖5-c。與M組相比，P組中的4-乙酰氨基丁酸、葡萄糖-1-磷酸、9-（阿拉伯糖基）次黃嘌呤、2-脫氧核糖-1-磷酸、L-蘇氨酸、L-高絲氨酸、L-絲氨酸、環(huán)亮氨酸、L-天冬酰胺和溶血磷脂酰膽堿18∶3（2n異構(gòu)）等物質(zhì)含量顯著增加。而15（R）-羥基亞油酸、1-甲基胍、2-氧代己二酸、丁香醛；4-羥基-3，5-二甲氧基苯甲醛、3-異戊烯基-4-O-葡萄糖氧基-4-羥基苯甲酸、水楊酸、松柏苷、7，8-二羥基-9，12-十八碳二烯酸、9-氨基吡啶并（1，2-a）吲哚6，10-二酮和鳥苷 3'，5'-環(huán)單磷酸等物質(zhì)含量顯著降低。

2.5 差異代謝物調(diào)控通路及富集分析

基于影響值大于0對關(guān)鍵代謝途徑進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖6所示，共得到33條關(guān)鍵代謝通路，其中影響值大于0.3的通路有13條，分別為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，半乳糖代謝，嘧啶代謝，丁酸代謝，精氨酸生物合成，淀粉和蔗糖代謝，三羧酸循環(huán)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，嘌呤代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，賴氨酸生物合成，煙酸和煙酰胺代謝。

對p< 0.01的代謝通路進(jìn)行分析并繪制氣泡圖（圖7），共顯示8條代謝通路，分別為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，氨酰tRNA生物合成，嘌呤代謝，賴氨酸生物合成，三羧酸循環(huán)，乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，以及精氨酸生物合成。利用KEGG等權(quán)威物質(zhì)數(shù)據(jù)庫映射，得到通路所涉及的差異物質(zhì)有54個。具有顯著差異的8條代謝通路和54個物質(zhì)的富集關(guān)系見圖8，所涉及的代謝通路主要為氨基酸調(diào)控通路，其中谷氨酸、谷氨酰胺參與了大部分通路，說明兩者在連接各通路上具有重要作用（圖9）。

3 討論與結(jié)論

筆者利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對糙皮側(cè)耳菌絲體和原基的細(xì)胞代謝產(chǎn)物的差異進(jìn)行分析，共檢測出534種物質(zhì)，通過PCA和OPLS‐DA圖可以看出菌絲體和原基樣品之間的代謝物具有明顯差異。以VIP ≥ 1和倍數(shù)變化≥2 或≤ 0.05為條件進(jìn)行篩選，兩組間的差異代謝物共有400種，其中含量上調(diào)的差異代謝物有310種，含量下調(diào)的差異代謝物有90種，這些差異代謝物，尤其是極顯著上調(diào)、下調(diào)物質(zhì)如4-乙酰氨基丁酸、葡萄糖-1-磷酸、9-（阿拉伯糖基）次黃嘌呤、9-氨基吡啶并（1，2-a）吲哚6，10-二酮和鳥苷3'，5'-環(huán)單磷酸等可能對原基發(fā)育起潛在的調(diào)控作用。

對差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析，影響值大于0的代謝通路有33條，其中影響最大的有8條，分別為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，氨酰tRNA生物合成，嘌呤代謝，賴氨酸生物合成，三羧酸（TCA）循環(huán)，乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝，精氨酸和脯氨酸代謝以及精氨酸生物合成。在所有代謝通路中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝影響值最大，其中谷氨酸和谷氨酰胺參與了大部分通路，說明這些物質(zhì)可能對糙皮側(cè)耳原基發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。該研究結(jié)果與楊曉敏等[13]的研究結(jié)果一致，谷氨酸是連接各氨基酸通路的關(guān)鍵物質(zhì)，可促進(jìn)蘭茂牛肝菌原基的萌發(fā)與生長。谷氨酸在生物生長、發(fā)育以及響應(yīng)和適應(yīng)環(huán)境脅迫中具有重要作用[25]。谷氨酸、谷氨酰胺和草酰乙酸之間的轉(zhuǎn)化可以將其代謝與TCA循環(huán)、碳代謝以及能量合成聯(lián)系在一起[13]。在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑中，谷氨酸和谷氨酰胺可以通過天冬氨酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，也可以通過丙氨酸、丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，作為碳骨架的來源進(jìn)入TCA循環(huán)。TCA循環(huán)是生物體內(nèi)連接糖、氨基酸和脂類物質(zhì)最重要的核心代謝途徑之一，谷氨酸和谷氨酰胺可以通過TCA循環(huán)為原基生長發(fā)育提供所需的能量和營養(yǎng)物質(zhì)[26]。谷氨酸和谷氨酰胺還可作為生物體內(nèi)氨基酸以及其他含氮物質(zhì)生物合成的重要N供體。谷氨酸的碳骨架和α-氨基是γ-氨基丁酸、精氨酸和脯氨酸的合成基礎(chǔ)[27]。谷氨酸通過精氨酸生物合成途徑生成鳥氨酸、瓜氨酸以及精氨酸；精氨酸又可分解為尿素和鳥氨酸，鳥氨酸經(jīng)腐胺又生成谷氨酸，完成氮代謝，為原基的生長發(fā)育提供氮源。谷氨酸和谷氨酰胺可以通過谷氨酸激酶，生成谷氨酸半醛，進(jìn)而生成脯氨酸。脯氨酸積累可穩(wěn)定大分子化合物，在生物體組織分化和發(fā)育中發(fā)揮作用。谷氨酸和谷氨酰胺是細(xì)胞轉(zhuǎn)氨化反應(yīng)的主要氨基酸供體[28]。此外，谷氨酸還在微生物脂質(zhì)合成調(diào)控中起重要作用[29]。谷氨酸還是四吡咯、谷胱甘肽和葉酸等物質(zhì)合成的前提和基礎(chǔ)[13]。因此，谷氨酸及谷氨酰胺對糙皮側(cè)耳原基發(fā)育的調(diào)控作用及其機(jī)制值得關(guān)注及深入研究。

綜上所述，筆者采用代謝組學(xué)方法分析了糙皮側(cè)耳菌絲體及原基中細(xì)胞代謝產(chǎn)物的差異，推測谷氨酸和谷氨酰胺可能對糙皮側(cè)耳原基發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。下一步可在培養(yǎng)基中添加不同濃度的谷氨酸/谷氨酰胺以及相關(guān)抑制劑對其功能和作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

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