徐源 刁婷婷 楊立軍 毋尚楓 王琳

摘要 ［目的］以艾葉為研究對(duì)象，探索艾葉多酚的最佳提取工藝及其抗氧化活性。［方法］采用單因素試驗(yàn)分別考察乙醇濃度、液料比、超聲提取時(shí)間對(duì)艾葉多酚提取量的影響，通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化其提取工藝，并以清除DPPH自由基和羥基自由基的能力評(píng)價(jià)艾葉多酚的抗氧化活性。［結(jié)果］艾葉多酚最佳提取工藝為乙醇濃度77%、液料比24∶1（mL∶g）、提取時(shí)間53 min，此時(shí)艾葉多酚提取量為41.31 mg/g?？寡趸钚苑治霰砻靼~多酚有較好的抗氧化能力，對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的半抑制濃度（IC50）分別為0.050 4和0.031 1 mg/mL。［結(jié)論］采用超聲輔助法，在最佳提取工藝條件下艾葉多酚提取量達(dá)到41.31 mg/g，該條件下提取的艾葉多酚有良好的抗氧化性，該方法提取簡(jiǎn)單、易操作、得率高。

關(guān)鍵詞 艾葉多酚；單因素試驗(yàn)；響應(yīng)面法；提取工藝優(yōu)化；抗氧化活性

中圖分類號(hào) R284? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2024）11-0154-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.11.033

Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activity of Polyphenols from Artemisia argyi

XU Yuan，DIAO Ting-ting，YANG Li-jun et al

（Xinyang Agriculture and Forestry University，Xinyang，Henan 464000）

Abstract ［Objective］Taking Artemisia argyi leaves as the research object，in order to explore the optimal extraction process and antioxidant activities of polyphenols from Artemisia argyi.［Method］Single-factor test was used to investigate the influence of ethanol concentration，liquid-material ratio and ultrasonic extraction time on the extraction amount of Artemisia argyi polyphenols.On this basis，the extraction process was optimized by Box-Behnken response surface analysis，and the antioxidant activity of polyphenols was evaluated by the ability to remove DPPH free radicals and hydroxyl radicals.［Result］The optimal process was 77% ethanol concentration，material-liquid ratio 24∶1 （mL∶g） and the extraction time 53 min.Under the above conditions，the extraction amount of polyphenols was 41.31 mg/g.Antioxidant activity analysis showed that polyphenols had good antioxidant ability.The semi-inhibition concentrations （IC50） of DPPH free radicals and hydroxyl radicals were 0.050 4 and 0.031 1 mg/mL respectively.［Conclusion］Using ultrasound assisted method，the extraction amount of Artemisia argyi polyphenols reached 41.31 mg/g under the optimal extraction process conditions.The extracted Artemisia argyi polyphenols under these conditions had good antioxidant properties.This method was simple，easy to operate and had a high yield.

Key words Artemisia argyi polyphenols;Single factor test;Response surface method;Optimization of extraction process;Antioxidant activity

基金項(xiàng)目 信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院青年基金項(xiàng)目（QN2022023）。

作者簡(jiǎn)介 徐源（1988—），女，河南信陽(yáng)人，助教，碩士，從事天然產(chǎn)物開發(fā)與研究工作。*通信作者，講師，博士，從事有機(jī)合成方面研究。

收稿日期 2023-08-03；修回日期 2023-09-05

艾葉（Folium artemisiae argyi）為菊科植物艾草的干燥葉［1］。現(xiàn)代藥理研究表明，艾葉具有抗菌、抗氧化、抗病毒等功效［2-5］，主要含有多糖、黃酮類、酚類、桉葉烷等藥理活性的化合物，其中艾葉多酚可有效清除體內(nèi)的氧自由基、延緩衰老，也可修復(fù)細(xì)胞等，另外它在抗病毒［6］、抗氧化［7］、抗菌［8-9］及降血脂［10］方面也具有顯著效果。因此艾葉多酚的分離、提取工藝引起大家的關(guān)注。植物多酚常見的提取方法主要有浸泡法、超聲輔助法、微波輔助法、超臨界流體萃取法、超聲輔助乙醇提取法等［11-12］。超聲波輔助法通過(guò)機(jī)械波的空化效應(yīng)加速目標(biāo)物質(zhì)溶出而提高提取效率，而乙醇可以降低提取液的極性，使其更容易破壞艾葉中多酚類物質(zhì)與多糖或蛋白質(zhì)等物質(zhì)之間的氫鍵，從而使艾葉中的多酚更容易溶出，因此此次試驗(yàn)將兩者結(jié)合，采取超聲波輔助乙醇提取法對(duì)艾葉多酚進(jìn)行探究。多酚提取及相關(guān)健康產(chǎn)品的開發(fā)利用成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，而艾葉多酚提取工藝鮮有報(bào)道，筆者利用超聲輔助乙醇提取法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面法分析液料比、提取時(shí)間和乙醇濃度對(duì)艾葉多酚提取量的影響，優(yōu)化艾葉多酚的提取工藝，并在最佳提取條件下研究艾葉多酚的抗氧化活性，為艾葉多酚的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，為艾葉資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材與試劑 艾葉，購(gòu)自南陽(yáng)老艾嶺股份集團(tuán)有限公司。沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；硫酸亞鐵，購(gòu)自天津市達(dá)茂化學(xué)試劑有限公司；福林酚試劑，購(gòu)自上海藍(lán)季生物有限公司；無(wú)水碳酸鈉（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）、水楊酸（分析純）、維生素C（分析純）、H2O2（分析純），購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），購(gòu)自福州飛興生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；恒溫水浴鍋，浙江聚能儀器設(shè)備有限公司；超聲波提取儀，長(zhǎng)沙明杰儀器有限公司；高速粉碎機(jī)-6202型，河南立鑫機(jī)械設(shè)備有限公司；高速離心機(jī)，南京伊若達(dá)儀器有限公司；雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵，南京嘉美倫科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 沒(méi)食子酸標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液的制備。

根據(jù)龍小妹等［13］的方法，首先配制0.11 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液以待備用，然后通過(guò)沒(méi)食子酸-福林酚-Na2CO3測(cè)定，在波長(zhǎng)760 nm處測(cè)其吸光度，以濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=99.87X+0.005（R2=0.999 6），表明沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品在1～5 μg/mL線性關(guān)系良好。

1.3.2 艾葉多酚

提取率的測(cè)定。將艾葉干燥粉碎后，稱取1.0 g艾葉粉末，以乙醇為提取溶劑，按一定液料比、提取時(shí)間、乙醇濃度進(jìn)行超聲提?。?4］，取其濾液，以7 000 r/min 離心5 min，取上清液，先稀釋50倍，再用移液管移取0.5 mL樣液于25 mL棕色容量瓶，隨后滴加福林酚試劑0.5 mL、20% Na2CO3溶液1.5 mL，補(bǔ)蒸餾水定容，搖勻后靜置30 min，在760 nm處測(cè)其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度，然后根據(jù)以下公式計(jì)算艾葉多酚提取率（Y）［15］：

Y（mg/g）=CNVm×10-3

式中：C為待測(cè)液濃度（mg/mL）;V為樣品液體積（mL）;N為總稀釋倍數(shù)；m為艾葉質(zhì)量（g）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在研究提取時(shí)間梯度（20、35、50、65、80 min）時(shí)，設(shè)定液料比為15∶1（mL∶g），乙醇濃度為60%；在研究液料比梯度（15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1）時(shí)，設(shè)定時(shí)間為40 min，乙醇濃度為60%；在研究乙醇濃度梯度（60%、65%、70%、75%、80%）時(shí)，設(shè)置提取時(shí)間為40 min，液料比為15∶1;分別考察液料比、提取時(shí)間、乙醇濃度對(duì)艾葉多酚含量的影響，并計(jì)算多酚的提取量，以期得到各單因素梯度下艾葉多酚提取的最佳條件。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

依照單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken原理，通過(guò)Design-Expert 13.0軟件，選取提取時(shí)間（A）、液料比（B）、乙醇濃度（C）3個(gè)因素，設(shè)計(jì)出3因素3水平共17組試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化組合，試驗(yàn)因素和水平見表1，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得到艾葉多酚最佳提取工藝數(shù)據(jù)，并在最優(yōu)工藝條件下，計(jì)算艾葉多酚的提取量。

1.3.5 艾葉多酚抗氧化活性分析。

1.3.5.1 清除DPPH自由基的能力。

參考張洋洋等［16］清除DPPH自由基能力的方法，吸取2 mL DPPH溶液和2 mL不同濃度的樣液于試管中，用蒸餾水作對(duì)照，在517 nm處測(cè)吸光度A0。將DPPH替換成體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液，其他試劑和試驗(yàn)條件不變，測(cè)量此時(shí)的吸光度A1；同法，將樣品液替換成75%乙醇溶液，測(cè)得吸光度A2。再以與艾葉多酚提取液相同濃度的VC溶液替換樣液，同法進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算VC對(duì)DPPH自由基的清除率，以此作為參照。DPPH自由基的清除率公式如下：

清除率=A2-A0+A1A2×100%

1.3.5.2 清除羥基自由基的能力。

參考王艷英等［17］清除羥基自由基能力的方法，吸取6 mmol/L FeSO4溶液2 mL、不同濃度的艾葉多酚提取液1 mL和H2O2 2 mL于試管內(nèi)，10 min后加入6 mmol/L水楊酸溶液2 mL，在517 nm處測(cè)得吸光度A1。同法，將不同濃度的艾葉多酚提取液替換成蒸餾水，測(cè)量此時(shí)的吸光度，記為A0；同樣，將水楊酸替換成蒸餾水，測(cè)得吸光度A2。再配制與艾葉多酚提取液相同濃度梯度的VC溶液來(lái)替換艾葉多酚提取液，同法，計(jì)算VC對(duì)羥基自由基的清除率。羥基自由基的清除率公式如下：

清除率=A0-A1+A2A0×100%

1.4 數(shù)據(jù)處理

將單因素試驗(yàn)結(jié)果和抗氧化活性結(jié)果進(jìn)行整理分析。采取Design-Expert 13.0軟件繪制響應(yīng)面圖進(jìn)一步分析，并優(yōu)化提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)艾葉多酚提取量的影響。

由圖1可知，在50 min前，艾葉多酚提取量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增加后減少趨勢(shì)。這是因?yàn)樘崛r(shí)間越長(zhǎng)，會(huì)有更多的多酚溶出。在50 min時(shí)，大部分多酚已經(jīng)基本溶出，而繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，則會(huì)使艾葉多酚在機(jī)械波作用下逐步被氧化或結(jié)構(gòu)被破壞，致使提取量減少［18］。因此艾葉多酚最佳的提取時(shí)間為50 min。

2.1.2 液料比對(duì)艾葉多酚提取量的影響。

由圖2可知，隨著液料比增加，艾葉多酚提取量呈先增加后減少趨勢(shì)。當(dāng)液料比為25∶1 時(shí)，多酚提取量達(dá)到最高，此時(shí)艾葉多酚提取量為37.48 mg/g。這是因?yàn)橄噍^于艾葉粉末來(lái)講，隨著液料比的增加，提取液體積變大，艾葉粉末與提取液的接觸概率增加，使艾葉粉末中的多酚更容易溶出，因此艾葉多酚的溶出量增加。當(dāng)液料比超過(guò)25∶1 時(shí)，艾葉中的多酚已經(jīng)基本溶出。隨著液料比的增加，提取液體積增加，操作時(shí)可能會(huì)有更多的多酚發(fā)生損耗［19］。因此最佳的液料比為25∶1。

2.1.3 乙醇濃度對(duì)艾葉多酚提取量的影響。

由圖3可知，在乙醇濃度小于75%，隨著乙醇濃度增加，艾葉多酚提取量呈先增加后減少趨勢(shì)。根據(jù)相似相溶的原理，相較于水，多酚更容易溶于乙醇。而乙醇溶液濃度不斷提升，艾葉中多酚更容易溶出。當(dāng)乙醇濃度超過(guò)75%時(shí)，艾葉中其他物質(zhì)也會(huì)溶解出來(lái)，與多酚溶出相拮抗，使艾葉多酚提取量減少。因此乙醇最優(yōu)濃度為75%。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。該試驗(yàn)以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，建立了3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，根據(jù)Box-Behnken原理并利用Design-Expert 13.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果分析，見表2。數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果見表3。

通過(guò)Design-Expert 13.0軟件對(duì)表2進(jìn)行擬合分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：

Y（mg/g）=41.22+0.461 3A-1.610 0B+0.626 0C-1.400 0AB+0.532 5AC-1.100 0BC-2.54A2-6.01B2-2.51C2

響應(yīng)面模型的方差分析見表3。由表3可知，回歸模型P<0.000 1，達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.100 1，不顯著，表明擬合程度較好，模型契合，準(zhǔn)確可靠［20］；模型的決定系數(shù)R2=0.996 6，表明該模型擬合度良好；校正決定系數(shù)R2adj=0.992 3，兩者數(shù)值相差較小，表明約99.66%的響應(yīng)值（Y）變化可以用該模型解釋。結(jié)果顯示，各因素對(duì)艾葉多酚提取量的影響由大到小依次為液料比（B）＞乙醇濃度（C）＞提取時(shí)間（A），通過(guò)對(duì)表3中P值的分析可得出，一次項(xiàng)B，交互項(xiàng)AB、BC，二次項(xiàng)A2、B2、C2的影響極顯著（P<0.001）；AC的P值＜0.05，影響顯著。綜上分析，該模型能正確反映提取因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，模型契合。

根據(jù)響應(yīng)面數(shù)據(jù)模擬結(jié)果，繪制三維響應(yīng)面圖和等高線圖，如圖4所示。通過(guò)比較響應(yīng)面和等高線圖發(fā)現(xiàn)，3D響應(yīng)面圖呈現(xiàn)凸起峰值，峰值與最低處的趨勢(shì)越陡峭，此因素對(duì)響應(yīng)面影響越大，表明該交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響越大，2D等高線圖呈橢圓狀且分布集中時(shí)，則說(shuō)明2個(gè)單因素交互作用達(dá)到顯著。由圖4可知，響應(yīng)面陡峭順序?yàn)锳B＞BC＞AC，提取時(shí)間（A）和液料比（B）的交互作用極顯著、液料比（B）和乙醇濃度（C）的交互作用顯著，提取時(shí)間（A）和乙醇濃度（C）的交互作用的影響最低，3個(gè)單因素的交互作用與方差分析結(jié)果（表3）一致。

2.2.2 最佳工藝條件驗(yàn)證。

采用Design-Expert 13.0軟件對(duì)所建模型進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，得出艾葉多酚的最佳提取工藝條件為提取時(shí)間52.87 min，液料比23.94∶1、乙醇濃度76.67%，此時(shí)艾葉多酚提取量的理論值為41.38 mg/g。根據(jù)實(shí)際操作設(shè)定提取條件為提取時(shí)間53 min，液料比24∶1、乙醇濃度77%，按照此工藝進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得艾葉多酚平均提取量為41.31 mg/g，與理論結(jié)果接近，表明此模型準(zhǔn)確可靠，可以作為提取工藝優(yōu)化的模型依據(jù)。

2.3 艾葉多酚抗氧化活性分析

2.3.1 清除DPPH自由基的能力。由圖5可知，當(dāng)艾葉多酚提取液濃度越大，清除率越高。在多酚濃度達(dá)到0.10 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率為82.27%，而VC的清除率為89.17%，相差并不大。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理得到艾葉多酚對(duì)DPPH自由基的半抑制濃度（IC50）為0.050 4 mg/mL，表明艾葉多酚有良好的抗氧化能力。

2.3.2 清除羥基自由基的能力。

由圖6可知，隨著艾葉多酚提取液濃度增加，羥基自由基清除率也隨之增加，具有較為明顯的量效關(guān)系，并且清除率與VC逐漸接近，在濃度為1.00 mg/mL時(shí)對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到了92.04%，略低于VC的清除率（93.06%）。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理得到艾葉多酚對(duì)羥基自由基的半抑制濃度（IC50）為0.031 1 mg/mL，表明艾葉多酚對(duì)羥基自由基有良好的清除能力。

3 結(jié)論

該研究主要對(duì)艾葉中有效成分多酚進(jìn)行研究，對(duì)艾葉多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以多酚提取量為考察指標(biāo)，分別考察了液料比、提取時(shí)間、乙醇濃度對(duì)多酚提取量的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken原理，通過(guò)Design-Expert 13.0軟件對(duì)單因素進(jìn)行優(yōu)化組合，結(jié)果表明，提取時(shí)間、液料比和乙醇濃度這3個(gè)因素對(duì)艾葉多酚提取量的影響順序?yàn)橐毫媳龋疽掖紳舛龋咎崛r(shí)間，艾葉多酚的最佳提取工藝為提取時(shí)間53 min、液料比24∶1（mL∶g）、乙醇濃度77%，在此工藝條件下，艾葉多酚提取量為41.31 mg/g。通過(guò)VC作對(duì)照，以DPPH自由基和羥基自由基的清除率作為評(píng)定，其對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的IC50分別為0.050 4和0.031 1 mg/mL，可見艾葉多

酚具有較好的抗氧化活性，可以作為天然的抗氧化劑來(lái)源。

該研究通過(guò)優(yōu)化艾葉多酚提取工藝來(lái)提高多酚得率，并分析了艾葉多酚抗氧化活性，這可以為艾葉及相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)一步的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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