羅皓 付偉陽 曹敏 孫在興 何昌偉 李玉鋒

摘要：從四川傳統(tǒng)臘肉中分離出14株乳酸菌菌株，其中7株可高效降解亞硝酸鹽；對(duì)比其發(fā)酵特性，選取TrLb-4為目標(biāo)菌株，經(jīng)16S rDNA鑒定該菌株為短乳桿菌；通過分析接種短乳桿菌后臘肉的pH值、過氧化值、TBARS值、亞硝酸鹽殘留量、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成，探究其對(duì)臘肉品質(zhì)和安全性的影響。結(jié)果表明，接種短乳桿菌后臘肉的pH值有所降低；試驗(yàn)組的亞硝酸鹽殘留量顯著減少，僅為7%（P<0.05）；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析結(jié)果顯示：試驗(yàn)組共檢出53種風(fēng)味物質(zhì)，與對(duì)照組主體風(fēng)味成分存在差異，醛類物質(zhì)占比降低，醇類、酯類和酮類物質(zhì)占比有所增加。綜合分析可得，菌株TrLb-4可以有效降解亞硝酸鹽，抑制臘肉的脂肪氧化，促進(jìn)特征風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，對(duì)改善臘肉的品質(zhì)、提高臘肉的食用安全性有顯著作用。

關(guān)鍵詞：臘肉；亞硝酸鹽；乳酸菌；風(fēng)味物質(zhì)

中圖分類號(hào)：TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-9973（2024）06-0091-06

Screening of Lactic Acid Bacteria for Efficient Degradation of

Nitrite and Their Application in Bacon

LUO Hao， FU Wei-yang， CAO Min， SUN Zai-xing， HE Chang-wei， LI Yu-feng^*

（School of Food and Bioengineering， Xihua University， Chengdu 610039， China）

Abstract： Fourteen strains of lactic acid bacteria are isolated from traditional Sichuan bacon， among which， 7 strains can efficiently degrade nitrite. Through comparing their fermentation characteristics， TrLb-4 is selected as the target strain， which is identified as Lactobacillus brevis by 16S rDNA. By analyzing the pH value， peroxide value， TBARS value， residual amount of nitrite and volatile flavor substance composition of bacon after inoculation with Lactobacillus brevis， its effects on the quality and safety of bacon are explored. The results show that the pH value of bacon decreases after inoculation with Lactobacillus brevis. The residual amount of nitrite in the experimental group significantly decreases， which is only 7% （P<0.05）. The analysis results of gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） show that a total of 53 flavor substances are detected in the experimental group， which are different from the main flavor components in the control group.The proportion of aldehydes decreases， while the proportion of alcohols， esters and ketones increases. Through comprehensive analysis， it can be concluded that strain TrLb-4 can effectively degrade nitrite， inhibit fat oxidation of bacon， and promote the production of characteristic flavor substances， which has a significant effect on improving the quality and edible safety of bacon.

Key words： bacon; nitrite; lactic acid bacteria; flavor substances

收稿日期：2024-01-12

基金項(xiàng)目：四川省科技廳重大項(xiàng)目成果轉(zhuǎn)化（17NZZH0026）

作者簡介：羅皓（1998—），男，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

*通信作者：李玉鋒（1965—），男，教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。

四川臘肉作為傳統(tǒng)腌制類制品，主要以滋味咸香、色澤鮮亮為特點(diǎn)。為了提升臘肉的品質(zhì)，多采用工業(yè)化生產(chǎn)，亞硝酸鹽作為工業(yè)化生產(chǎn)常用的食品添加劑，可以在腌制過程中促進(jìn)脂質(zhì)氧化，提高醛類物質(zhì)的積累，從而帶來特有的腌制風(fēng)味；同時(shí)可以很好地抑制肉毒梭狀芽孢桿菌的生長^[1]。然而長期攝入亞硝酸鹽存在安全隱患，甚至?xí)l(fā)癌癥^[2]。由于亞硝酸鹽在肉制品發(fā)酵中作用較大，目前難以被替代。因此，控制臘肉中亞硝酸鹽的殘留量十分重要。

目前降解亞硝酸鹽的方法主要分為3種：物理降解法、化學(xué)降解法、生物降解法。研究指出，乳酸菌接種發(fā)酵可以有效降低泡菜中的亞硝酸鹽含量^[3]。張慶芳等^[4]研究表明，亞硝酸鹽的降解分為酶降解和酸降解兩個(gè)階段，在pH高于4.5時(shí)，主要以酶降解為主，當(dāng)pH降低到4.0以下主要以酸降解為主；乳酸菌可以將碳水化合物分解成乳酸，降低pH，在發(fā)酵過程中構(gòu)建酸性環(huán)境，抑制食品腐敗和致病微生物生長的同時(shí)，促進(jìn)亞硝酸鹽的降解。葛芮瑄等^[5]研究表明，乳酸菌利用糖類分解成乳酸的同時(shí)伴隨著乙酸、丁酸、3-羥基-2-丁酮等小分子風(fēng)味物質(zhì)的形成，在抑制腐敗、降解亞硝酸鹽的同時(shí)賦予了風(fēng)味。楊慧軒等^[6]指出不同乳酸菌之間的合理組合會(huì)提高產(chǎn)品質(zhì)量和抑菌效果。可見，將乳酸菌發(fā)酵運(yùn)用到肉制品加工中，可以起到改善產(chǎn)品風(fēng)味、抑制氧化酸敗、降解亞硝酸鹽和生物胺、延長產(chǎn)品保質(zhì)期等作用^[7]。因此，本研究旨在篩選出發(fā)酵特性優(yōu)良且具有工業(yè)發(fā)酵潛力的乳酸菌，為后續(xù)臘肉生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器設(shè)備

1.1.1 材料試劑

臘肉：采集自四川成都、內(nèi)江傳統(tǒng)農(nóng)家臘肉樣品4份。

對(duì)氨基苯磺酸、乙酸鋅、鹽酸萘乙二胺、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、吐溫80、牛肉浸粉、亞硝酸鈉：福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、硼砂、亞鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、MnSO₄·H₂O：天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；所有試劑均為分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

BSA423S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；BPG-9070A精密鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GI54DWS全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；GCMS-QP2020 NX氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)家臘肉中乳酸菌的分離與純化

稱取臘肉樣品各10 g，在無菌條件下加入90 mL無菌生理鹽水，使用破壁機(jī)將其打碎。將上述樣液分別加入MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h^[8]。

取上述發(fā)酵液樣品，稀釋3個(gè)梯度后，取0.2 mL涂布于添加3% 碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h^[9]，挑取具有溶鈣圈的單一菌落，在MRS培養(yǎng)基中重復(fù)分離純化培養(yǎng)3次，得到純化后的菌株，于-20 ℃甘油中保存^[10]。

1.2.2 降解亞硝酸鹽菌株的初篩

亞硝酸鹽培養(yǎng)基：配制150 mg/L的亞硝酸鹽溶液，按照1∶9的比例加入已滅菌的MRS培養(yǎng)基中混勻^[11]。

將各菌株按1%的接種量接種于10 mL亞硝酸鹽培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h，采用鹽酸萘乙二胺法測(cè)定亞硝酸鹽殘留量^[12]。

1.2.3 菌株生長曲線的測(cè)定

將活化菌株以2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h，每隔2 h測(cè)定培養(yǎng)液的OD_{600 nm}值。

1.2.4 發(fā)酵液pH值的測(cè)定

將活化菌株以2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h^[13]，每隔4 h測(cè)定發(fā)酵液的OD_{600 nm}值。

1.2.5 菌株耐鹽試驗(yàn)

將活化菌株按照2%的接種量分別添加于含有6.5%、10% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中^[14]，于37 ℃培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液的OD_{600 nm}值。

1.2.6 乳酸菌分子生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA，作為模板，參考劉建利等^[15]的方法，PCR擴(kuò)增16S rDNA基因序列，并委托上海凌恩生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序序列提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫，采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源性對(duì)比鑒定。

1.2.7 制作工藝流程

材料：豬肉、乳酸菌、亞硝酸鈉、食鹽；組別設(shè)置：添加菌液組為試驗(yàn)組，傳統(tǒng)發(fā)酵組為對(duì)照組。

原料肉處理：選擇新鮮的豬五花肉，切割成規(guī)則的形狀（長約20 cm，寬為5～7 cm），使用白酒洗凈。

輔料添加：加入輔料并充分揉搓，對(duì)照組和試驗(yàn)組均采用傳統(tǒng)工藝，試驗(yàn)組菌液采用注射器注射進(jìn)肌肉。

腌制：將處理好的肉塊在腌缸中腌制72 h。

風(fēng)干、發(fā)酵熟成：按照烘干加工條件，將肉塊置于烘干機(jī)內(nèi)，以50 ℃烘制32 h至肉塊呈半干狀態(tài)后移入室外懸掛、通風(fēng)，使之繼續(xù)發(fā)酵成熟。

1.2.8 水分含量的測(cè)定

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》方法測(cè)定樣品中水分含量。

1.2.9 pH值的測(cè)定

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測(cè)定》方法，選取臘肉樣品中瘦肉部分測(cè)定pH值^[16]。

1.2.10 過氧化值的測(cè)定

參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測(cè)定》方法測(cè)定樣品的過氧化值。

1.2.11 TBARS值的測(cè)定

參照GB 5009.181—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中丙二醛的測(cè)定》，采用分光光度法測(cè)定樣品中TBARS值。

1.2.12 亞硝酸鹽殘留量的測(cè)定

參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》方法測(cè)定樣品中亞硝酸鹽殘留量。

1.2.13 臘肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

精確稱取肥瘦均勻的臘肉樣品5 g于頂空瓶中，于60 ℃水浴加熱40 min、吸附30 min、解吸5 min。

參考王衛(wèi)等^[17]的方法并做一定修改，氣相色譜（GC）條件：采用HP-5MS毛細(xì)管柱（30.0μm×250μm×0.25μm），載氣為He，恒定流速為1 mL/min，進(jìn)樣口溫度為220 ℃，以不分流方式進(jìn)樣。柱箱采用程序升溫，初始溫度50 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升溫到110 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫到250 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜（MS）條件：色譜、質(zhì)譜的接口溫度為250 ℃，質(zhì)譜電子方式為EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，溶劑延遲2 min。電子倍增器電壓1 600 V，數(shù)據(jù)以30～300 amu的掃描范圍進(jìn)行收集。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 9.5繪制柱狀圖、折線圖和雷達(dá)圖，使用SPSS 25.0進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解亞硝酸鹽乳酸菌的分離純化

從四川不同地區(qū)采集的4份臘肉樣品中共分離出18株革蘭氏染色陽性疑似菌落，菌落呈乳白色或黃色，菌落直徑在1～5 mm。其中14株菌落表面光滑濕潤，邊緣較規(guī)則，具有典型的乳酸菌特征^[18]，其余4株菌落結(jié)構(gòu)差異較大且無溶鈣圈，故初篩出14株乳酸菌^[9]，見圖1。

由圖1可知，14株菌株均具有亞硝酸鹽降解能力，其中2，3，4，7，8，9，10號(hào)菌株的降解能力較強(qiáng)，其發(fā)酵液中亞硝酸鹽殘留量均低于5%，故選取這7株菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 高效降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選鑒定

2.2.1 菌株發(fā)酵特性的測(cè)定

由圖2可知，對(duì)比發(fā)酵液的pH值，2，4，10號(hào)菌株的產(chǎn)酸能力更突出，發(fā)酵液的pH值較低，能在發(fā)酵過程中提供較好的酸性環(huán)境，抑制雜菌的生長，增加了菌株用于發(fā)酵的可能性^[10]。

由圖3可知，4號(hào)和2號(hào)菌株的總體耐受力較強(qiáng)，在6.5%和10%鹽濃度下4號(hào)菌株的耐受力均優(yōu)于2號(hào)菌株，10號(hào)菌株在10%鹽濃度下耐受力最強(qiáng)。如今臘肉多為低鹽臘肉^[11]，鹽分含量在6%以下，因此4號(hào)菌株更具有優(yōu)勢(shì)。

由圖4可知，對(duì)比7株具有高效降解亞硝酸鹽能力的菌株的產(chǎn)酸能力、生長曲線和鹽耐性指標(biāo)，最終篩選出生長發(fā)酵特性最優(yōu)的4號(hào)菌株為目標(biāo)菌株，將其編號(hào)為TrLb-4。

2.2.2 高效降解亞硝酸鹽菌株分子生物學(xué)鑒定

采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)TrLb-4菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，提取其DNA，進(jìn)行16S rDNA基因序列PCR擴(kuò)增，得到測(cè)序結(jié)果后在NCBI進(jìn)行BLAST同源性序列比對(duì)，測(cè)序結(jié)果顯示4號(hào)菌株為短乳桿菌，其生長發(fā)育樹見圖5。

2.3 高效降解亞硝酸鹽短乳桿菌發(fā)酵應(yīng)用

2.3.1 短乳桿菌發(fā)酵對(duì)臘肉理化性質(zhì)的影響

由表1可知，試驗(yàn)組與對(duì)照組臘肉的含水量無顯著差異。短乳桿菌TrLb-4發(fā)酵過程中對(duì)水分含量的影響并不突出，對(duì)臘肉的保存和貨架期的影響不明顯；試驗(yàn)組樣品pH值相比對(duì)照組有所降低（P<0.05），酸性環(huán)境可以抑制臘肉中雜菌的生長及輔助降解亞硝酸鹽，對(duì)提高臘肉的安全性具有積極作用^[19]，同時(shí)試驗(yàn)組的POV值與TBARS值均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），表明短乳桿菌TrLb-4發(fā)酵可以顯著減緩臘肉中脂肪的氧化酸敗^[20]，理論上可以減少不良?xì)馕兜漠a(chǎn)生，提升臘肉的品質(zhì)。

發(fā)酵完成后，試驗(yàn)組亞硝酸鹽殘留量顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。在試驗(yàn)中，為了模擬工廠臘肉生產(chǎn)條件，腌制過程中添加了15 mg/kg亞硝酸鹽，在臘肉自然發(fā)酵過程中，亞硝酸鹽分解速率緩慢，導(dǎo)致其大量殘留于臘肉中，而試驗(yàn)組發(fā)酵后的亞硝酸鹽殘留量大幅降低，表明短乳桿菌TrLb-4可以高效降解臘肉中亞硝酸鹽，提高臘肉的安全性。

2.3.2 短乳桿菌發(fā)酵對(duì)臘肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

臘肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量見表2。

兩組之間的主體風(fēng)味物質(zhì)存在差異，試驗(yàn)組共檢測(cè)出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)53種，對(duì)照組共檢測(cè)出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)56種，各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量對(duì)比見圖6。

對(duì)照組風(fēng)味物質(zhì)主要為醛類物質(zhì)，其占比達(dá)到56.24%，試驗(yàn)組中醛類物質(zhì)含量為41.29%，相比對(duì)照組有所下降。醛類物質(zhì)是發(fā)酵肉制品中的主要特征風(fēng)味物質(zhì)^[21]，其風(fēng)味閾值較低，多由脂肪氧化分解產(chǎn)生，對(duì)臘肉的風(fēng)味有重要影響，但含量較多會(huì)生成油膩和酸敗的氣味^[22]。

醇類物質(zhì)主要來源于脂質(zhì)的降解和氧化^[23]，通常帶有果香、花香，閾值較高，對(duì)臘肉風(fēng)味的整體影響較小，在發(fā)酵后期，醇類物質(zhì)會(huì)與有機(jī)酸形成閾值較低、對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的酯類物質(zhì)^[24-25]。試驗(yàn)組中醇類含量達(dá)到25.04%，其中桉葉油醇和芳樟醇含量較高，這兩類物質(zhì)具有一定的抑菌作用^[26]，同時(shí)對(duì)臘肉的風(fēng)味形成也有貢獻(xiàn)；對(duì)照組中酯類物質(zhì)含量為11.14%，試驗(yàn)組中酯類物質(zhì)含量有所提高，占比為14.79%，其中檢出發(fā)酵肉制品特征風(fēng)味物質(zhì)丁酸乙酯^[27]。

酮類物質(zhì)主要由發(fā)酵過程中不飽和脂肪氧化及氨基酸降解產(chǎn)生，含量相對(duì)較低，對(duì)臘肉風(fēng)味起到增強(qiáng)作用^[28]；同樣，烴類物質(zhì)也可以提供特征風(fēng)味，對(duì)臘肉的風(fēng)味具有一定影響。試驗(yàn)組相比于對(duì)照組，酮類物質(zhì)的種類和含量都有所增加；烴類物質(zhì)含量差異較小，但種類不盡相同，其中具有刺激性氣味的物質(zhì)含量降低。

總體而言，試驗(yàn)組樣品揮發(fā)性風(fēng)味成分更豐富，這是由于短乳桿菌的發(fā)酵促進(jìn)了蛋白質(zhì)、脂肪和糖類成分等的分解^[8]，進(jìn)而促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，同時(shí)抑制脂肪酸敗氧化，有效改善因醛類物質(zhì)過多產(chǎn)生的負(fù)面影響。酯類、酮類和烴類物質(zhì)的形成也進(jìn)一步增強(qiáng)和改善了臘肉的風(fēng)味^[5]。

3 結(jié)論

本研究從四川傳統(tǒng)臘肉中分離出14株乳酸菌，對(duì)比其亞硝酸鹽降解能力、鹽耐受性、產(chǎn)酸能力等發(fā)酵特性，最終篩選出目標(biāo)菌TrLb-4，經(jīng)16S rDNA序列同源性分析，該菌株為短乳桿菌。發(fā)酵后，兩組臘肉樣品含水量無顯著差異；試驗(yàn)組的pH值、過氧化值、TBARS值均有所降低（P<0.05），亞硝酸鹽殘留量顯著低于對(duì)照組（P<0.01）；全二維GC-MS分析結(jié)果顯示：試驗(yàn)組中共檢測(cè)出53種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醛類物質(zhì)占比減少，減輕了因大量醛類物質(zhì)累積而帶來的油脂酸敗味；醇類、酯類和酮類物質(zhì)占比增加，臘肉的特征風(fēng)味得到增強(qiáng)；產(chǎn)生不悅氣味的烴類物質(zhì)減少，風(fēng)味物質(zhì)組成更豐富。綜上所述，短乳桿菌TrLb-4可顯著降低臘肉中亞硝酸鹽殘留量，減緩脂肪的酸敗氧化，促進(jìn)醇類、酯類和酮類物質(zhì)產(chǎn)生，改善臘肉的風(fēng)味，其在提高臘肉安全性的同時(shí)改善了臘肉的品質(zhì)，可作為發(fā)酵臘肉的功能菌株應(yīng)用到臘肉工業(yè)化生產(chǎn)中。

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