黃娟娟 黃亞萍 李文芳 毛娟 陳佰鴻

DOI：10.13925/j.cnki.gsxb.20240068

摘??? 要：【目的】通過驗證蘋果非典型成員多效唑抗性蛋白基因（PRE6-like）的功能，探索其在花青素生物合成中的調(diào)控作用。【方法】基于俄矮2號芽變枝條果皮轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，篩選獲得花青素合成相關(guān)調(diào)節(jié)基因MdPRE6-like，對其進行生物信息學(xué)分析，克隆CDS并構(gòu)建過表達載體，瞬時表達金冠蘋果果實，遺傳轉(zhuǎn)化蘋果愈傷和擬南芥進行功能驗證?！窘Y(jié)果】MdPRE6-like cDNA全長279 bp，編碼92個氨基酸，相對分子質(zhì)量10 450.75 Da，理論等電點（pI）為6.41，含有HLH結(jié)構(gòu)域，亞細胞定位預(yù)測結(jié)果為細胞核。組織特異性表達分析表明，MdPRE6-like基因在花、果皮中的表達量顯著高于根和葉。瞬時表達金冠蘋果表明，MdPRE6-like顯著促進了金冠蘋果果皮注射部位花青素的積累，并顯著提高了花青素合成通路相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達水平。MdPRE6-like基因在蘋果愈傷組織和擬南芥過表達表明，轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織和擬南芥葉脈中的花青素含量顯著高于野生型，且花青素合成通路結(jié)構(gòu)基因表達水平上調(diào)?！窘Y(jié)論】MdPRE6-like基因能夠正向調(diào)控花青素的合成和積累，為后續(xù)MdPRE6-like基因參與改良蘋果果實品質(zhì)提供理論參考。

關(guān)鍵詞：蘋果；MdPRE6-like；花青素合成；遺傳轉(zhuǎn)化；表達水平

中圖分類號：S661.1?????????? 文獻標(biāo)志碼：A??????????? 文章編號：1009-9980（2024）05-0812-12

收稿日期：2024-01-31??????? 接受日期：2024-02-29

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2022YFD1602106）；甘肅省教育廳“雙一流”重點科研項目（GSSYLXM-02）；甘肅省科技重大專項（22ZD6NA045）

作者簡介：黃娟娟，女，在讀碩士研究生，研究方向為果樹栽培技術(shù)與調(diào)控機制研究。E-mail：2645265817@qq.com

*通信作者 Author for correspondence. E-mail：bhch@gsau.edu.cn

果 樹 學(xué) 報 2024，41（5）： 812-823

Journal of Fruit Science

Cloning of PRE6-like gene and analysis of its function in anthocyanin synthesis in apple

HUANG Juanjuan， HUANG Yaping， LI Wenfang， MAO Juan， CEHN Baihong*

（College of Horticulture， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， Gansu， China）

Abstract： 【Objective】 The PREs gene， also known as the polyoxazole resistance gene， belongs to the basic/helix-loop-helix （bHLH） transcription factor family. It lacks a DNA binding domain and typically forms homodimers or heterodimers to regulate the expression of target genes， thereby influencing plant morphology， cell size， pigment metabolism and response to abiotic stress. This study aimed to verify the function of the atypical member of the polyoxazole resistance protein gene （PRE6-like） in apple and explore its regulatory role in anthocyanin biosynthesis. 【Methods】 The Oregon Spur Ⅱ， which is highly prone to bud mutation， exhibits significantly improved fruit color compared to the original variety. A new mutant strain of the Oregon Spur Ⅱ apple was discovered， which exhibits early and intense coloring， with a reddish fruit surface at maturity， and stable variation traits. Based on transcriptome sequencing of the skin of fruits on the bud mutation branch from the Oregon Spur Ⅱ apple， a flower pigment synthesis-related regulatory gene， MdPRE6-like was identified. The coding sequence （CDS） of the MdPRE6-like gene （MD14G1197600） was obtained from the apple genome website， and primers were designed using Primer 5.0 to amplify the cDNA from Oregon Spur Ⅱ the skin tissue of fruits on the bud mutation branch. Bioinformatics analysis software was used for biological information analysis， and tissue-specific expression was analyzed using the fluorescence quantitative PCR. The CDS region was cloned and ligated into the linearized expression vector pCAMBIA1301-GFP. Escherichia coli DH5α was heat-shock transformed， and Agrobacterium tumefaciens GV3101 was transformed to construct the overexpression vector. Transient expression was performed in Golden Delicious apple fruit， and the color changes of the skin under intensive light conditions （12 000 lx） were observed to preliminarily identify the genes role in anthocyanin synthesis. Further functional validation was conducted through Agrobacterium-mediated transformation of apple callus and by the floral dip method in Arabidopsis. 【Results】 The MdPRE6-like is located on chromosome 14， with an open reading frame of 279 bp， encoding 92 amino acids. The molecular formula is C444H745N137O149S2， with a relative molecular weight of 10 450.75 Da and a theoretical isoelectric point （pI） of 6.41. The total hydrophobicity is -0.654， which is a hydrophilic protein with a lipid solubility index of 97.50 and an instability index of 85.86. It belongs to an unstable protein， and its secondary structure shows that the protein α spiral structure accounts for 66.30%， irregular curls account for 32.61%， and extended chains account for 1.09%， so there are three α-The atypical bHLH proteins composed of a spiral structure， which is consistent with the proteins tertiary structure. The subcellular localization prediction results of MdPRE6-like protein indicated that it may be localized in the nucleus. Multiple sequence alignment of its conserved domains with similar species revealed that the MdPRE6-like protein was an atypical bHLH protein containing an HLH domain. Organizational specific expression analysis showed that the expression level of MdPRE6-like gene in flowers and fruit peel was significantly higher than that in roots and leaves， indicating that this gene had a certain impact on the growth and development of apple fruit. Instantaneous expression of the Golden Delicious apple showed that MdPRE6-like significantly promoted the accumulation of anthocyanins at the injection site of the Golden Delicious apple peel， and increased the expression level of structural genes related to the anthocyanin synthesis pathway. The UFGT gene， also known as the 3-O-flavonoid glucosyltransferase gene， was significantly different from the control （p≤0.001）; The overexpression of MdPRE6-like gene in apple callus and Arabidopsis thaliana revealed a significant increase in anthocyanin content in transgenic apple callus compared with the control. The expression level of MdPRE6-like gene was 5.22 times higher than that of the control， and the relative expression level of structural genes in the anthocyanin synthesis pathway increased. The differences in CHI， DFR and F3H compared to the control were extremely significant （p＜0.001）， being 5.22， 18.40 and 8.96 times higher， respectively. The accumulation effect of total anthocyanin content in the leaf veins of transgenic Arabidopsis was significant， and the expression level of MdPRE6-like gene in OE1 and OE3 strains was 9.22 and 7.14 times higher than the control， with extremely significant differences compared to the control. 【Conclusion】 MdPRE6-like gene can positively regulate the synthesis and accumulation of anthocyanins and promote the expression levels of structural genes in the anthocyanin synthesis pathway. Therefore， the results can provide theoretical reference for the MdPRE6-like gene to participate in improving the quality of apple fruit in the future.

Key words： Apple; MdPRE6-like gene; Anthocyanin synthesis; Genetic transformation; Expression level

蘋果（Malus domestica Borkh.）是溫帶地區(qū)最廣泛生產(chǎn)的經(jīng)濟水果作物之一，也是全球營養(yǎng)水平最高和消費最廣泛的水果之一[1]。在蘋果生產(chǎn)中，可以利用基因技術(shù)培育新品種，改良蘋果外觀品質(zhì)（如色澤）以提高經(jīng)濟效益，推動蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。然而，目前蘋果產(chǎn)業(yè)面臨氣候變化、遺傳基礎(chǔ)狹窄、營養(yǎng)質(zhì)量下降等諸多挑戰(zhàn)[2]，降低了蘋果的市場競爭力。因此，提高競爭與適應(yīng)能力、獲取優(yōu)質(zhì)資源、確保產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展尤為重要。元帥系蘋果作為現(xiàn)今世界上最易發(fā)生芽變的蘋果品種之一，迄今已有200余種，且芽變品系已發(fā)展到了第五代[3]。俄矮2號（Oregon Spur Ⅱ）是元帥第四代芽變品種俄矮紅（Oregon Spur Del.）的芽變品種，8月下旬可著滿色，提早上市[4]。

堿性/螺旋環(huán)-螺旋（bHLH）是調(diào)控植物對激素和逆境反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子大家族[5]，其保守結(jié)構(gòu)域能與其他轉(zhuǎn)錄因子共激活或共抑制蛋白形成復(fù)合物，調(diào)控花青素合成通路中結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄活性，進而影響花青素生物合成。在水稻[6]中，S1（bHLH）作為主基因通過激活C1（MYB）的表達，然后C1激活WA1（WD40）的表達，以MYB-bHLH-WD40復(fù)合體的形式，協(xié)同調(diào)節(jié)花青素生物合成基因；在擬南芥[7]中，R蛋白同源bHLH轉(zhuǎn)錄因子TT8蛋白是類黃酮后期生物合成基因DFR在擬南芥中正常表達所必需的。非典型成員多效唑抗性蛋白基因（PREs），作為bHLH家族成員，含HLH結(jié)構(gòu)域，通常參與同源或異源二聚體的形成以調(diào)控目標(biāo)基因的表達，進而調(diào)節(jié)植物形態(tài)、細胞大小、色素代謝和非生物脅迫[8-9]。PREs基因的功能在多個物種中已被報道。在擬南芥中，初步研究揭示了AtPREs參與赤霉素（GA）、油菜素類固醇（BR）和光信號通路，通過與bHLH蛋白的相互作用來調(diào)節(jié)植物的生長[10]。Zheng等[11]研究表明PRE6表達直接受ARF5和ARF8調(diào)節(jié)，而PRE6是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，對擬南芥中的生長素應(yīng)答產(chǎn)生負調(diào)控；擬南芥BNQ3（PRE4）基因在調(diào)節(jié)光反應(yīng)中起作用，BNQ3突變改變萼片和心皮顏色，降低葉綠素含量，使花莖色澤變紫，且能通過下調(diào)BNQ依賴性光形態(tài)發(fā)生和發(fā)育信號通路來調(diào)節(jié)花瓣生長發(fā)育[12]；在番茄中，SlPRE2與光形態(tài)的建成、赤霉素的響應(yīng)及果實細胞發(fā)育有關(guān)，SlPRE6-like蛋白與光形態(tài)建成相關(guān)因子SIPAR1互作，進而調(diào)節(jié)細胞生長[13]。

筆者所在課題組成員在2019年于天水市麥積區(qū)的蘋果主栽區(qū)發(fā)現(xiàn)了1株俄矮2號蘋果芽變枝條，其突出特點是幼果期就能著色且著色良好、穩(wěn)定，成熟時果面出現(xiàn)暈紅，色澤艷麗，這可能暗示了該突變體具備提前合成和積累花青素的能力。為探究該品種芽變是否為基因突變引起的調(diào)控異常，筆者以俄矮2號芽變蘋果為材料，利用前期轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析獲得的蘋果花青素苷合成調(diào)控關(guān)鍵基因MdPRE6-like，對其進行生物信息學(xué)分析，克隆CDS序列并構(gòu)建MdPRE6-like過表達載體。同時對金冠蘋果果實表皮瞬時表達分析進行該基因的初步功能驗證，并通過遺傳轉(zhuǎn)化王林蘋果愈傷組織和擬南芥，檢測轉(zhuǎn)基因植株中的花青素含量及花青素合成相關(guān)功能基因的表達水平，為深入研究花青素合成調(diào)控機制及應(yīng)用基因工程改良蘋果品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

俄矮2號（Oregon Spur Ⅱ）蘋果種植于天水市麥積區(qū)蘋果主栽區(qū)，金冠（Golden Delicious）蘋果由平?jīng)鍪徐o寧果樹果品研究所提供，擬南芥（Arabidopsis thaliana）、王林（Orin）蘋果愈傷組織為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1??? MdPRE6-like基因生物信息學(xué)分析??? 利用EXPASY-Proparam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測MdPRE6-like蛋白的分子質(zhì)量和理論等電點。利用Portscale（https：//web.expasy.org/protscale/）進行蛋白親疏水性分析，利用Signaip（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）進行信號肽的預(yù)測，利用GSDS 2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）進行基因結(jié)構(gòu)圖譜構(gòu)建，利用TMHMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進行蛋白跨膜預(yù)測，利用WOLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進行亞細胞定位預(yù)測，利用SOPMA（https：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）進行蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）進行蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.2??? Mdpre6-like基因CDS克隆??? 在蘋果基因組網(wǎng)站（https：//iris.angers.inra.fr/gddh13/）下載MdPRE6-like基因（MD14G1197600）的CDS序列，采用primer5.0設(shè)計引物（表1），以俄矮2號芽變枝條果皮組織的cDNA為模板進行擴增，將擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳（1%）中分離后使用SteadyPure（艾科瑞生物）試劑盒回收純化。

1.2.3??? MdPRE6-like過表達載體構(gòu)建??? 將純化回收后的產(chǎn)物連接到線性化載體pCAMBIA1301-GFP（實驗室保存、Bam HI酶切）上。熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂板過夜，挑取平板菌落至1.5 mL離心管（Lb液體培養(yǎng)基+卡那霉素），將大腸桿菌菌液PCR，挑選條帶合適且明亮的菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析，最后通過DNAMAN軟件對測序數(shù)據(jù)進行比對分析測序。測序合適的大腸菌液利用質(zhì)粒小提試劑盒（北京天根）提取質(zhì)粒。

1.2.4??? 金冠蘋果瞬時表達??? 通過熱激法將構(gòu)建好的pCAMBIA1301-GFP過表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101（北京博邁德基因技術(shù)有限公司）中用于金冠蘋果果皮的瞬時表達。利用10 mmol·L-1的MES（水嗎啉乙磺酸）、200 μmol·L-1的AS（乙酰丁香酮）、10 mmol·L-1的MgCl2（氯化鎂）配制緩沖液，重懸菌體后使用2 mm注射器注射蘋果表皮，每個注射孔200 ?L，置完全黑暗條件1 d，然后轉(zhuǎn)移至12 000 lx強光條件，持續(xù)照射3～5 d，觀察并拍照記錄著色部位后，取樣速凍，并于-80 ℃冰箱保存。

1.2.5??? 王林蘋果愈傷組織和擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化??? 利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法侵染王林蘋果愈傷組織[14]，將含MdPRE6-like的過表達農(nóng)桿菌菌液活化離心后，用MS液體培養(yǎng)基重懸菌體至OD600=0.5，同時將愈傷懸浮2～3 h，將復(fù)蘇后菌液侵染10～12 min，紗布過濾、濾紙吸干平鋪愈傷至MS+3%蔗糖+6 g·L-1瓊脂的固體培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)1.5 d，洗菌，轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基（篩選條件：頭孢0.15 g·L-1，潮霉素1 mg·L-1）上24 ℃暗培養(yǎng)7 d，然后轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)箱（16 h /8 h的光照/黑暗）中，于篩選培養(yǎng)基上繼代3～5次后觀察愈傷表型，愈傷表面著色后進行Hyg（潮霉素）鑒定，采用CTAB法提取愈傷組織DNA，對潮霉素進行PCR鑒定并將陽性愈傷組織進行擴繁。

擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化采用花序浸蘸法，熱激轉(zhuǎn)化合適的農(nóng)桿菌液利用Lb液體培養(yǎng)基（含25 mg·L-1卡那霉素、25 mg·L-1利福平）于搖床（28 ℃、165 r·min-1）培養(yǎng)，離心后利用現(xiàn)配侵染液（1/2 MS+5%蔗糖+0.05% Siwet）重懸至OD600=0.8，復(fù)蘇2～3 h，花序侵染2 min，侵染后黑暗條件1 d，然后轉(zhuǎn)至自然光下室溫培養(yǎng)。將收獲的T0代種子4 ℃春化后種于含Hyg的MS培養(yǎng)基上（MS+3%蔗糖+6 g·L-1瓊脂+12.5 mg·L-1 Hyg）抗性篩選，進行陽性植株初步鑒定，待擬南芥移栽至土壤基質(zhì)14 d后，采用CTAB法提取植株幼葉DNA，對潮霉素進行PCR鑒定，將對應(yīng)陽性植株標(biāo)注，種子單獨收取，得到T1代擬南芥，重復(fù)以上步驟獲得T2代，最終獲得純合的T3代擬南芥。

1.2.6??? 總花色苷含量的測定??? 采用蘇州夢犀生物醫(yī)藥科技試劑盒，設(shè)置3次重復(fù)，每個重復(fù)0.2 g鮮樣，利用Spark多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）分別測定不同pH下對照管和測定管于530、700 nm處吸光值，利用計算公式測定花青苷含量。

1.2.7??? qRT-PCR??? 采集俄矮2號芽變枝條在盛花期的根、莖、葉、花、成熟期的果實果皮用于MdPRE6-like基因的組織特異性表達分析；瞬時表達著色部位的蘋果果皮、轉(zhuǎn)基因愈傷組織及轉(zhuǎn)基因擬南芥用于測定MdPRE6-like基因及花青素合成通路中結(jié)構(gòu)基因（CHI、CHS、DFR、F3H、ANS、UFGT）的表達水平。使用RNA提取試劑盒（OMEGA試劑盒）提取以上組織中總RNA，然后利用超微量分光光度計檢驗RNA提取濃度，利用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ?qū)NA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；用熒光定量PCR儀（羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參考SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒。利用primer5.0軟件進行引物設(shè)計（表1），分別以蘋果Q-MdMDH和擬南芥Atactin為內(nèi)參基因，采用2-??Ct法計算基因的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010數(shù)據(jù)處理，利用IBM SPSS Statistics 24對MdPRE6-like基因在蘋果不同組織中的表達模式進行差異顯著性分析，其余利用Origin 2022、插件Paired Coparison Plot多重配對比較進行差異顯著性分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MdPRE6-like基因的克隆及生物信息學(xué)分析

以俄矮2號芽變枝條的果實cDNA為模板，成功克隆到MdPRE6-like基因。電泳結(jié)果（圖1）表明，在250～500 bp之間出現(xiàn)了一條明亮條帶，與目的基因預(yù)測結(jié)果279 bp相符合。

通過PCR技術(shù)克隆該基因后，對克隆到的目的基因利用軟件進行生物信息學(xué)分析?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，MdPRE6-like全長723 bp，兩段CDS序列被非編碼區(qū)隔開，且在CDS序列兩端還存在較長的非翻譯區(qū)（圖2-A）。對MdPRE6-like蛋白理化性質(zhì)分析表明，MdPRE6-like位于14號染色體上，開放閱讀框279 bp，編碼92個氨基酸，分子式為C444H745N137O149S2，相對分子質(zhì)量為10 450.75 Da，理論等電點為6.41，總疏水性為-0.654，表明為親水性蛋白（圖2-B），脂溶指數(shù)為97.50，且蛋白不穩(wěn)定指數(shù)85.86，屬于不穩(wěn)定蛋白；跨膜預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白無跨膜區(qū)（圖2-C），因此是在細胞核中調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。

蛋白二級結(jié)構(gòu)表明（圖2-D），該蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)占比66.30%，無規(guī)則卷曲占比32.61%，延伸鏈占1.09%，因此是由3個α螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成的非典型bHLH蛋白，這與蛋白三級結(jié)構(gòu)相符合（圖2-E）。MdPRE6-like蛋白亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明，其可能定位于細胞核。

將MdPRE6-like編碼的氨基酸序列與相近物種的保守結(jié)構(gòu)域進行多序列比對（圖3），結(jié)果表明，保守結(jié)構(gòu)域沒有堿性區(qū)域，只含有HLH結(jié)構(gòu)域。

2.2 MdPRE6-like基因組織特異性表達分析

將俄矮2號突變材料所提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以蘋果Q-PRE6-like-F、Q-PRE6-like-R 為引物（表1），用qRT-PCR檢測MdPRE6-like基因在蘋果不同組織中的表達情況，結(jié)果表明，MdPRE6-like在蘋果花和果皮中的表達量最高，其次是莖和葉，根系表達量最低（圖4）。表明該基因?qū)μO果果實生長發(fā)育有一定的影響。

2.3 MdPRE6-like基因過表達載體構(gòu)建

對PCR產(chǎn)物進行純化和回收，并連接在表達載體pCAMBIA1301上，轉(zhuǎn)染到大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，測序結(jié)果與目的序列結(jié)果一致，過表達載體構(gòu)建成功（圖5-A）。將測序結(jié)果正確的大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化結(jié)果合適（圖5-B）。

2.4 MdPRE6-like基因的生物學(xué)功能分析

2.4.1??? 金冠蘋果果皮瞬時注射??? 通過瞬時注射金冠蘋果果皮，結(jié)果表明，過表達MdPRE6-like（OE）顯著提高了果皮注射部位的著色和總花青苷的含量（圖6-A～C），且過表達部位總花青苷含量是對照（WT）的10倍，OE-MdPRE6-like基因的相對表達量與WT差異顯著（圖6-D）。利用qRT-PCR進一步分析果皮中花青素合成通路中相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)OE-UFGT基因的相對表達量與WT差異顯著，OE-DFR、OE-F3H表達量是WT的2～3倍，其他基因也上調(diào)表達，但差異不顯著（圖6-E）。因此，筆者可以推斷，果皮中MdPRE6-like基因表達量的上升影響到花青素的積累及花青素合成通路酶基因轉(zhuǎn)錄水平的提高。

2.4.2??? MdPRE6-like基因在蘋果愈傷組織中的過表達??? MdPRE6-like基因在蘋果愈傷組織中的過表達結(jié)果如圖7-A所示，愈傷組織中點狀紅色色素明顯積累，說明OE-MdPRE6-like能夠促進總花青苷含量的積累。為了驗證這一表征，筆者對愈傷組織中紅色組織擴繁后進行總花色苷含量的測定，結(jié)果證實過表達愈傷組織中的MdPRE6-like基因表達量顯著升高，是WT的5.22倍，且總花色苷含量極顯著高于WT（圖7-B～C）。為了進一步說明蘋果MdPRE6-like能夠調(diào)控花青素合成，對過表達OE-MdPRE6-like系進行花青素合成通路中相關(guān)酶基因測定，所有合成基因都出現(xiàn)了上調(diào)表達，其中，DFR、F3H基因相對表達量極顯著上調(diào)（圖7-D）。

2.4.3??? MdPRE6-like基因在擬南芥中的過表達??? 為了驗證MdPRE6-like基因在擬南芥花青素合成中的功能，將收獲的T0代種子經(jīng)過抗性篩選及陽性植株鑒定（圖8-A），發(fā)現(xiàn)抗潮霉素的植株長勢好，對潮霉素?zé)o抗性的幾乎不生長，保持發(fā)芽時幼小狀態(tài)。取陽性苗幼葉提取DNA進行鑒定，發(fā)現(xiàn)有部分條帶較亮，部分無條帶，T2代擬南芥（圖8-B）鑒定結(jié)果表明，抗性苗和非抗性苗比例達到3∶1，選取對應(yīng)條帶較亮的擬南芥幼苗擴繁，得到純合T3代擬南芥植株。圖8-C顯示了過表達株系和野生植株的表型對照，觀察可見，過表達株系的葉片葉脈部位明顯較野生型深，且表現(xiàn)出紫紅色。進一步的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，3株過表達植株的花青素含量顯著高于野生型（圖8-D），其中，MdPRE6-like基因表達量分別達到9.2、4.7、7.1，與WT差異顯著（圖8-E）。對MdPRE6-like轉(zhuǎn)基因擬南芥花青素合成相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平進行測定發(fā)現(xiàn)，除CHI、UFGT基因上調(diào)但與WT無顯著性差異外，F(xiàn)3H顯著上調(diào)表達，CHS、DFR與ANS極顯著上調(diào)表達（圖8-F）。

3 討 論

基因在植物組織中的差異性表達是植物適應(yīng)多樣化環(huán)境和實現(xiàn)不同功能的重要機制之一。例如，某些基因可能在根部中高度表達，而在葉片中表達量較低，這種差異性表達可以導(dǎo)致根部和葉片在形態(tài)和功能上的差異[15]。此外，植物基因的差異性表達還可以通過組織特異性啟動子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的存在來實現(xiàn)，這些啟動子和結(jié)合位點可以在特定組織或細胞類型中被激活，從而調(diào)控特定基因的表達[16]。通過組織特異性表達分析，筆者發(fā)現(xiàn)PRE6-like基因在蘋果不同組織中表現(xiàn)出不同的表達模式，在蘋果花和果實中的表達水平高，而花青素是一種常見的存在于植物花朵和果實中的色素，預(yù)測該基因在果實色澤形成過程中，通過光來實現(xiàn)果皮花青素的積累。

PREs基因（Paclobutrazol Resistance genes），又名多效唑抗性基因，植物對多效唑具有抵抗能力，可調(diào)節(jié)植物形態(tài)、細胞大小、色素代謝并響應(yīng)不同植物激素的非生物脅迫。目前對于PREs基因的研究大都集中于光合與激素信號傳導(dǎo)方面，韓金秀等[17]研究表明，在煙草中過表達bHLH1基因能夠影響光合色素含量，進而影響到植物的光合能力；王麗霞等[18]發(fā)現(xiàn)光激活的藍光受體隱色體或紅光受體與COP1-SPA相互作用，介導(dǎo)藍光或紅光/遠紅光的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制COP1-SPA對下游光形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)錄因子HY5的降解，促進植物光形態(tài)發(fā)生的HY5的積累。在Yu等[19]研究中，MdLNC610通過作為促進MdACO1表達和乙烯生物合成的正向調(diào)節(jié)劑參與高光誘導(dǎo)花青素產(chǎn)生的調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果表明，金冠蘋果處于高強白光狀態(tài)下，果皮注射MdPRE6-like基因的部位呈現(xiàn)明顯色素沉著，且MdPRE6-like基因表達量上升，表明強光誘導(dǎo)MdPRE6-like基因表達量的上升，植物通過花青素的積累以對抗光脅迫引起的氧化壓力，且在強光照射下，這些轉(zhuǎn)基因愈傷組織中的外源基因更活躍地表達，激活植物體內(nèi)的一系列代謝途徑，使得愈傷組織中花青素的積累增加。齊方婷等[20]研究表明，轉(zhuǎn)錄因子直接或間接調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因表達，控制植物花斑形成，而結(jié)構(gòu)基因通過時間空間特異性表達以及基因間競爭機制，促進色素在花瓣間差異積累形成花斑。擬南芥作為一種常用模式植物，對研究植物的次生代謝和基因調(diào)控具有重要意義。本試驗轉(zhuǎn)化擬南芥的結(jié)果表明，MdPRE6-like基因的過表達促進擬南芥葉脈部位花青素的積累，而在葉片部位積累不明顯，猜測花青素合成途徑中的某些關(guān)鍵酶類基因受到了特定組織中其他基因的調(diào)控，使得花青素只在葉脈中積累[21]；也可能與葉脈組織中的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相關(guān)，葉脈組織內(nèi)的物質(zhì)運輸機制促進了花青素在該位置的積累，而其他組織則可能存在限制花青素運輸或穩(wěn)定性的因素[22-23]；導(dǎo)致其他組織中存在更多的花青素降解酶或者競爭性代謝途徑，使得花青素在這些組織中無法有效積累[24]。

花青素合成通路上的結(jié)構(gòu)基因在植物體內(nèi)編碼關(guān)鍵的酶類，這些酶在花青素的生物合成過程中發(fā)揮著重要的功能[25]，在花青素合成途徑中扮演著不同但相互關(guān)聯(lián)的角色，通過催化特定的化學(xué)反應(yīng)，使得前體物質(zhì)逐步合成為最終的花青素類化合物[26]。而調(diào)控這些基因的表達水平可以影響植物體內(nèi)花青素的合成水平和種類。花青素合成的早期，兩個限速酶CHS、CHI催化4-香豆素輔酶A碳骨架化，分子內(nèi)環(huán)化，F(xiàn)3H依賴雙加氧酶催化脫氧黃烷酮C-3位置形成二氫黃酮醇；DFR和ANS、UFGT作為花青素合成后期限速酶和關(guān)鍵酶，促成C-4位羥基形成、將無色花青素轉(zhuǎn)為有色花青素同時糖基化為穩(wěn)定花青素。在Singh等[27]、Sunil等[28]的研究中，通過控制F3H的表達來調(diào)節(jié)DFR不受抑制地發(fā)揮作用。本研究結(jié)果表明，在果皮瞬時注射結(jié)果中，UFGT基因轉(zhuǎn)錄水平較高，證明在果皮受到強光刺激后，在后期基因UFGT作用下，糖基化催化UDP葡萄糖向花青素前體轉(zhuǎn)移。其中F3H、DFR基因轉(zhuǎn)錄水平相當(dāng)，猜測可能原因是在合成過程的時間階段上，F(xiàn)3H與DFR存在反饋調(diào)節(jié)機制，以確定合成通路上的平衡穩(wěn)定性[29]。對擬南芥和愈傷組織結(jié)構(gòu)通路酶基因轉(zhuǎn)錄水平比較發(fā)現(xiàn)，DFR轉(zhuǎn)錄始終維持在較高水平，且F3H轉(zhuǎn)錄水平和MdPRE6-like基因表達水平差異不大，MdPRE6-like可能對F3H基因的表達起到直接的調(diào)節(jié)作用。Hou等[30]研究發(fā)現(xiàn)，與IBH1相關(guān)的新參與者HLH4，其過表達造成矮化和深綠色表型，并造成參與花青素生物合成途徑的許多關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶基因下調(diào)表達。HLH4干擾CIB5的活性，從而抑制CIB5調(diào)控的細胞伸長相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，HLH4對CIB5的干擾被PRE1抵消，其中這些bHLH蛋白形成了一個新的三拮抗系統(tǒng)。本研究中是否有其他基因參與花青素合成或者是否該基因在果實不同階段表達模式有所變化還有待進一步探究。

4 結(jié) 論

筆者在俄矮2號蘋果中克隆得到多效唑抗性蛋白基因（PRE6-like），通過同源轉(zhuǎn)化蘋果愈傷及異源轉(zhuǎn)化擬南芥證明MdPRE6-like基因能夠激活花青素生物合成及花青素合成通路結(jié)構(gòu)基因的表達。研究結(jié)果為MdPRE6-like基因參與蘋果種質(zhì)的創(chuàng)新奠定了基礎(chǔ)。

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