趙成瑩，袁 靜，王寶菊，劉恒煜，劉承軍，周廣馳，李志強(qiáng)，劉 曉

1 聊城市東昌府區(qū)畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心，山東聊城 2520002 聊城市畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心，山東聊城 252000

0 引言

乳品含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等多種營養(yǎng)物質(zhì)，是人體獲得優(yōu)質(zhì)能量的重要來源。不同動(dòng)物來源的乳具有一定差異，如駱駝乳、羊乳、馬乳、驢乳等特種乳價(jià)格相比普通牛乳更昂貴[1]。這些乳的價(jià)格昂貴除了產(chǎn)量低外，還有其他高營養(yǎng)價(jià)值的原因，例如駱駝乳因?yàn)椴缓氯榍虻鞍祝伙柡椭舅岜壤?，且富含較多營養(yǎng)物質(zhì)，所以具有較高市場(chǎng)價(jià)值，原料價(jià)格達(dá)50 元/kg，是牛奶的10倍，且純駱駝粉售價(jià)通常達(dá)1 200～1 900 元/kg[2]。為謀取更大利潤，有的商家為降低成本，將牛乳摻入其他類乳中售賣。研究者對(duì)市售特種乳樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，33 份乳樣中摻假率高達(dá)48.48%，嚴(yán)重?cái)_亂市場(chǎng)[3]。國際藥典委員會(huì)的調(diào)查報(bào)告顯示，在25 種最容易摻假的食品成分中，乳成分摻假相關(guān)學(xué)術(shù)研究排第2，媒體相關(guān)報(bào)道排第7[4]。牛乳中含有超過30 種具有潛在致敏性的蛋白質(zhì)，也是世界衛(wèi)生組織認(rèn)定的過敏性食物之一。摻假產(chǎn)品出現(xiàn)，容易引發(fā)一些對(duì)牛乳過敏的人群過敏，還涉及某些特殊醫(yī)療要求和宗教信仰[5]。這種摻假不僅影響市場(chǎng)穩(wěn)定，還損害養(yǎng)殖人員的經(jīng)濟(jì)利益，危害消費(fèi)者身體，且不利于特種乳市場(chǎng)發(fā)展壯大。常規(guī)檢測(cè)手段很難對(duì)其檢測(cè)分辨，目前主要通過檢測(cè)其不同種屬來源的蛋白質(zhì)、脂肪酸和核酸進(jìn)行區(qū)分，但都具有弊端。探究快速高效的新型檢測(cè)技術(shù)對(duì)促進(jìn)乳業(yè)發(fā)展具有重要意義。本文通過分析特種乳摻牛乳的現(xiàn)狀，綜合概述各檢測(cè)手段原理和優(yōu)缺點(diǎn)，為特種乳摻假牛乳檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供參考。

1 乳品摻假檢測(cè)技術(shù)

自2008年三鹿嬰幼兒奶粉事件開始，從最初往牛奶中摻水、淀粉、尿素、三聚氰胺、植脂末和水解動(dòng)植物蛋白，發(fā)展到往特種乳中摻牛乳，乳品摻假問題出現(xiàn)不同變化。目前根據(jù)檢測(cè)機(jī)理不同，主要分為以下3 種類型。

1.1 基于蛋白質(zhì)的摻假檢測(cè)技術(shù)

蛋白質(zhì)作為乳品中最主要的營養(yǎng)物質(zhì)，其數(shù)量和種類較多，通?；祀s在一起。常規(guī)的雙縮脲法和凱氏定氮法等，只能檢測(cè)其蛋白質(zhì)濃度，對(duì)具體的蛋白質(zhì)特性難以檢測(cè)，因此通常將蛋白質(zhì)分離后進(jìn)行定性定量的檢測(cè)或利用蛋白質(zhì)抗原抗體的特性進(jìn)行檢測(cè)[6]。

1.1.1 蛋白質(zhì)電泳技術(shù)

通過電泳將蛋白質(zhì)分離開，對(duì)不同類型乳中的差異性蛋白進(jìn)行檢測(cè)，主要有二維凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳和微流體芯片電泳等技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠電泳是利用聚丙烯酰胺的特殊網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，利用分子篩作用和電荷作用將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的過程[7]。Pesic等[8]建立聚丙烯酰胺電泳對(duì)山羊乳和綿羊乳中摻入的牛乳進(jìn)行定性和定量分析方法，通過對(duì)其α酪蛋白和β酪蛋白的條帶強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，有望用于乳摻假的快速檢測(cè)。阿力木·吾布力等[9]通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）電泳發(fā)現(xiàn)，與牛乳的乳清相比，山羊乳乳清缺乏乳鐵蛋白、駱駝乳缺乏β乳球蛋白、驢乳缺乏α乳白蛋白，可根據(jù)這一特性對(duì)不同特種乳中的摻假進(jìn)行檢測(cè)，并發(fā)現(xiàn)牛乳摻入山羊乳、駱駝乳和驢乳的體積有效鑒別比例分別為1∶4，1∶10和1∶10。毛細(xì)管電泳是在外部高壓電場(chǎng)作用下，利用石英毛細(xì)管對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離。田蘭等[10]利用毛細(xì)管電泳方法分離檢測(cè)乳品中的5 種乳源蛋白質(zhì)，并可測(cè)量乳粉和液態(tài)乳，具有較好的便捷性。Trimboli等[11]利用毛細(xì)管電泳方法檢測(cè)馬蘇里奶酪中摻入的牛乳成分，該方法具有較高線性標(biāo)準(zhǔn)，R2=0.968，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為1.18%。二維凝膠電泳是先利用等點(diǎn)聚焦技術(shù)，通過蛋白質(zhì)所帶電荷不同進(jìn)行初步分離，然后再進(jìn)行SDS-PAGE，利用蛋白質(zhì)電荷和分子量大小的不同進(jìn)行全面分離。向明霞等[12]利用雙向電泳方法對(duì)酪蛋白和乳清蛋白的同源性進(jìn)行檢測(cè)分析，為探索未知蛋白提供技術(shù)依據(jù)。微流體芯片電泳是將樣品放于電場(chǎng)下，使其在含有芯片的管道中泳動(dòng)，并將泳動(dòng)產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)為電信號(hào)后進(jìn)行分析。尹艷[13]對(duì)比SDS-PAGE和微流體芯片電泳的優(yōu)缺點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)微流體芯片電泳的檢測(cè)速度更快，準(zhǔn)確性更高。

1.1.2 蛋白質(zhì)色譜檢測(cè)技術(shù)

液相色譜技術(shù)也是常用于分離、鑒定和定量乳中組分的分析技術(shù)之一，主要通過將樣品混合物送入色譜柱中，根據(jù)不同組分的穿過速度以及與色譜柱的相互作用而分離[14]。李玲玉等[15]以牛乳中的β乳球蛋白為標(biāo)記物，利用液相色譜技術(shù)對(duì)駝乳中摻入的牛乳進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該方法具有較高的靈敏度，且在鮮乳、巴氏殺菌乳和乳粉中的檢出限分別為2%、3%和5%，并利用該方法對(duì)10 種市售駝乳粉進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中4 種存在摻假。Ferreira等[16]同樣以β乳球蛋白為標(biāo)記物，建立反相高效液相方法，測(cè)定并檢測(cè)牛乳和羊乳的混合乳，發(fā)現(xiàn)可在5%～95%的濃度范圍內(nèi)檢測(cè)不同乳種。Yang等[17]利用液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)乳中摻入的植物性蛋白進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)摻入植物蛋白的乳和正常牛乳之間具有不同多肽的保留峰，通過主成分分析后能用于區(qū)分摻假乳。Guarino等[18]利用液相色譜-電噴霧質(zhì)譜技術(shù)分析山羊奶奶酪和牛奶奶酪多肽的區(qū)別，當(dāng)山羊奶奶酪中牛乳占比超過50%或牛奶奶酪中羊乳超過2%時(shí)，均可檢測(cè)出來。杜文博[19]通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)15 份羊奶粉中共有的正己醛、庚烯醛等揮發(fā)性特征風(fēng)味物質(zhì)，并作為參照物用于檢測(cè)羊乳中摻入牛乳的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)隨著牛乳摻入增多，揮發(fā)性特征風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)量越少。

1.1.3 近紅外光譜檢測(cè)技術(shù)

近紅外光譜可檢測(cè)出被掃描樣品混合物的組成和相關(guān)有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)。Pereira等[20]利用近紅外光譜和偏最小二乘法對(duì)羊乳中的牛乳摻假進(jìn)行鑒定和定量分析，發(fā)現(xiàn)該方法能鑒別羊乳中1%的牛乳組分。鄒婷婷等[21]通過近紅外光譜對(duì)摻了牛乳的羊乳進(jìn)行檢測(cè)，建立分析模型，分析發(fā)現(xiàn)該模型能對(duì)羊乳粉中0.1～0.3 ng的牛乳粉進(jìn)行檢測(cè)。劉永峰等[22]建立牛奶中尿素氮的近紅外檢測(cè)模型，通過目標(biāo)函數(shù)法對(duì)其效果進(jìn)行評(píng)定發(fā)現(xiàn)，其相關(guān)系數(shù)能達(dá)0.986 4，定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)差為0.238，說明該方法具有較好適用性和準(zhǔn)確性。

1.1.4 蛋白質(zhì)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

免疫球蛋白G（IgG）是1 種重要免疫因子，能在乳中穩(wěn)定存在，具有一定的物種特異性，適用于不同乳之間的摻假檢測(cè)。楊潔等[23]根據(jù)駝乳和牛乳中蛋白種類和組成差異，通過定性檢測(cè)駝乳源的α乳白蛋白、αs1酪蛋白、牛源性β乳球蛋白和κ酪蛋白，建立1 種檢測(cè)駝乳中摻入牛乳的間接酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，具有前處理簡單、過程快捷方便的特點(diǎn)。吉日木圖等[24]利用駝乳中的特異性重鏈抗體IgG3為目標(biāo)蛋白，快速檢測(cè)駝乳中摻入其他特種乳的方法，具有檢測(cè)效果好、靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)。王士峰等[25]利用牛β-酪蛋白免疫小鼠，制備單克隆抗體3B9能特異性識(shí)別牛乳酪蛋白，并利用該方法檢測(cè)羊乳中摻入的牛乳，檢測(cè)范圍2.68～3.21 μg/mL， R2=0.996 6。薛海燕等[26]選擇κ酪蛋白為目標(biāo)蛋白，以兔血清IgG和雞卵黃抗體IgY為檢測(cè)抗體，建立牛乳摻假ELISA定量方法。當(dāng)κ酪蛋白為0.098～3.125 mg/L時(shí)，具有良好線性關(guān)系。Song等[27]以免疫磁珠為固相，β酪蛋白單克隆抗體吸附于免疫磁珠上作為捕捉探針，以辣根過氧化物酶作為檢測(cè)探針，檢測(cè)牛乳中的β酪蛋白。該方法的最低檢測(cè)限能達(dá)0.4 μg/mL，30 min內(nèi)可完成檢測(cè)。張世偉等[28]通過雙抗體夾心方法檢測(cè)羊乳和水牛乳中摻偽牛乳，靈敏度能達(dá)0.1 μg/mL，檢測(cè)時(shí)間1 h。

1.2 基于核酸的摻假檢測(cè)技術(shù)

乳中除含較多營養(yǎng)物質(zhì)外，還有一定數(shù)量的體細(xì)胞，因此可提取其中的DNA作為摻假檢測(cè)指標(biāo)。由于乳中存在DNA含量較低，通常利用PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)目標(biāo)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增快速檢測(cè)。Dalmasso等[29]以牛乳中的Cytb為靶基因，設(shè)計(jì)特異性較強(qiáng)的引物和探針，對(duì)摻入牛乳進(jìn)行快速檢測(cè)，具有較高靈敏度，最低檢出限能達(dá)2%。楊艷歌等[30]針對(duì)8 種不同乳設(shè)計(jì)不同特異性引物，通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該方法能區(qū)分不同種的乳樣，檢出限能達(dá)0.1%，絕對(duì)靈敏度達(dá)0.1～5 pg/μL。黎穎等[31]通過雙重PCR對(duì)羊乳中摻入的牛乳進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)牛乳摻入比例為1%，在酸奶中摻入比例為10%時(shí)，均能被準(zhǔn)確檢測(cè)出來。Caterina等[32]通過熒光RT-PCR技術(shù)，建立能快速同時(shí)鑒定奶牛乳、羊乳、水牛乳等不同種屬乳源的檢測(cè)方法。總之，PCR在乳品真實(shí)性檢測(cè)中具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn)，但經(jīng)過高溫殺菌或其他加工工藝處理后的乳中DNA會(huì)不同程度破壞，對(duì)該方法的實(shí)用性有一定影響。

1.3 基于脂肪酸的摻假檢測(cè)技術(shù)

氣相色譜技術(shù)可利用混合物不同組分的結(jié)構(gòu)差異，在兩相之間的滯留時(shí)間不同進(jìn)行分離鑒定。如羊乳中的長鏈脂肪酸C16：0和C18：0、不飽和脂肪酸C18：1和C18：3等脂肪酸的含量均低于牛乳，而短鏈脂肪酸C6：0、C8：0、C10：0和C12：0的含量則顯著高于牛乳，因此可根據(jù)該差異對(duì)乳品中的摻假進(jìn)行檢測(cè)[33]。許昀暉等[34]通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)6 種家畜乳中的脂肪進(jìn)行檢測(cè)，建立相應(yīng)脂肪指紋圖譜，根據(jù)脂肪類別判斷乳品種類，具有較好的實(shí)用價(jià)值。郭紫玥[35]通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)牛乳、羊乳和人乳中脂肪酸差異進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)其ARA、DHA和EPA這3 種多不飽和脂肪酸存在變化和差異，可在后續(xù)乳品加工與開發(fā)中根據(jù)該特性進(jìn)行加工優(yōu)化。

2 其他相關(guān)乳品檢測(cè)技術(shù)

除上述方法外，電子鼻、核磁共振等技術(shù)也廣泛用在乳品摻假檢測(cè)中。電子鼻可通過氣味檢測(cè)器對(duì)其中風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行檢測(cè)，并將其轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，集合相應(yīng)的定量分析方法進(jìn)行綜合分析。吳丹丹等[36]利用電子鼻對(duì)氣味特征的區(qū)別記錄分析，建立1 種分辨駝乳中摻入牛乳的檢測(cè)方法，最低檢測(cè)線能達(dá)1%。金嫘等[37]用電子鼻對(duì)混入羊乳中的牛乳進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行主成分分析和線性判別分析，發(fā)現(xiàn)電子鼻能有效對(duì)摻入其中的牛乳識(shí)別鑒定。高曉霞等[38]利用電子鼻技術(shù)對(duì)奶粉中摻入的豆粉、尿素以及植脂末等物質(zhì)分析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)電子鼻均能有效檢測(cè)出其中的摻假成分。核磁共振技術(shù)主要根據(jù)食品中蛋白質(zhì)、水分、脂肪等物質(zhì)中的氫核吸收電磁能，發(fā)生能級(jí)遷躍產(chǎn)生弛豫現(xiàn)象。苗志英等[39]采用1H質(zhì)子核磁共振對(duì)牛乳中摻入的尿素、水和蔗糖等物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，摻假物質(zhì)會(huì)與牛乳中的蛋白質(zhì)爭奪水分子，使1H增多導(dǎo)致T2張馳時(shí)間延長，發(fā)現(xiàn)隨摻假濃度增高而更明顯，從而判定摻假乳的成分和特性。斯仁達(dá)來[40]通過低場(chǎng)核磁共振技術(shù)對(duì)駝乳中摻入的牛乳進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)限均在10%。

3 總結(jié)

乳品摻假是食品安全中長期存在問題。保證乳品質(zhì)量安全，發(fā)展相應(yīng)的質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)方法十分重要。雖然液相色譜、近紅外光譜等技術(shù)能滿足目前摻假測(cè)試需求，但成本高、操作復(fù)雜等，未能普遍應(yīng)用。常規(guī)的電泳和PCR方法雖然準(zhǔn)確度較高，但無法滿足大批量快速檢測(cè)需求。開發(fā)靈敏度高、可操作性強(qiáng)、成本低的檢測(cè)方法十分重要。在上述多種檢測(cè)方法中，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)為基礎(chǔ)的檢測(cè)試劑盒具有較好發(fā)展?jié)摿Γ憬?、快速，操作性?qiáng)。只有對(duì)各種摻假檢測(cè)技術(shù)深入了解，加強(qiáng)其實(shí)用性和發(fā)展前景評(píng)測(cè)，才能保證乳品安全。