徐小娜 馬麗 鄧蓉 潘蘭瑩 歐陽云

【摘要】目的：優(yōu)化廣西鉤藤總黃酮的超聲波輔助提取工藝，并檢測其體外抗氧化活性。方法：采用UV法檢測鉤藤總黃酮含量；以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，采用正交設(shè)計法優(yōu)化鉤藤總黃酮的超聲波輔助提取工藝條件；利用DPPH法檢測乙醇提取物清除DPPH的活性。結(jié)果：采用超聲波輔助提取法提取兩次，超聲功率360 W，最佳提取工藝為60倍量60%乙醇、超聲提取30 min、提取溫度70℃；在0.05～0.25 mg/mL范圍內(nèi)，隨總黃酮提取物濃度的增加，提取物對DPPH的清除率增大；當(dāng)提取物濃度為0.25 mg/mL時，柳州、梧州、欽州、玉林和桂林等5個產(chǎn)地的鉤藤總黃酮對DPPH的清除率均在85%以上，分別為92.0%、91.6%、86.9%、90.8%、85.7%和97.3%。結(jié)論：該提取工藝穩(wěn)定可行，可作為鉤藤總黃酮的提取工藝；鉤藤黃酮醇提取物對DPPH具有清除作用，可為鉤藤黃酮的深入開發(fā)提供參考。

【關(guān)鍵詞】鉤藤；總黃酮；正交設(shè)計；含量測定；體外抗氧化

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.02.008

【基金項目】本文受廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項目（2023KY0527），桂林醫(yī)學(xué)院人才引進(jìn)科研項目（20501020028），桂林醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（S202110601112）資助。

Extraction Optimization by Orthogonal Design and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Guangxi Gambir Plant Rhynchophylla

XU Xiaona1，2， MA Li1， DENG Rong1， PAN Lanying1， OUYANG Yun1，2

（1.Guilin Medical University〔School of Public Health〕， Guilin 541199， China； 2.The Guangxi Key Laboratory of Environmental Exposomics and Entire Lifecycle Health， Guilin 541199， China）

Abstract： Objective： To optimize the ultrasonic assisted extraction process of total flavonoids from Guangxi gambir plant and detect their in vitro antioxidant activity. Method： UV method was used to detect the total flavonoid content in gambir plant； Using the extraction rate of total flavonoids as the evaluation index， the orthogonal design method was used to optimize the ultrasonic assisted extraction process conditions of total flavonoids in Hook Vine； Use DPPH method to detect the activity of ethanol extract in clearing DPPH. Result： The ultrasound assisted extraction method was used twice， with an ultrasound power of 360 W. The optimal extraction process was 60 times the amount of 60% ethanol， ultrasound extraction for 30 minutes， and extraction temperature of 70℃； Within the range of 0.05～0.25 mg/mL， as the concentration of total flavonoid extract increases， the clearance rate of the extract towards DPPH increases； When the concentration of the extract was 0.25 mg/mL， the total flavonoids of gambir plant from five production areas including Liuzhou， Wuzhou， Qinzhou， Yulin， and Guilin all had a clearance rate of over 85% for DPPH， which were 92.0%， 91.6%， 86.9%， 90.8%， 85.7%， and 97.3%， respectively. Conclusion： The extraction process is stable and feasible， and can be used as the extraction process for the total flavonoids of gambir plant； The alcohol extract of Houttuynia cordata has a clearing effect on DPPH， which can provide reference for the in-depth development of Houttuynia cordata flavonoids.

Keywords： gambir plant； total flavonoids； orthogonal design； determination； in vitro antioxidant properties

鉤藤為茜草科鉤藤植物，主要生長在我國南方地區(qū)，屬中醫(yī)常用藥，具有清熱平肝、息風(fēng)定驚、降壓等功效，用于治療頭痛眩暈、感冒夾驚、驚癇抽搐、高熱驚厥、妊娠子癇等癥。鉤藤干燥根莖為廣西的特色藥，其主要含有生物堿、木脂素、三萜、黃酮、香豆素等化學(xué)成分。目前，有關(guān)鉤藤生物堿成分的研究報道較多，而關(guān)于鉤藤總黃酮的研究報道較少。黃酮是一類極為重要的藥理活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等豐富的生物學(xué)活性。本文以鉤藤總黃酮提取率為考察指標(biāo)，采用正交設(shè)計法對其超聲波醇提工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立鉤藤總黃酮的可見光度測定方法，同時對其體外抗氧化活性進(jìn)行研究，為鉤藤黃酮的深入開發(fā)提供參考。

1實驗

1.1材料、試劑與儀器

鉤藤樣品于2021年11月分別采集于廣西桂林、柳州、玉林、梧州、欽州等地。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號MUST-22081108），成都曼斯特生物科技有限公司；DPPH試劑（1，1-二苯基-2-苦基肼），純度> 97.0%，京東化成工業(yè)株式會社；維生素C（抗壞血酸）（批號1028NO34），純度99.0%，北京索萊寶科技有限公司；實驗所用其他試劑均為分析純；水為怡寶純凈水。

UV-2700型紫外-可見分光光度計，日本島津；YZ-360DB型數(shù)控超聲波清洗器，上海越眾儀器設(shè)備有限公司。

1.2方法

1.2.1溶液的配制

1）標(biāo)準(zhǔn)溶液

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，加無水乙醇，超聲溶解后，定容至刻度，配制成0.2000 mg/mL的蘆丁應(yīng)用液。

2）樣品溶液

稱取0.5 g鉤藤粗粉，按料液比1∶60（g∶mL）加入60%乙醇，超聲提取30 min，過濾；殘余鉤藤渣重復(fù)上述操作，合并濾液，用60%乙醇補足；取25 mL，用蒸餾水補足至50 mL。

3）DPPH工作液

精密稱取3.9 mg DPPH，用無水乙醇溶解，配制成0.1 mmol/L的DPPH貯備液，避光保存，備用。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于25 mL具塞比色管中，各加無水乙醇至10 mL。采用亞硝酸鈉比色法顯色，先加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻靜置6 min；再加入10% Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻靜置6 min；最后加4%NaOH溶液8 mL，混勻后靜置20 min，以未加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的試液作空白，測定各溶液在510 nm波長處吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3樣品測定

分別吸取適量來自廣西桂林、柳州、玉林、梧州和欽州的鉤藤總黃酮提取物溶液，按1.2.2給出的方法測定吸光度，依據(jù)線性回歸方程計算5個產(chǎn)地鉤藤中總黃酮的含量。

1.2.4抗氧化活性評價：PPH自由基清除實驗

參考文獻(xiàn)配制0.4 mg/mL 5種不同產(chǎn)地鉤藤總黃酮提取液，分別稀釋成0.05、0.08、0.11、0.13、0.16、0.19、0.21、0.24、0.27、0.30 mg/mL的樣品溶液。取3 mL各濃度的樣品溶液，加入2 mL的0.1 mmol/LDPPH自由基溶液，室溫下避光靜置，30 min后測定溶液在510 nm波長處吸光度，按公式（1）計算DPPH自由基清除率。

2方法與結(jié)果

2.1總黃酮含量測定

2.1.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

參考文獻(xiàn)，采用NaNO2-Al（NO3）3比色法測定總黃酮含量?；貧w方程為A=5.2114c-0.0029，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，表明在0.020～0.100 mg/mL范圍內(nèi)蘆丁濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

2.1.2方法學(xué)考察

1）重復(fù)性試驗

平行制備高、中、低3個不同濃度的蘆丁對照品溶液進(jìn)行重復(fù)性試驗，按NaNO2-Al（NO3）3比色法進(jìn)行檢測，計算RSD分別為0.37%、0.38%和0.28%（n=6）。

2）穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，在0、20、40、80、100、120 min按NaNO2-Al（NO3）3比色法進(jìn)行檢測，吸光度值的RSD為0.33%（n=6），表明供試品溶液至少在120 min內(nèi)穩(wěn)定。

3）加樣回收試驗

精密稱定9份已知含量的鉤藤藥材，分別按低、中、高3個水平精密加入蘆丁適量，按1.2.2給出的方法顯色操作，測定吸光度，計算出平均回收率為98.51%，RSD為1.52%（n=6）。

2.2正交試驗優(yōu)選鉤藤提取工藝

2.2.1正交試驗

以乙醇溶液為提取溶劑，考察乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間4個影響因素，采用L9（34）正交設(shè)計，因素水平表見表1，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，正交試驗方差分析見表3。

由表2可知，影響鉤藤總黃酮提取率因素的強弱順序為：提取時間>提取溫度>料液比>乙醇濃度；最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇濃度60%、料液比1∶60、提取溫度70℃、提取時間30 min。

由表3可知，提取時間對鉤藤總黃酮提取效率影響較顯著（P<0.05），乙醇濃度、料液比以及提取溫度對鉤藤總黃酮提取效率影響均不顯著（P>0.05）。

2.2.2驗證試驗

對正交試驗優(yōu)化的鉤藤總黃酮提取工藝進(jìn)行驗證，設(shè)計3次平行試驗，檢查預(yù)測的鉤藤總黃酮新提取工藝的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。精確稱取鉤藤粉末0.50 g（精確至0.0001 g）3份，測得鉤藤總黃酮提取率分別為7.195%、7.251%和7.208%，平均值為7.218%，高于表2中的總黃酮提取率，說明本工藝條件合理，穩(wěn)定性較好。

2.3鉤藤總黃酮提取物對DPPH自由基的清除效果

按1.2.4給出的方法檢測柳州、梧州、欽州、玉林和桂林等不同廣西產(chǎn)地鉤藤總黃酮對DPPH的清除作用，結(jié)果見表4。

由表4可知，采用最佳提取工藝提取得到的鉤藤總黃酮提取物對DPPH自由基有較好的清除效果；對同一產(chǎn)地鉤藤總黃酮提取物而言，在0.05～0.25 mg/mL范圍內(nèi)，隨提取物總黃酮濃度的增加，對DPPH自由基的清除率也隨之增大；相同濃度不同產(chǎn)地的鉤藤總黃酮提取物對DPPH自由基的清除效果各不相同，柳州、梧州和欽州的清除效果較強，玉林和桂林的清除效果較弱；當(dāng)鉤藤總黃酮提取物濃度增至0.25 mg/mL時，柳州、梧州、欽州、玉林和桂林等5個產(chǎn)地的鉤藤總黃酮提取物對DPPH自由基的清除率均在85%以上，分別為92.0%、91.6%、86.9%、90.8%、85.7%和97.3%。

3結(jié)束語

本文以鉤藤總黃酮含量為評價指標(biāo)，采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化廣西鉤藤總黃酮的超聲波醇提工藝，最佳提取工藝條件為：超聲輔助提取兩次，最佳工藝為60倍量6 %乙醇、超聲時間30 min、提取溫度70℃，提取工藝穩(wěn)定可行。同時，利用DPPH自由基法檢測鉤藤總黃酮醇提物清除自由基的活性，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地不同濃度的廣西鉤藤總黃酮醇提物對DPPH自由基均具有一定的清除作用。研究結(jié)果可為鉤藤黃酮的深入開發(fā)提供參考。

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【作者簡介】

徐小娜，女，1974年出生，副教授，博士，研究方向為復(fù)雜體系多組分成分分離分析。

通信作者：歐陽云，女，1986年出生，講師，研究方向為食品藥品分析。電話：17775832080。

（編輯：侯睿琪）