蘇葳藝 楊慧杰 徐麗佳

【摘要】本研究以固相萃取技術(shù)作為樣品前處理方法，通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)處理完的樣品進(jìn)行定性、定量檢測，建立了同時(shí)測定牛奶中辛硫磷、敵敵畏、敵百蟲、滅線磷、滅多威、殺線威和乙酰甲胺磷7種殺蟲劑殘留量的檢測方法。結(jié)果表明，7種殺蟲劑辛硫磷的檢出限為2.0μg/L，定量限為5.0μg/L；殺線威的檢出限為1.0μg/L，定量限為3.0μg/L；敵敵畏、敵百蟲、滅線磷、滅多威和乙酰甲胺磷的檢出限為0.5μg/L，定量限為2.0μg/L；在2.0～500.0μg/kg濃度范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，R>0.999，平均回收率為70%～95%（RSD<10%，n=6）。

【關(guān)鍵詞】牛奶；殺蟲劑；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；檢測

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.02.001

Simultaneous Determination of 7 Insecticides in Milk by Ultra-High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

SU Weiyi， YANG Huijie， XU Lijia

（Liaoning Inspection，Examination & Certification Centre〔Liaoning Lnstitute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Shenyang 110036， China）

Abstract： Study by using solid phase extraction technique as a pretreatment method， a tandem mass spectrometry on processed samples were detected qualitatively and quantitatively by ultra-high performance liquid chromatography analysis method to set up the milk of Phoxim， dichlorvos， trichlorfon， ethoprophos， methomyl， oxamyl and acephate.The detection limit of phoxim is 2.0μg/L， the quantitative limit of g/Lis 5.0μg/L， the detection limit oxamyl is 1.0μg/L， the quantitative limit of g/Lis 3.0μg/L， the detection limit for dichlorvos， trichlorfon， ethoprophos， methomyl， and acephate is 0.5μg/L， the quantitative limit of g/L is 2.0μg/L in the concentration of 2.0～500.0μg/L range and peak area were showed good linear relationship， R>0.999， the average recovery rate of 70%～95% （RSD<10%， n=6）.

Keywords： milk； insecticide； UPLC-MS/MS； detection

殺蟲劑污染是影響奶源安全性的因素之一。殺蟲劑主要通過以下幾種途徑殘留在牛奶中：一是奶牛食用含有殺蟲劑殘留的飼料后通過食物鏈在體內(nèi)蓄積；二是夏季收購站為防止蚊蟲使用殺蟲劑，造成奶源污染；三是奶牛養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖場為了驅(qū)除蚊蟲噴灑殺蟲劑。因污染途徑多樣，牛奶中可能存在的殺蟲劑種類也多樣。

本研究以較為常用的辛硫磷、敵敵畏、敵百蟲、滅線磷、滅多威、殺線威和乙酰甲胺磷7種殺蟲劑為研究對(duì)象，采用固相萃取技術(shù)、色譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，建立一種同時(shí)檢測牛奶中7種殺蟲劑殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測方法，為有效保障牛奶的質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐。

1試驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器設(shè)備

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（ACQuITY-Quattro Premier XE，美國Waters公司）；分析天平AL104-IC（Max：110 g，e=0.001 g，Min：0.01 g，d=0.0001 g）；HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm）；振蕩器；離心機(jī)（低溫高速離心機(jī)CF 16RXⅡ）；氮吹儀（N-EVAP 112）；渦旋混合器；固相萃取裝置。

1.1.2試劑

乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；正己烷（色譜純）；乙酸乙酯（色譜純）；甲酸（色譜純）；丙酮（高效液相色譜淋洗劑）；無水乙醚（分析純）；無水硫酸鎂（分析純）；微孔過濾膜（0.2μm）；HLB固相萃取柱（6 cc/200 mg）；C18固相萃取柱（6 cc/500 mg）；FLORISIL固相萃取柱（6 mL/500 mg）；PSA固相萃取柱（6 mL/500 mg）；Alumina-N固相萃取柱（6 mL/2 g）。

1.1.3標(biāo)準(zhǔn)品

敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品（100μg/mL，1.2 mL丙酮溶劑）；敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)品（100μg/mL，1.2 mL丙酮溶劑）；辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品（100μg/mL，1.2 mL甲醇溶劑）；滅線磷標(biāo)準(zhǔn)品（100μg/mL，1.2 mL丙酮溶劑）；滅多威標(biāo)準(zhǔn)品（100μg/mL，1.2 mL丙酮溶劑）；殺線威標(biāo)準(zhǔn)品（100μg/mL，1.2 mL甲醇溶劑）；乙酰甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)品（100μg/mL，1.2 mL丙酮溶劑）。

1.2溶液配制

單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：分別準(zhǔn)確移取500μL敵敵畏、敵百蟲、辛硫磷、滅線磷、滅多威、殺線威、乙酰甲胺磷對(duì)照品、氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品、溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品和氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照品于50 mL容量瓶中，加入0.2%甲酸水溶液定容至刻度，混勻后制成濃度為100μg/L的對(duì)照品工作液，放置于2～8℃避光存放。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：準(zhǔn)確移取500μL敵敵畏、敵百蟲、辛硫磷、滅線磷、滅多威、殺線威、乙酰甲胺磷、氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品、溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品和氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照品于50 mL容量瓶中，用0.2%甲酸水溶液定容，配制成濃度100μg/L的工作液，放置于2～8℃避光存放。

1.3儀器工作條件

1.3.1色譜條件

HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）。流速：0.3 mL/min。進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相：A相（0.2%甲酸水溶液），B相（甲醇）。洗脫條件：0～1 min，95%A∶5%B；1～1.5 min，從95%A∶5%B線性變化至60%A∶40%B；1.5～2.5 min，從60%A∶40%B線性變化至30%A∶70%B；2.5～3.5 min，從30%A∶70%B線性變化至10%A∶90%B；3.5～4 min，保持10%A∶90%B；4～4.1 min，從10%A∶90%B線性變化至95%A∶5%B；4.1～6 min，維持95%A∶5%B。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；電離方式：正離子（ESI+）；錐孔氣流速：50 L/h；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；源溫：120℃；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；霧化氣流速：650 L/h；霧化溫度：350℃。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.4前處理方法

準(zhǔn)確量取5 mL試樣于50 mL離心管內(nèi)，加入10 mL乙腈，震蕩5 min，超聲10 min。以7000 r/min高速離心10 min。靜置30 s后取5 mL上清于10 mL離心管中，40℃氮?dú)獯蹈?，?.5 mL甲醇和2 mL水溶解備用。依次向HLB固相萃取柱中加入3 mL甲醇和3 mL水進(jìn)行活化，將氮吹復(fù)溶后的樣品全部加入活化完畢的HLB固相萃取小柱中，過柱完畢后用6 mL水溶液、6 mL甲醇水（2∶3）進(jìn)行淋洗，最后用6 mL甲醇溶液洗脫。洗脫后用40℃氮?dú)獯蹈?，吹干后?.2 %甲酸水：甲醇（1∶1）溶液1 mL復(fù)溶，過微孔濾膜后上機(jī)檢測。

2結(jié)果與分析

2.1樣品提取條件的優(yōu)化

在樣品提取條件的選擇上本研究設(shè)計(jì)了兩種方案：方案一為采用純乙腈作為提取溶劑，取5 mL樣品加入10 mL乙腈和5 g硫酸鎂震蕩超聲后，在4℃下以7000 r/min離心10 min，靜置分層取5 mL上清，氮吹干待過固相萃取小柱；方案二為采用甲醇-乙酸乙酯（1∶1）溶液作為提取溶劑，取5 mL樣品加入10 mL甲醇-乙酸乙酯（1∶1）震蕩超聲后，以7000 r/min離心10 min，靜置分層后去5 mL上清液，氮吹干待過固相萃取小柱。對(duì)7種殺蟲劑進(jìn)行添加回收率測定，測定結(jié)果顯示方案一回收率高，而方案二回收率只有20%～30%，因此采用乙腈作為提取試劑。

2.2樣品凈化條件的優(yōu)化

本研究共選用五種固相萃取小柱形成了五種凈化方案：方案一采用C18固相萃取柱，用3 mL甲醇、3 mL水進(jìn)行活化小柱，然后將氮吹后的樣品用3 mL的50%甲醇水溶解過柱，3 mL 50%甲醇水淋洗，最后用6 mL 95%的氨化甲醇進(jìn)行洗脫；方案二采用Alumina-N（中性氧化鋁）固相萃取柱，小柱用4 mL正己烷-乙酸乙酯（95∶5）進(jìn)行活化，然后將氮吹后的樣品用3 mL丙酮-乙醚（2∶8）進(jìn)行溶解過柱，最后用6 mL正己烷-乙酸乙酯（95∶5）洗脫收集；方案三采用FLORISIL（佛羅里硅土）固相萃取柱，小柱用4 mL正己烷-乙酸乙酯（95∶5）進(jìn)行活化，然后將氮吹后的樣品用3 mL正己烷-乙酸乙酯（95∶5）進(jìn)行溶解過柱，直接收集過柱液；方案四采用PSA（N-丙基乙二胺）固相萃取柱，小柱用4 mL丙酮進(jìn)行活化，然后將氮吹后的樣品用3 mL丙酮進(jìn)行溶解過柱，直接收集過柱液；方案五采用HLB固相萃取柱，用3 mL甲醇、3 mL水進(jìn)行活化小柱，然后將氮吹后的樣品用1.5 mL的甲醇、2 mL水溶解過柱，3 mL水、3 mL甲醇水（2∶3）淋洗，最后用6 mL的甲醇進(jìn)行洗脫。

上機(jī)結(jié)果顯示，方案一、二、三不能將各種殺蟲劑很好地分離提取出來，只能分離提取出部分殺蟲劑，因此棄用。將方案四和方案五處理后的樣品上機(jī)結(jié)果對(duì)比得出方案五的殺蟲劑圖譜相應(yīng)峰面積更大，響應(yīng)更強(qiáng)，因此選用HLB小柱作為最終前處理小柱。

2.3質(zhì)譜方法優(yōu)化

將各個(gè)單獨(dú)配置好的100μg/L標(biāo)準(zhǔn)品工作液按照10μL/min的速度分別注入質(zhì)譜中，采用全掃描模式，進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，得到辛硫磷母離子；再進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到辛硫磷母離子對(duì)應(yīng)的碎片離子，取豐度較高的2個(gè)子離子，其中1個(gè)作為定量離子，另外1個(gè)作為定性離子；根據(jù)選擇的定量離子和定性離子進(jìn)行碰撞能量的優(yōu)化，使定量離子的響應(yīng)達(dá)到最佳，即建立了辛硫磷MRM方法；同法建立找出敵敵畏、敵百蟲、滅線磷、滅多威、殺線威和乙酰甲胺磷的定性定量離子及其對(duì)應(yīng)的條件。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

7種殺蟲劑中辛硫磷的檢出限為2.0μg/L，定量限為5.0μg/L；殺線威的檢出限為1.0μg/L，定量限為3.0μg/L；敵敵畏、敵百蟲、滅線磷、滅多威和乙酰甲胺磷的檢出限為0.5μg/L，定量限為2.0μg/L。濃度范圍在2.0～500μg/L時(shí)，線性良好，相關(guān)系數(shù)在0.999以上，具體見表2。

2.5添加回收

7種殺蟲劑在5.0μg/L、20.0μg/L和80μg/L濃度添加下回收率在70%～95%，且RSD低于10%，具體見表3。

3結(jié)束語

本研究建立了應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定牛奶中辛硫磷、敵敵畏、敵百蟲、滅線磷、滅多威、殺線威和乙酰甲胺磷7種殺蟲劑殘留量的檢測方法。與其他檢測殺蟲劑的方法相比，該方法創(chuàng)新采用HLB固相萃取小柱作為前處理凈化方法，更便于牛奶樣品的分離、純化和濃縮。該方法的高通量及較低的檢出限、定量限等優(yōu)勢也為保障牛奶的質(zhì)量安全提供了技術(shù)支撐。

【參考文獻(xiàn)】

[1]洪華，闞曉麗，張茜，等.QuEChERS-HPLC法同時(shí)快速檢測水溶肥中10種常見違禁添加殺蟲劑[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（18）：191-194.

[2]潘瑛潔，孟祥河，錢園鳳，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定茶鮮葉中79種農(nóng)藥殘留[J].茶葉科學(xué)，2023，43（2）：250-262.

【作者簡介】

蘇葳藝，男，1987年出生，獸醫(yī)師，碩士，研究方向?yàn)樯r乳檢測方法及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制修訂，水產(chǎn)品檢測方法研發(fā)及推廣應(yīng)用。

（編輯：李鈺雙）