劉維龍 胡波 范志宇 魏后軍 仇汝龍 宋艷華 陳萌萌 葛雷 熊富強(qiáng) 王芳

摘要： ?本研究將A3C單抗識(shí)別的VP60蛋白NTA區(qū)域作為識(shí)別標(biāo)記，設(shè)計(jì)一系列編碼VP60 NTA區(qū)域重疊多肽的基因序列并連接于pGEX-4T-1載體，確定A3C單抗識(shí)別的精確表位。然后構(gòu)建重組質(zhì)粒Bacmid- ?VP60△A3C ?，將Bacmid- ?VP60△A3C ?轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，得到重組桿狀病毒rBac- ?VP60△A3C ?。RT-PCR、HA、IFA和Western Blot鑒定結(jié)果表明，重組蛋白VP60△A3C在Sf9細(xì)胞中高效表達(dá)，電鏡觀察顯示其形態(tài)和結(jié)構(gòu)與兔出血癥病毒VP60蛋白類似。將重組蛋白VP60△A3C以每只200 μg免疫2月齡RHDV血清陰性的新西蘭兔，免疫后14 d，以兔出血癥病毒W(wǎng)F株攻毒新西蘭兔。結(jié)果表明，免疫組無(wú)死亡，而對(duì)照組全部死亡。本研究結(jié)果為制備表位缺失的兔出血癥亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： ?兔出血癥病毒； VP60蛋白； B細(xì)胞表位； 免疫原性

中圖分類號(hào)： ?S855.3 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ???文章編號(hào)： ?1000-4440（2024）03-0508-06

Expression of rabbit hemorrhagic disease virus VP60 protein with B cell epitope deletion in N terminus and its immunogenicity in rabbit

LIU Wei-long1，2， HU Bo1，3， FAN Zhi-yu1，2，3， WEI Hou-jun1，3， QIU Ru-long1，3， SONG Yan-hua1，3， CHEN Meng-meng1，3， GE Lei1，3， XIONG Fu-qiang3，4， WANG Fang1，2，3，4

（1.Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory for Veterinary Bio-Product Engineering， Ministry of Agriculture， Nanjing 210014， China； 2.Xizang Agricultural and Animal Husbandry University， Linzhi 860000， China； 3.GuoTai （Taizhou） Center of Technology Innovation for Veterinary Biologicals， Taizhou 225300， China； 4.College of Veterinary Medicine， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract： ?This study used the NTA region of the VP60 protein recognized by A3C monoclonal antibody as a recognition marker， designed a series of gene sequences encoding overlapping peptides in the VP60 NTA region， and connected them to the pGEX-4T-1 vector to determine the precise epitopes recognized by A3C monoclonal antibody. Then recombinant plasmid Bacmid- ?VP60△A3C ??was constructed. Bacmid- ?VP60△A3C ??was transfected into Sf9 insect cells， and recombinant baculovirus rBac- ?VP60△A3C ??was obtained. The identification results of RT-PCR， HA， IFA， and Western blot showed that the recombinant protein VP60△A3C was highly expressed in Sf9 cells. Electron microscopy observation showed that its morphology and structure were similar to those of rabbit hemorrhagic disease virus VP60 protein. The 2-month-old RHDV serum negative New Zealand rabbits were immunized with recombinant protein VP60△A3C at a rate of 200 μg per rabbit， and New Zealand rabbits were challenged with rabbit hemorrhagic disease virus WF strain after 14 days. The results showed that there were no deaths in the immune group， while all deaths occurred in the control group. The results of this study lay the foundation for the development of epitope-deleted subunit vaccine of rabbit hemorrhagic disease.

Key words： ?rabbit hemorrhagic disease virus （RHDV）； VP60 protein； B cell epitope； immunogenicity

兔出血癥（Rabbit hemorrhagic disease， RHD）是由兔出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus， RHDV）引起的高發(fā)病率和死亡率的烈性傳染病[1]。RHDV分為GI.1（RHDV1）和GI.2（RHDV2）2種基因型，分別引起兔出血癥1型和兔出血癥2型，2種基因型病毒之間交叉保護(hù)性低[2-4]。自2020年GI.2型RHDV在中國(guó)出現(xiàn)以來(lái)[5]，2種基因型RHDV在中國(guó)處于共同流行態(tài)勢(shì)。GI.1型RHDV主要感染2月齡以上兔，幼兔感染后不發(fā)病，但可帶毒，并在群體傳播中發(fā)揮重要作用[6]，表明感染幼兔是該病重要的傳染源之一。

RHDV的衣殼蛋白（VP60）可以自組裝形成35～40 nm的病毒樣顆粒（VLPs）。同時(shí)，VP60可在機(jī)體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，是RHDV的主要免疫保護(hù)性抗原，也是宿主免疫防御 RHDV 的主要靶標(biāo)，在病毒診斷和國(guó)內(nèi)外疫苗設(shè)計(jì)中起重要作用[1]，但現(xiàn)有疫苗和抗體檢測(cè)方法均無(wú)法鑒別疫苗免疫和病毒感染。鑒于GI.1型RHDV感染幼兔的帶毒和病毒傳播特點(diǎn)，因此構(gòu)建一種基于VP60蛋白的表位標(biāo)記疫苗并配套相應(yīng)的表位抗體檢測(cè)技術(shù)用于感染兔群的檢測(cè)，是區(qū)分疫苗免疫和病毒感染的可行方案。前期我們發(fā)現(xiàn)A3C單抗識(shí)別的VP60蛋白N端B細(xì)胞表位具有強(qiáng)免疫原性但不具有中和活性，因此將該表位位點(diǎn)作為一種識(shí)別標(biāo)記，構(gòu)建一種A3C識(shí)別表位缺失的VP60蛋白，在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)并研究其VLPs形成能力，可為構(gòu)建兔出血癥表位缺失的標(biāo)記疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種和細(xì)胞 ?重組質(zhì)粒pFastbac1- ?VP60 ?（GI.1型 ?VP60 ?）、Sf9 昆蟲細(xì)胞、大腸桿菌 DH10 Bac 由本實(shí)驗(yàn)室保存； BL21（DE3）感受態(tài)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 ?DNA Marker DL 2 000、ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒、ECL顯色試劑盒、1.1×PCR mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，F(xiàn)BS購(gòu)自GIBCO公司，山羊抗小鼠FITC-IgG、山羊抗小鼠HRP-IgG購(gòu)自Biosharp生物科技公司，VP60單克隆抗體A3C、1D4由本實(shí)驗(yàn)室制備，Taq高保真酶、轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 3000和Grace培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)質(zhì)粒的合成 ?在前期模糊定位非中和單抗A3C識(shí)別VP60 NTA區(qū)域的基礎(chǔ)[7]上，設(shè)計(jì)一系列VP60 NTA區(qū)域重疊多肽的基因序列并連接于pGEX-4T-1載體（表1）。

1.2.2 單抗A3C識(shí)別表位的鑒定 ?將合成的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1- ?VP60 NTA1 ?、pGEX-4T-1- ?VP60 NTA2 ?、pGEX-4T-1- ?VP60 NTA3 ?、pGEX-4T-1- ?VP60 NTA4 ?分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，陽(yáng)性菌經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后獲得重組蛋白pGEX-4T-1-VP60 NTA1、pGEX-4T-1-VP60 NTA2、pGEX-4T-1-VP60 NTA3、pGEX-4T-1-VP60 NTA4，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂乳封閉后，以識(shí)別VP60 NTA區(qū)的單抗A3C為一抗，羊抗鼠HRP-IgG（1∶10 000）為二抗，進(jìn)行Western Blot鑒定，確定A3C單抗識(shí)別的精確表位。

1.2.3 引物合成 ?A3C識(shí)別表位缺失株構(gòu)建引物及一系列鑒定引物由北京擎科生物科技有限公司合成（表2）。

1.2.4 缺失A3C識(shí)別表位的重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 ?以本實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pFastbac1- ?VP60 ?為模板，以 ?VP60△A3C ?-F/ ?VP60△A3C ?-R引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增缺失A3C識(shí)別表位的 ?VP60 ?基因。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 7 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定，120 V電泳30 min后，回收PCR陽(yáng)性產(chǎn)物，使用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，用pFastBac-F/pFastBac-R引物進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序鑒定，獲得正確缺失A3C識(shí)別表位的桿狀病毒重組轉(zhuǎn)移載體pFastbac1- ?VP60△A3C ?。

1.2.5 缺失A3C識(shí)別表位的重組穿梭載體的構(gòu)建 ?將重組轉(zhuǎn)移載體pFastbac1- ?VP60△A3C ?轉(zhuǎn)化含有穿梭載體的大腸桿菌DH10Bac，使用藍(lán)白斑篩選法，將大腸桿菌DH10Bac涂布于含3種抗性的平板上（含50 μg/ml Kanamycin、7 μg/ml Gentamicin、10 μg/ml Tetracycline、100 μg/ml X-gal和40 μg/ml IPTG），37 ℃恒溫培養(yǎng)2 d后，挑取白色陽(yáng)性單菌落純化培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。以M13-F/M13-R進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得重組穿梭載體Bacmid- ?VP60△A3C ?。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 ?使用轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 3000將重組穿梭載體Bacmid- ?VP60△A3C ?轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，結(jié)束后每12 h觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞出現(xiàn)間隙增大、折光性增強(qiáng)、形態(tài)變圓等病變特征時(shí)收集細(xì)胞及其培養(yǎng)物，以1 000 r/min離心5 min收獲上清液即為rBac- ?VP60△A3C ?原液（F1代病毒）。

1.2.7 mRNA的檢測(cè) ?收集接種rBac- ?VP60△A3C ?的Sf9昆蟲細(xì)胞樣品，采用Trizol法提取感染細(xì)胞內(nèi)總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以 ?VP60 ?-F/ ?VP60 ?-R引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，鑒定mRNA的存在。PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min，然后進(jìn)入循環(huán)95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠120 V電泳30 min后，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。

1.2.8 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA） ?預(yù)先將Sf9細(xì)胞在24孔細(xì)胞板上培養(yǎng)至密度為85%～90%，每孔接種等量的重組桿狀病毒rBac- ?VP60△A3C ?，同時(shí)以野生型毒株感染Sf9 細(xì)胞作陰性對(duì)照。在感染Sf9細(xì)胞24 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌2次，加入提前-20 ℃冷藏的甲醇和丙酮混合成的固定液，4 ℃作用1 h；PBS洗滌3次，加入PBS稀釋的1D4單抗（1∶200），37 ℃孵育90 min，PBS洗滌3次后，加入PBS 1∶50倍稀釋的山羊抗小鼠FITC-IgG，黑暗條件下37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.9 SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè) ?將重組桿狀病毒rBac- ?VP60△A3C ?接種Sf9細(xì)胞，72 h后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次后，取上清液，等比例加入Loading buffer處理后進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，結(jié)束后將凝膠半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂乳37 ℃ 封閉2 h，PBST洗滌3次后，以1D4單抗（1∶1 000）為一抗，羊抗鼠HRP-IgG（1∶10 000）為二抗，進(jìn)行Western Blot鑒定。

1.2.10 血凝效價(jià)測(cè)定 ?參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 572-2016兔病毒性出血病血凝與血凝抑制試驗(yàn)方法[8]進(jìn)行。

1.2.11 電鏡觀察 ?對(duì)獲得的重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物以紅細(xì)胞吸附釋放法[9]進(jìn)行純化并超速離心，蛋白質(zhì)樣品VP60△A3C經(jīng)生理鹽水重懸后取少量置于銅網(wǎng)靜置2 min，加入2%磷鎢酸染液，利用透射電鏡觀察重組蛋白樣品并拍照。

1.2.12 免疫保護(hù)性研究 ?將純化的VP60△A3C蛋白稀釋至200 μg/ml，免疫兔出血癥病毒抗原和抗體均陰性的2月齡新西蘭兔5只，每只頸部皮下注射1 ml，同時(shí)以5只接種生理鹽水的新西蘭兔作為對(duì)照組。免疫后14 d，分別頸部皮下注射1 000 LD50的兔出血癥病毒，攻毒后7 d內(nèi)每12 h觀察試驗(yàn)兔并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 A3C單抗識(shí)別表位的鑒定

對(duì)VP60 NTA1、VP60 NTA2、VP60 NTA3、VP60 NTA4 4個(gè)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印PVDF膜后，以單抗A3C為一抗，羊抗鼠HRP-IgG為二抗進(jìn)行Western Blot鑒定，結(jié)果顯示，VP60 NTA1、VP60 NTA2和VP60 NTA4 3個(gè)蛋白有陽(yáng)性條帶，而VP60 NTA3無(wú)條帶（圖1），由此確定單抗A3C識(shí)別的精確氨基酸位點(diǎn)為DGMDPG，對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為GACGGCATGGATCCTGGT。

2.2 重組轉(zhuǎn)移載體和重組穿梭載體的鑒定

以重組質(zhì)粒pFastbac1- ?VP60 ?為模板擴(kuò)增得到缺失A3C識(shí)別表位的桿狀病毒重組轉(zhuǎn)移載體pFastbac1- ?VP60△A3C ?，大小約6 000 bp（圖2A）。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后將pFastbac1- ?VP60△A3C ?轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac，提取陽(yáng)性質(zhì)粒用引物M13-F/M13-R進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為4 000 bp，而陰性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為300 bp，表明成功獲得重組穿梭載體Bacmid- ?VP60△A3C ?（圖2B）。

2.3 RT-PCR鑒定重組病毒的表達(dá)

按Trizol法提取接種rBac- ?VP60△A3C ?的Sf9細(xì)胞總RNA，以 ?VP60 ?-F/ ?VP60 ?-R為引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，鑒定mRNA。結(jié)果顯示，出現(xiàn)大小約為 1 800 bp的電泳條帶（圖3），大小與目的基因近似，表明 ?VP60△A3C ?基因得到表達(dá)。

2.4 間接免疫熒光檢測(cè)（IFA）

將rBac- ?VP60△A3C ?感染Sf9細(xì)胞24 h后，以1D4單抗（1∶200）為一抗，羊抗鼠FITC-IgG（1∶50）為二抗進(jìn)行IFA檢測(cè)。結(jié)果顯示，感染rBac- ?VP60△A3C ?的Sf9細(xì)胞可見(jiàn)很強(qiáng)的特異性熒光，而陰性對(duì)照無(wú)特異性熒光出現(xiàn)（圖4），說(shuō)明VP60△A3C蛋白有效表達(dá)。

2.5 SDS-PAGE和Western-Blot鑒定

將rBac- ?VP60△A3C ?感染Sf9細(xì)胞72 h后，以1D4單抗（1∶1 000）為一抗，羊抗鼠HRP-IgG（1∶10 000）為二抗，進(jìn)行Western Blot鑒定。PVDF膜經(jīng)顯色后出現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量為6×104的條帶（圖5），與預(yù)期一致，結(jié)果表明VP60△A3C蛋白有效表達(dá)。

2.6 表達(dá)蛋白的血凝效價(jià)測(cè)定

將rBac- ?VP60△A3C ?感染Sf9細(xì)胞4 d后，以96孔“U”形血凝板對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行血凝效價(jià)測(cè)定。結(jié)果表明，VP60△A3C蛋白能凝集人1% O型紅細(xì)胞懸液，血凝效價(jià)為1∶4 096，表明VP60△A3C蛋白高效表達(dá)。

2.7 電鏡觀察

電鏡觀察結(jié)果表明，VP60△A3C蛋白可形成大小為35～40 nm、形態(tài)和結(jié)構(gòu)與兔出血癥病毒VP60蛋白類似的VLPs，說(shuō)明缺失A3C識(shí)別表位不影響VP60蛋白病毒樣顆粒的組裝（圖6）。

2.8 免疫原性檢測(cè)

將VP60△A3C蛋白進(jìn)行純化后免疫RHDV血清陰性的新西蘭兔，14 d后進(jìn)行攻毒，檢驗(yàn)重組蛋白對(duì)家兔的免疫保護(hù)作用。結(jié)果顯示，以紅細(xì)胞吸附釋放法獲得純化的VP60△A3C蛋白，經(jīng)蛋白質(zhì)定量后以每只200 μg的劑量免疫新西蘭兔，然后以RHDV WF株攻毒，免疫組家兔獲得100%保護(hù)，而注射生理鹽水的對(duì)照組家兔全部死亡（表3），表明VP60△A3C蛋白具有良好的免疫原性。

3 討 論

目前尚未建立天然RHDV的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，病毒難以在體外穩(wěn)定增殖，因此國(guó)內(nèi)外新型疫苗的研究主要將VP60蛋白作為RHDV的免疫保護(hù)性抗原分子。目前 ?VP60 ?已在桿狀病毒、酵母、大腸桿菌、乳酸桿菌、痘病毒等多種系統(tǒng)中表達(dá)并開展免疫原性研究[10-15]，且以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)研究較多。另外也有利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行以VP60為載體研究外源表位免疫原性的報(bào)道[16]。該系統(tǒng)表達(dá)效率較高，可以實(shí)現(xiàn)外源蛋白的全懸浮細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)，且已有商品化疫苗產(chǎn)品上市。

現(xiàn)有研究結(jié)果表明VP60蛋白可分為NTA區(qū)、S區(qū)和P區(qū)，NTA區(qū)位于VP60蛋白的N端[17]。VP60蛋白形成的VLPs結(jié)構(gòu)中，N端位于VLPs內(nèi)部，而C端位于外表面，是受體結(jié)合區(qū)域和中和表位所在區(qū)域[17]，且VP60氨基酸的一些改變并不影響VLPs的形成[16，18]。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)了VP60 N端存在一個(gè)免疫原性強(qiáng)但不具有中和活性的B細(xì)胞表位，由單抗A3C識(shí)別，并已進(jìn)行了模糊定位[7]。本研究在此基礎(chǔ)上首先精確定位了單抗A3C識(shí)別的B細(xì)胞表位，構(gòu)建了該表位缺失的重組桿狀病毒rBac- ?VP60△A3C ?，其感染Sf9細(xì)胞后表達(dá)的缺失A3C識(shí)別表位的VP60蛋白可自組裝成VLPs，表明該表位的缺失不影響病毒樣顆粒的形成。將表達(dá)蛋白純化后免疫新西蘭兔，可以完全保護(hù)家兔免受GI.1型強(qiáng)毒株的感染，表明表位缺失的VP60蛋白依然具有良好的免疫原性，是一種優(yōu)良的兔出血癥候選疫苗分子。

感染幼兔是GI.1型兔出血癥重要的傳染源之一，由于目前無(wú)法區(qū)分GI.1型疫苗免疫和病毒感染，因此難以在養(yǎng)殖兔群中完全清除被RHDV感染的幼兔。本研究構(gòu)建了基于表位缺失的VP60蛋白，可用于制備一種基于表位缺失的兔出血癥標(biāo)記疫苗，后續(xù)建立檢測(cè)該表位抗體的ELISA檢測(cè)技術(shù)，有望實(shí)現(xiàn)GI.1型兔出血癥疫苗免疫和病毒感染的鑒別，為兔出血癥的防控提供新的技術(shù)產(chǎn)品。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）