張蓉蓉 艾地云 張騰飛 等

摘要：從雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌C57-86中PCR擴(kuò)增出a毒素基因，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pGEXKG-a，并進(jìn)行核苷酸序列進(jìn)化分析。結(jié)果表明，雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌的a毒素基因與參考菌株strainAL08-16相似性較高，核苷酸同源性為97.7%。對重組菌株BL21/KG-a誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了SDS-PAGE分析，重組菌株BL21/KG-a可以高效地表達(dá)毒素蛋白質(zhì)；免疫試驗表明，表達(dá)產(chǎn)物免疫的SPF試驗雞可抵抗A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的攻擊。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌；a毒素；克隆表達(dá)；免疫原性

中圖分類號：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）20-5152-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.057

Molecular Cloning and Immunogenicity of the alpha-toxin of

Clostridium Perfringens Isolated from Poultry

ZHANG Rong-rong，AI Di-yun，ZHANG Teng-fei，LUO Qing-ping，WEN Guo-yuan，WANG Hong-Lin，

WANG Hong-cai，LUO Ling，SHAO Hua-bin

（Insitude of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Academy of Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of

Animal Embryo and Molecular Breeding，Wuhan 430064， China）

Abstract： The gene CPA encoding a toxin was amplified from the strain C57-86 separated from poutry of Clostridium Perfringens type A by PCR， and pGEXKG-a was constructed. The sequence analysis based on the alpha-toxin gene revealed the strain was most closely related to reference strain AL08-16 gene sequence， only 97.7% nucleotide identity was observed. The purposed protein was expressed efficiently， and the purposed protein could react with antitoxin antibody which protected the SPF chick against the attack of C.perfringens type A culture filtrate.

Key words：Clostridium perfringens； alpha-toxin； molecular cloning and expression； immunogenicity

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Closteridium perfringens）是引起多種動物壞死性腸炎、腸毒血癥和人類食物中毒的主要病原菌之一，分為A、B、C、D、E 5個血清型。其致病因子主要是菌體產(chǎn)生的外毒素，在產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)生的12種毒素中，a毒素（CPA）被認(rèn)為是最基本、最重要的致病因子。a毒素是由370個氨基酸組成的單鏈多肽，分子質(zhì)量約43 ku，是一種依賴于鋅離子的多功能性金屬酶，具有磷脂酶C（PLC）和鞘磷脂酶2種酶活性，能同時水解細(xì)胞膜的主要組成成分——磷脂酰膽堿和鞘磷脂，破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，從而具有細(xì)胞毒性、溶血性、致死性和皮膚壞死性等特性[1]。近年來，全國各地A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的不同日齡禽類嚴(yán)重的壞死性腸炎，發(fā)病率達(dá)30%以上，病死率達(dá)18%～31%，病死雞多為肌肉脂肪豐滿、體格健壯的雞。本研究克隆和表達(dá)了雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素基因，并初步對其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了序列分析及免疫原性研究，為下一步建立家禽壞死性腸炎的免疫學(xué)診斷方法及亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株strainC57-86購自中國獸藥監(jiān)察所；大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）以及pGEX-KG載體由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存。

1.1.2 主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ，PCR試劑盒RNaseA、Taq DNA聚合酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 參照NCBI中產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素全基因組序列，設(shè)計1對a毒素基因引物，上游引物CPa01： 5-ACGGGATCCCACTATTTTGGAGATATA

GA-3，下游引物CPa02：5-ACGCTCGAGTTAATTATAAGTTGAATTTCCTG-3，目的片段大小為729 bp，由生工生物工程（上海）有限公司合成。上游引物和下游引物分別含有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點。

1.2.2 全基因組的提取 將雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌在厭氣肉肝湯中于37 ℃厭氧培養(yǎng)過夜離心后，將沉淀重懸于含2 mg/mL溶菌酶的TE溶液中，混勻后30 ℃水浴10 min。按照OMEGE bacterial DNA Kit說明書進(jìn)行全基因組的提取。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 50 μL PCR反應(yīng)體系為：10×Buffer緩沖液5.0 μL，MgCL2（25 mmol/L）4.0 μL，dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL，模板5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL、Taq DNA聚合酶（25 U）1.0 μL，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5.0 μL PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的回收、連接轉(zhuǎn)化及鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂凝膠電泳回收后，以DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，按說明書操作。將回收純化的目的產(chǎn)物與pGEX-KG載體雙酶切后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，以含有氨芐西林（Amp）抗性平板進(jìn)行篩選培養(yǎng)，挑取白色菌落于含Amp的LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，以SDS堿裂解法提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定及BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切分析篩選陽性克隆。

1.2.5 序列的測定與分析 取陽性克隆菌送至生工生物工程（上海）有限公司測序，測序結(jié)果用BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）在線進(jìn)行同源搜索。核苷酸和氨基酸分別用DNAStar軟件中的MegAlign程序的Clustal W運算，結(jié)果用GeneDoc2.6 （http：//www.psc.edu/biomed/genedoc/）進(jìn)行核苷酸變異分析，分析所用菌株及其GenBank登錄號見表1。

1.2.6 陽性質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 將構(gòu)建的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌BL21（DE3），經(jīng)37℃加IPTG誘導(dǎo)，按文獻(xiàn)[2]的方法收集菌體，變性處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.7 動物免疫原性及攻毒試驗 取陽性質(zhì)粒表達(dá)的蛋白質(zhì)測定其濃度，與等體積弗氏完全佐劑混勻乳化，制備抗原。取20只30日齡SPF雞，分為兩組，其中一組以600 μg劑量腿部肌肉注射SPF試驗雞，2周后取適量蛋白質(zhì)與等體積不完全弗氏佐劑混勻并乳化完全后，以同種劑量加強(qiáng)免疫，另一組為生理鹽水免疫的空白組。將過夜培養(yǎng)的雞源A型產(chǎn)氣莢膜梭菌上清作倍比稀釋，從原液到10-4稀釋做5個梯度，每個稀釋度0.1 mL腿部肌肉注射30日齡SPF雞6只，觀察試驗雞存活情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR鑒定結(jié)果

采用設(shè)計的特異性引物對a毒素基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果表明，以產(chǎn)氣莢膜梭菌為模板擴(kuò)增出約729 bp的特異性條帶，與預(yù)期大小相符（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

將質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，經(jīng)雙酶切后可獲得大小約為5 000 bp和729 bp的2條DNA條帶，即pGEX-KG載體和目的基因條帶，初步表明已成功構(gòu)建產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素克隆表達(dá)質(zhì)粒。

2.3 序列的測定與分析

將該菌株的a毒素基因序列與表1中的產(chǎn)氣莢膜梭菌[3]進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素基因與參考菌株AL08-16[4]的核苷酸同源性均較高，為97.7%。

基于基因組序列建立的進(jìn)化樹（圖3），結(jié)果雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌C57-86與印度土壤中分離的AL08-16的親緣關(guān)系較近，分別處于一較小的分支。與日本報道的ATCC13124和NCTC8237的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 a毒素基因表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

將BL21（DE3）菌株作為表達(dá)的宿主菌，經(jīng)轉(zhuǎn)化挑取單個菌落培養(yǎng)誘導(dǎo)后，菌體經(jīng)超聲波處理，提取包涵體，上清經(jīng)80%飽和硫酸銨沉淀后得到濃縮，沉淀經(jīng)透析后，用SDS-PAGE分析（圖4），在相對分子質(zhì)量約為46 ku處出現(xiàn)特異性蛋白質(zhì)條帶，表明a毒素已在宿主菌種得以表達(dá)，并且上清和沉淀均表達(dá)a毒素，包涵體中的濃度大于上清。

2.5 攻毒試驗結(jié)果

以1個LD50劑量，腹腔感染2次、免疫2周后的SPF雞及對照組SPF雞各10只，結(jié)果表明，免疫組10只SPF試驗雞全部存活，獲得100%的保護(hù)，而對照組10只SPF試驗雞全部死亡。

3 小結(jié)與討論

雞壞死性腸炎是由A型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的一種常見禽病，以生長率降低、腸道損傷和死亡為特征[5]。自2006年歐盟立法禁止抗生素作為生長促進(jìn)劑（AGPs）添加到飼料中使用[6，7]后，雞壞死性腸炎發(fā)病率明顯增高，對全球養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雞群發(fā)病較突然，常常是突然患病，剖檢可見大多數(shù)雞的腸腔擴(kuò)張3～5倍并充滿氣體，十二指腸出血性腸炎，腸黏膜充血、出血或壞死。

本試驗成功克隆了雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素的功能基因，并在大腸桿菌中高效表達(dá)，高表達(dá)的菌液經(jīng)離心后提取包涵體，結(jié)果表明，構(gòu)建的陽性克隆既可表達(dá)具有生物學(xué)活性的可溶性蛋白質(zhì)，也可表達(dá)不可溶性蛋白質(zhì)，這可能與設(shè)計a毒素的所選取的片段有關(guān)。a毒素基因其結(jié)構(gòu)基因大小為1 194 bp，編碼398個氨基酸，分子質(zhì)量為46 ku，信號肽為28個氨基酸，成熟肽為370個氨基酸。已有相關(guān)研究表明，編碼a毒素N端1～249氨基酸基因和編碼a毒素C端247～370氨基酸的基因，這兩種基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)點效應(yīng)有所變化[8]。通過免疫試驗表明，該重組蛋白質(zhì)免疫SPF雞能產(chǎn)生很好的抗體，從而避免被A型雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌的強(qiáng)毒株攻擊。

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