曾福源 伍艷清 邱明生 武沛文 周詩慧 王俊霖 簡紀(jì)常 謝妙 龐歡瑛

摘 要：為探究溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）HY9901菌株III型分泌系統(tǒng)（Type III secretion system，T3SS）胞質(zhì)環(huán)（C-環(huán)）組分VscQ作為疫苗候選抗原的可能性，根據(jù)GeneBank上登陸的溶藻弧菌vscQ序列（NO.MN862753），設(shè)計1對帶酶切位點的特異性引物，PCR擴增vscQ基因，進行序列分析。結(jié)果顯示，該基因全長969bp，預(yù)計分子量35.61kDa。將vscQ基因定向插入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-vscQ。用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)后，能在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中表達(dá)分子質(zhì)量約為61.6kDa的VscQ融合蛋白。VscQ蛋白表達(dá)的最優(yōu)條件為：0.4mmol/L IPTG，15℃條件下誘導(dǎo)12h。用純化后的VscQ融合蛋白免疫白兔，獲得高效多克隆抗體，抗體效價為1∶121500。兔抗VscQ血清能與重組VscQ蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，表明T3SS C-環(huán)組分VscQ可能是溶藻弧菌的重要保護性抗原之一。

關(guān)鍵詞：溶藻弧菌;VscQ;Ⅲ型分泌系統(tǒng);原核表達(dá);免疫原性

中圖分類號 S941.42;Q786文獻標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）18-0101-05

Prokaryotic Expression and Immunogenicity of the Type III Secretion System C-ring Component Protein VscQ from Vibrio alginolyticus

ZENG Fuyuan et al.

（1Shenzhen Institute of Guangdong Ocean University，Shenzhen 510000，China;2 Fisheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China;3 Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions，Zhanjiang 524088，China）

Abstract：To investigate the prokaryotic expression and the possibilities as a vaccine candidate antigen of VscQ from V.alginolyticus HY9901，primers ware designed according to the publicated vscQ gene sequence（NO.MN862753）.Followed by digestion，connection，prokaryotic expression，vector pGEX-vscQ was constructed through directional inserting into pGEX-4T-1，and the Gst-VscQ fusion protein with 61.6kDa was successfully expressed in Escherichia coli BL21（DE3）.The recombinant protein was highly expressed under induction conditions of exposure with 0.4mmol/L IPTG at 15℃ for 12 hours.The purified fusion protein was injected into rabbit to produce anti-VscQ serum.Western blot analysis revealed that the prepared antiserum specifically reacted to the VscQ fusion protein，which indicated that the VscQ may be one of the important protective antigens of V.alginolyticus.

Key words：Vibrio alginolyticus;VscQ;Type III secretion system（T3SS）;Prokaryotic expression;Immunogenicity

弧菌?。╒ibriosis）暴發(fā)迅速，流行面積廣，是魚蝦貝養(yǎng)殖中最為嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重制約了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1-3]。溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一種嗜鹽嗜溫型的革蘭氏陰性細(xì)菌，可產(chǎn)生黏附因子、脂多糖、Ⅲ型分泌系統(tǒng)、外膜蛋白等毒力因子[4]，能引起文蛤和菲律賓蛤仔外套膜萎縮、閉殼肌松弛無力、軟體部顏色淡紅等病變[5，6]。近年來，抗生素在弧菌病防治方面雖有成效，但長期使用抗生素所導(dǎo)致的耐藥性及藥物殘留問題也日益嚴(yán)重[7-9]。相比之下，疫苗是更優(yōu)的防控方法，其通過激發(fā)機體自身的免疫防御系統(tǒng)，可有效提高機體對病原的抵抗能力[10]。

Ⅲ型分泌系統(tǒng)（Type III secretion system，T3SS）是細(xì)菌保守存在的“針狀樣”注射裝置（injectisome），其核心結(jié)構(gòu)由嵌入在細(xì)菌膜中的多環(huán)基底、周質(zhì)內(nèi)桿、位于內(nèi)膜的跨膜輸出器和包括ATP酶復(fù)合體與C-環(huán)的胞質(zhì)組分組成[11]，是細(xì)菌特有的將分泌蛋白注入宿主細(xì)胞并致其死亡的裝置[12]。C-環(huán)位于內(nèi)膜環(huán)和輸出裝置的下方，與ATP酶復(fù)合體共同起著底物裝載、分泌樞紐和分選平臺的作用[13]。在耶爾森氏菌（Yersinia pestis）中，C-環(huán)由22個YscQ亞單位組成，可以在裝置與細(xì)胞質(zhì)之間完成轉(zhuǎn)換，YscQ的交換與效應(yīng)分子的分泌和ATP酶（VscN）的功能有關(guān)[14]。

有研究表明：T3SS相關(guān)蛋白具有較高的免疫保護作用，如將注射裝置蛋白VscP免疫多鱗鱚（Sillago sihama Forskál），28d后用溶藻弧菌、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）分別攻毒，發(fā)現(xiàn)多鱗鱚的免疫保護率分別為67.7%和86.6%，而用VscO蛋白免疫斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）后，對溶藻弧菌的免疫保護率達(dá)80.0%[15-18]，但目前對于C-環(huán)組分蛋白的免疫保護性尚未知曉。筆者對溶藻弧菌T3SS C-環(huán)組分VscQ蛋白進行原核表達(dá)、誘導(dǎo)條件優(yōu)化和免疫原性研究，為探討其作為基因工程亞單位疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 溶藻弧菌強毒株HY9901、大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）和質(zhì)粒pGEX-4T-1均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑及材料 Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、BamH I和Sal I限制性核酸內(nèi)切酶購自Takara公司;細(xì)菌基因組抽提試劑盒、核酸切膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;克隆載體pMD18-T購自寶生物工程（大連）有限公司;預(yù)染蛋白Marker購自Fermentas公司;鼠抗IgG和DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶藻弧菌基因組DNA的提取 將活化培養(yǎng)9h的溶藻弧菌HY9901按體積比1∶100的比例接種于TSB（20mg/mL NaCl，pH7.0）培養(yǎng)基，于28℃條件下振蕩培養(yǎng)10h。取2mL菌液，8000r/min離心1min收集菌體，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取溶藻弧菌基因組DNA，于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 克隆載體構(gòu)建 根據(jù)GenBank上登陸的溶藻弧菌VscQ基因序列（NO.MN862753），用Primer 5設(shè)計1對帶酶切位點的特異性引物（由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成），上游引物V1：GGCGGATCCATGACGCCGTTAATAATCCCCA（下劃線為BamH I位點），下游引物V2：GGCGTCGACTCATGCTGGCTCCTGCGTGC（下劃線為Sal I位點），以1.2.1所述基因組DNA為模板，進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，41℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。0.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳檢測VscQ片段，回收片段，克隆至pMD18-T載體，命名為pMD-vscQ。

1.2.3 原核表達(dá)載體構(gòu)建及大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá) 提取測序正確的pMD-vscQ菌株質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后，按T4DNA連接酶說明書操作步驟，與經(jīng)同樣雙酶切的pGEX-4T-1質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-vscQ。將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB平板（含Amp 100?g/mL），挑取單菌落，接種于800?L LB（含Amp 100?g/mL）培養(yǎng)基中，于37℃條件下振蕩培養(yǎng)9h。菌落PCR、測序鑒定正確后，按體積比1∶100的比例接種于30mL LB（含Amp 100?g/mL）培養(yǎng)液中，于37℃條件下220r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時，取1mL培養(yǎng)物，10000g室溫離心2min，棄上清，用100μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀。在剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L，于15℃條件下220r/min振蕩培養(yǎng)12h，取1mL培養(yǎng)物，12000g室溫離心2min，棄上清，用100μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀，12% SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況。

1.2.4 原核表達(dá)條件的優(yōu)化 IPTG設(shè)0.1、0.4、0.7和1.0mmol/L共4個濃度進行誘導(dǎo)，在15℃條件下誘導(dǎo)12h;時間設(shè)1、2、4、6、8、10、12h共7個時間點，分別于15℃、0.4mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo);溫度設(shè)15℃和37℃，在0.4mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)12h。SDS-PAGE分析不同誘導(dǎo)條件下VscQ蛋白誘導(dǎo)表達(dá)情況。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的純化 在最佳誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)后，取30mL菌液，1000r/min離心，收集菌體，用PBS（pH7.4）重懸，超聲破碎，程序為：300W超聲6s，間隔8s，直至菌液澄清。在4℃條件下經(jīng)Washing Buffer和Rashing Buffer洗滌，離心收集沉淀并稱重，按30mg/mL的濃度比加入PBS，加入8mol/L的尿素3mL，于4℃條件下裂解9h。用GST瓊脂糖凝膠裝柱（柱床體積5mL）純化，PBS（pH7.4）平衡，流速為1mL/min，將誘導(dǎo)上清上樣，讓GST FUSION融合蛋白掛柱。用PBS（pH7.4）洗脫雜蛋白，然后用洗脫液（0.1mmol/L Tris溶液50mL，0.514g還原型谷胱甘肽GSH，pH8.0）洗脫目的蛋白，收集洗脫峰液體，12% SDS-PAGE分析純化結(jié)果。最佳洗脫液洗脫下的目的蛋白，經(jīng)過小體積透析袋透析，再用K4000 Brandford試劑盒測定蛋白濃度，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 抗血清的制備與抗體效價的測定 將純化的VscQ蛋白與佐劑混合，直至完全乳化。免疫開始前，抽取兔血作為空白對照，離心，分離血清，于-80℃條件下保存?zhèn)溆谩Ｆは伦⑸涿庖咝挛魈m白兔（2～2.5kg），每只白兔免疫400?g VscQ蛋白，對照組注射等量磷酸緩沖液（PBS），14～21d免疫1次，共免疫4次。首次注射的抗原為蛋白或PBS與弗氏完全佐劑混勻制備，后3次注射的抗原均采用蛋白或PBS與不完全佐劑混勻制備。免疫結(jié)束后，取血、離心分離血清，提前準(zhǔn)備包被板，用PBS（pH7.4）包被緩沖液將VscQ抗原稀釋到5?g/mL，混勻后加入板條中，每孔100?L，于4℃冰箱過夜。棄去包被液，洗滌3次，每孔加入200?L封閉液，于37℃恒溫箱封閉1h。取出酶標(biāo)板，棄去內(nèi)液，洗滌1次。加入VscQ兔抗血清（1/500），3倍稀釋，每孔100?L，于37℃恒溫箱反應(yīng)1h。取出酶標(biāo)板，棄去內(nèi)液，洗滌3次，向每孔中加入100?L HRP-標(biāo)記的羊抗兔IgG（1/5000稀釋），于37℃恒溫箱反應(yīng)1h。取出酶標(biāo)板，棄去內(nèi)液，洗板4次，每孔加入100?L TMB顯色液，顯色完成后每孔加入100?L 1mol/L HCL溶液，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上（450nm）讀數(shù)，將≥陰性對照OD值2.1倍的孔所對應(yīng)的稀釋度，定為該樣品的效價。

1.2.7 免疫原性分析 Western-blot分析VscQ的免疫原性。取VscQ蛋白，加入Loadind Buffer煮沸、冷卻，取20?L進行SDS-PAGE電泳，電泳條件：5%濃縮膠，90V，30min;10%分離膠，120V，20min。使用轉(zhuǎn)印儀將VscQ蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，條件為100V，60min。結(jié)束后用5%脫脂奶粉TBST溶液進行封閉，于37℃搖床中封閉2h，PBS漂洗5min。一抗用兔抗VscQ血清，于4℃條件下反應(yīng)過夜，TBST漂洗3次，每次5min。二抗用HRP-標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶1500稀釋），于37℃下反應(yīng)1h，TBST漂洗4次，每次5min。加入二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色液，待有明顯蛋白條帶出現(xiàn)后用雙蒸水終止反應(yīng)，膜自然干燥后拍照，避光長期保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將vscQ基因片段連接到pGEX-4T-1質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），挑取單克隆進行菌落PCR鑒定，結(jié)果獲得969bp的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1A）。提取的質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶BamH I和Sal I酶切后，得到大小約5kp和1kp的2個片段（圖1B），雙向測序未發(fā)現(xiàn)vscQ有錯配或突變，證明原核表達(dá)載體pGEX-vscQ構(gòu)建成功。

2.2 大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá) 將pGEX-vscQ質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可表達(dá)相對分子質(zhì)量約61.6kDa的VscQ蛋白（圖2泳道2），其中VscQ的預(yù)計分子量35.6kDa，pGEX-4T-1表達(dá)的融合標(biāo)簽為26kDa。對照組均未表達(dá)VscQ蛋白。

2.3 誘導(dǎo)表達(dá)的條件優(yōu)化 IPTG誘導(dǎo)濃度0.4mmol/L時VscQ表達(dá)量最大（圖3A）;誘導(dǎo)時間為12h時表達(dá)量最佳（圖3B）;誘導(dǎo)溫度為37℃時全菌、沉淀中蛋白表達(dá)量較15℃時高，上清中幾乎不表達(dá)（圖3C），而誘導(dǎo)溫度為15℃時上清中VscQ蛋白表達(dá)量較大（圖4）。通過對IPTG濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化，確定VscQ的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：0.4mmol/L IPTG，15℃條件下誘導(dǎo)12h。

2.4 VscQ蛋白純化 選取IPTG誘導(dǎo)濃度為0.4mmol/L，于15℃條件下誘導(dǎo)12h后的上清進行GST柱親和純化，經(jīng)GSH洗脫，從上清液中獲得VscQ蛋白，純度在90%以上。經(jīng)SDS-PAGE分析，成功獲得目的蛋白（圖5泳道3）。

2.5 兔抗VscQ血清效價測定 VscQ免疫新西蘭白兔后，ELISA檢測兔抗血清效價高達(dá)1∶121500（表1）。

2.6 VscQ的免疫原性分析 Western-blot分析表明，VscQ抗血清能與重組表達(dá)的61.6kDa VscQ蛋白發(fā)生反應(yīng)（圖6泳道1），而對照血清不能與重組VscQ蛋白反應(yīng)（圖6泳道2）。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論 本研究成功表達(dá)了溶藻弧菌T3SS C-環(huán)組分VscQ蛋白，并對其表達(dá)條件了進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為15℃，0.4mmol/L IPTG誘導(dǎo)12h。用純化的重組VscQ蛋白免疫白兔獲得了高效價的抗血清，抗體效價為1∶121500。Western blot結(jié)果顯示，抗血清能與VscQ重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，提示溶藻弧菌T3SS C-環(huán)組分蛋白VscQ具有免疫原性，未來可通過免疫保護試驗探討其作為疫苗候選蛋白的可能性。

3.2 討論 長期以來，化學(xué)藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害防治中被廣泛使用，由此產(chǎn)生的藥物殘留、污染環(huán)境等問題不利于該行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。疫苗不僅能提高動物免疫水平，還能增強機體抗應(yīng)激能力，且符合綠色、安全等要求，是目前水產(chǎn)動物疾病防治界研究與開發(fā)的主流產(chǎn)品[19]。Ⅲ型分泌系統(tǒng)是細(xì)菌為了適應(yīng)環(huán)境演變出的一套有利于自身發(fā)展的裝置，在致病過程中扮演重要角色[20]。該毒力裝置負(fù)責(zé)將其編碼的效應(yīng)蛋白直接注入宿主細(xì)胞內(nèi)部，導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排或干擾細(xì)胞信號通路，進而使宿主細(xì)胞死亡[21，22]。有研究表明，弧菌的部分外膜蛋白（Omp）、T3SS裝置蛋白等具有較好的免疫原性[23-25]。C-環(huán)作為溶藻弧菌T3SS的重要組成部分，其免疫原性尚未可知。

本研究通過構(gòu)建VscQ的原核表達(dá)載體，并對其表達(dá)條件進行優(yōu)化，當(dāng)IPTG濃度為0.4mmol/L時VscQ表達(dá)量最大，IPTG濃度過高或過低都會抑制VscQ的表達(dá)。VscQ表達(dá)量受誘導(dǎo)時間影響較小，誘導(dǎo)12h為最佳。在本研究中，VscQ在37℃條件下誘導(dǎo)的全菌、沉淀中蛋白表達(dá)量均較高，其原因可能是E.coli在37℃時體內(nèi)酶的活性最大。值得注意的是，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為15℃時，上清中VscQ蛋白表達(dá)量明顯高于沉淀，而誘導(dǎo)溫度為37℃時則相反。為制備亞單位疫苗，需讓目的蛋白在上清中表達(dá)，故在15℃條件下誘導(dǎo)效果更好。

以純化后具有免疫原性的抗原為原材料制成的亞單位疫苗，其免疫保護力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于滅活全菌疫苗[26]。本研究中，純化的融合VscQ蛋白能刺激白兔產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)，兔抗VscQ血清能與重組表達(dá)的61.6kDa VscQ蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，但其是否為保護性抗原，還需進一步通過免疫保護性試驗加以驗證。

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（責(zé)編：徐世紅）