徐康維，許麗，魯旭，李晶，戈小琴，王開芹，權婭茹，李長貴

1.中國食品藥品檢定研究院國家衛(wèi)生健康委員會生物技術產品檢定方法及其標準化重點實驗室國家藥品監(jiān)督管理局生物制品質量研究與評價重點實驗室，北京 102629；2.北京科興生物制品有限公司，北京 100085；3.北京科興中維生物技術有限公司，北京 102601

自2019 年末，SARS-Cov-2 在全球范圍內迅速傳播［1-3］。近年，各種變異株不斷出現(xiàn)，WHO 將變異株分為值得關注變異株（variant of concern，VOC）和待觀察變異株（variant of interest，VOI）兩類。VOC是指傳播性、嚴重程度和／或免疫力有重大變化，可能對流行病學狀況產生影響的變異株，如Alpha 株（B.1.1.7）、Beta 株（B.1.351）、Gamma株（P.1）、Delta株（B.1.617.2）和Omicron 株等［4］，這些VOC 在Spike蛋白的受體結合位點區(qū)域（receptor binding domain，RBD）和N-末端結構域（N-terminal domain，NTD）均有突變。2020年10月，于南非首次發(fā)現(xiàn)Beta株（B.1.351）［5］，與原型株比較，在Spike蛋白中有9個氨基酸位點突變，其中3個突變（K417N、E484K和N501Y）位于RBD中，可能使其與宿主細胞血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）受體的結合親和力更高［6-8］。2021 年1 月，于美國首次發(fā)現(xiàn)Gamma 株（P.1）［9］，該毒株Spike 蛋白中包含10 個突變，RBD 中也有3 個突變（L18F、K417N 和E484K）。2021 年3 月，于印度首次發(fā)現(xiàn)Delta 株，該毒株具有更強的傳播能力和致病力。2021年6月—2021年底，Omicron突變株成為全球主要流行毒株，其Spike 蛋白中包含10個突變［10］。

上述突變株的出現(xiàn)降低了現(xiàn)有疫苗的保護能力［8，11-12］，因此，廣譜疫苗的研發(fā)成為研究熱點，部分疫苗在動物實驗中已顯示出一定的廣譜保護效果，但目前尚無相關產品上市［13-16］。研發(fā)針對變異株的疫苗是更現(xiàn)實的解決方案，目前，已有多種針對變異株的mRNA疫苗、重組疫苗及滅活疫苗處于臨床前或臨床研究階段［17-21］。本研究采用原型株及Beta 株（B.1.351）、Gamma株（P.1）、Delta株（B.1.617.2）制備的SARS-Cov-2滅活疫苗分別免疫大鼠，評價其免疫原性，以期為該疫苗候選疫苗株的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 病毒及細胞 SARS-Cov-2原型株（CZ01）、Beta 株（B.1.351）、Gamma株（P.1）、Delta株（B.1.617.2）和Vero細胞均由北京科興中維生物技術有限公司提供。

1.2 疫苗 原型株、Beta 株、Gamma株、Delta株SARSCoV-2 滅活疫苗原液及成品均由北京科興中維生物技術有限公司生產（各株病毒的Vero 細胞培養(yǎng)液經β-丙內酯滅活、超濾及柱純化獲得疫苗原液，稀釋后與氫氧化鋁佐劑混合，制備為疫苗成品，疫苗蛋白含量均為6 μg／mL［22］）。

1.3 主要試劑 BSA 購自美國Sigma 公司；HRP 標記的羊抗兔IgG 購自荷蘭Nordic Mubio 公司；199 培養(yǎng)基購自美國Gibci公司。

1.4 實驗動物 SPF 級Wistar 大鼠，雌性，6 周齡，體質量180～220 g，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號為：SCXK（京）2019-0010，實驗動物使用許可證號為：SYXK（京）-2020-0054。本實驗對大鼠的所有處理均以科研為目的，且按照中檢院《實驗動物福利倫理審查指導原則》等動物倫理相關規(guī)定進行［文件號：中檢動（福）第2021（B）023號］。

1.5 動物免疫 分別采用1.2 項中4 種SARS-CoV-2滅活疫苗經大腿肌內免疫大鼠，3 μg 病毒蛋白／（0.5 mL·只），間隔14 d 再次免疫，免疫劑量及途徑同上，同時設陰性對照組（生理鹽水），每組5 只。初次免疫后14、28和42 d，經靜脈采血，分離血清。

1.6 大鼠血清IgG抗體水平的檢測 采用間接ELISA法［23-24］。用PBS 緩沖液（pH 7.2）分別將疫苗原液稀釋至蛋白濃度為1 μg／mL，加入96孔板，100 μL／孔，4 ℃孵育過夜；PBST洗滌5次，加入封閉液（含1%BSA的PBS），200 μL／孔，室溫孵育1 h；加入大鼠血清（用封閉液進行800倍稀釋后，再進行2倍系列稀釋，共11 個稀釋度），100 μL／孔，室溫孵育2 h；PBST 洗滌5 次，加入HRP 標記的羊抗兔IgG（用封閉液按1∶5 000 稀釋），室溫孵育1 h；PBST 洗滌5 次，加入TMB 顯色底物，100 μL／孔，室溫顯色15 min；加入0.5 mol／L 的硫酸，50 μL／孔，終止反應，用酶標儀檢測A450／630。以＞2.1 倍空白孔A450／630的最高稀釋度作為血清效價；血清效價＜800時，記為400。

1.7 大鼠血清中和抗體水平的檢測 采用微量中和試驗，需在生物安全三級實驗室內完成［23-24］。將大鼠血清樣本于56 ℃水浴滅活30 min，用199 培養(yǎng)基進行4倍稀釋；將199培養(yǎng)基加入96孔板，50 μL／孔，再加入等體積分數的稀釋血清（2 倍系列稀釋，共11個稀釋度），每份血清設2 個復孔；用199 培養(yǎng)基將SARS-CoV-2稀釋至100 CCID50／50 μL，加入96孔板，50 μL／孔，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置中和120 min；將Vero細胞稀釋至（1.2～2.0）×105個／mL，加入96孔板，100 μL／孔，繼續(xù)培養(yǎng)5 d；顯微鏡下觀察細胞病變情況。以半數細胞出現(xiàn)病變的稀釋度計為血清中和抗體效價，中和抗體效價＜8 按4 計算，≥8 判為中和抗體陽轉，并計算抗體效價的幾何均值（geomeric mean titer，GMT）。

1.8 抗原比的計算 參照流感病毒抗原性差異評價方法，以R =公式對血清中和抗體效價的結果進行抗原比計算（r1 為甲血清對乙病毒的中和效價／甲血清對甲病毒的中和效價；r2 為乙血清對甲病毒的中和效價／乙血清對乙病毒的中和效價），R表示兩株病毒間抗原性差異，1 ≤R ＜1.5時表明兩株病毒抗原性無明顯差異；1.5 ≤R ＜2 時表明兩株病毒抗原性差異較??；R ≥2 時表明兩株病毒抗原性有明顯差異。R ＜1時則取倒數進行評價［25］。

1.9 數據采集及分析 應用EXCEL 2019 軟件進行數據采集及分析，GraphPad Prism 8軟件進行作圖。

2 結果

2.1 大鼠血清IgG 抗體水平 初次免疫后14 d，大鼠血清中即可檢測到IgG抗體；初次免疫后28 d，IgG抗體效價較14 d提高10倍以上；初次免疫后42 d，IgG抗體效價較28 d略有下降，但仍高于14 d。各毒株免疫后血清不僅具有較高水平的相應毒株IgG抗體，對其他3個毒株也具有較高的IgG抗體效價。見表1。

表1 ELISA法檢測大鼠免疫血清IgG抗體水平Tab.1 Detection of serum IgG antibody titers in immunized rats by ELISA

2.2 大鼠血清中和抗體水平 初次免疫后14 d，多數大鼠血清可檢測到中和抗體，其中原型株和Delta 株疫苗免疫血清針對4株病毒的中和抗體均陽轉；Beta株疫苗免疫血清針對Beta株和Gamma株病毒中和抗體均陽轉，針對原型株中和抗體陽轉率為80%，針對Delta 株中和抗體陽轉率為40%；Gamma 株疫苗免疫血清針對Beta 株和Gamma 株病毒的中和抗體均陽轉，針對原型株和Delta株中和抗體陽轉率均為80%。Delta 株疫苗免疫血清對Delta 毒株的中和抗體效價最高，GMT為366；Beta 株疫苗免疫血清對Delta毒株的中和抗體效價最低，GMT為5。初次免疫后28 d，4種毒株免疫血清中和抗體均陽轉，中和抗體效價較14 d 有大幅升高。初次免疫后42 d，中和抗體效價較28 d 總體略有下降，其中Delta 株疫苗免疫后針對4株毒株均具有較高的中和抗體效價，提示該疫苗具有較好的免疫原性。各毒株疫苗免疫后血清與相應毒株的中和效價最高，與其他毒株的中和效價降低。見表2。

表2 微量中和試驗檢測大鼠血清中和抗體效價（GMT）Tab.2 Detection of neutralizing antibody titers in rat serum by microneutralization（GMT）

2.3 不同毒株間的抗原比以初次免疫14 和28 d 大鼠血清中和抗體GMT 計算抗原比，4 株病毒間抗原比為2.3～8.1，均＞2；以初次免疫后42 d 大鼠血清中和抗體GMT 計算抗原比，4 株病毒間抗原比為1.6～4.0，其中Beta 株與Gamma 株間抗原比為1.6，原型株與Gamma 株間抗原比為1.8，抗原性差異較小。見表3。

表3 不同SARS-CoV-2毒株間的抗原比Tab.3 Antigenic ratios between different strains of SARS-CoV-2

3 討論

隨著SARS-CoV-2 不斷進化和變異，導致疫苗的保護效果逐步降低，研究顯示，SARS-CoV-2 原型株感染患者血清對Beta 株的中和效價平均降低了9.4倍，原型株mRNA 疫苗免疫血清中和效價降低了10.3～12.4 倍［26］；SARS-CoV-2 原型株感染患者血清對Gamma株中和效價平均降低了3.4倍，SARS-CoV-2原型株mRNA 疫苗免疫血清對Gamma 株血清中和效價降低了3.8～4.8 倍［8］，SARS-CoV-2 原型株感染患者血清對Delta 株中和效價降低約2 倍［27］，因此需要研發(fā)更加有效的疫苗。

本研究采用原型株、Beta 株、Gamma 株和Delta株SARS-CoV-2 制備的滅活疫苗對大鼠進行免疫，結果顯示，原型株或Delta 株疫苗初次免疫后14 d，大鼠血清對4株病毒的中和抗體全部陽轉；采用Beta株和Gamma株疫苗免疫的大鼠血清對Beta株和Gamma株病毒的中和抗體全部陽轉，針對原型株或Delta 株病毒的中和抗體部分陽轉。加強免疫后，所有大鼠血清中和抗體均陽轉，且中和抗體效價較14 d 有大幅升高?？傮w上，Beta 株和Gamma 株疫苗免疫大鼠血清中和抗體水平較低，原型株和Delta 株疫苗免疫大鼠血清中和抗體水平較高。Delta 株疫苗免疫后42 d 的大鼠血清對4 株病毒均具有較高的中和抗體效價，提示該疫苗可能具有較好的免疫原性。參照不同毒株流感病毒抗原性差異的分析方法［20］，本研究還對上述4株SARS-CoV-2 的抗原比進行了分析，結果顯示，Beta 株與Gamma 株間，原型株與Gamma 株間抗原性差異較小，原型株與Beta 株間抗原性差異較大，這與WANG 等［26］實驗結果一致。初次免疫后42 d，各毒株抗原性差異較14和28 d小，提示隨著抗體親和力的成熟，大鼠產生了更多針對不同毒株間較為保守的中和表位的抗體。本研究對SARS-CoV-2滅活疫苗研發(fā)毒株的選擇提供了參考。