管堂飛，楊鑫，洪燦輝，肖培云，張成桂，何正春

大理大學(xué)藥學(xué)院 云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000

美洲大蠊為蜚蠊科大蠊屬昆蟲(chóng)，俗稱(chēng)“蟑螂”，是一種世界公認(rèn)的衛(wèi)生害蟲(chóng)。美洲大蠊入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，現(xiàn)為云南彝族民間常用的傳統(tǒng)動(dòng)物藥［1］。美洲大蠊可內(nèi)外兼用，具有促進(jìn)傷口愈合、解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛等功效［2］。研究顯示，美洲大蠊提取物含有豐富的蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、核苷以及多種類(lèi)型的有機(jī)小分子，具有抗纖維化、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等諸多生物活性［3］。根據(jù)“膽堿能損傷假說(shuō)”，在神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默?。ˋD）中，神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿減少是其關(guān)鍵致病因素之一［4］。隨著年齡的增長(zhǎng)，氧化應(yīng)激反應(yīng)增加是導(dǎo)致與年齡相關(guān)疾病尤其是神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的主要因素，而富含抗氧化劑的飲食和藥物在抗衰老過(guò)程中發(fā)揮重要作用［5］。美洲大蠊提取物PAS840是從美洲大蠊蟲(chóng)體中提取，并經(jīng)大孔樹(shù)脂分離純化后得到的精提物。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物PAS840可減輕過(guò)氧化氫（H2O2）引起的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞損傷，提示其可能對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)疾病甚至神經(jīng)退行性疾病有效［6］。2022年10月—2023年5月，本研究觀(guān)察了美洲大蠊提取物PAS840對(duì)乙酰膽堿酯酶（AChE）活性的抑制作用及其抗氧化活性，以期為美洲大蠊提取物在神經(jīng)退行性疾病、氧化應(yīng)激相關(guān)疾病治療中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 藥品：美洲大蠊提取物PAS840凍干粉提取自大理大學(xué)藥物化學(xué)教研室。主要試劑：AChE、牛血清蛋白（BSA）購(gòu)自美國(guó)索萊寶公司，5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、碘化硫代乙酰膽堿（ATCI）、1%十二烷基硫酸鈉（SDS）均購(gòu)自北京伊諾凱科技有限公司，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）購(gòu)自上海思域化工科技有限公司，磷酸緩沖鹽溶液（PBS，0.1 mol/L，pH 7.38）購(gòu)自武漢賽維爾科技有限公司。

1.2 美洲大蠊提取物PAS840對(duì)AChE活性的抑制作用觀(guān)察

1.2.1 體外AChE活性檢測(cè)模型建立 采用改良的Ellman法進(jìn)行酶促反應(yīng)［7-8］。AChE活性檢測(cè)原理：AChE在一定pH條件下，可催化水解底物ATCI生成產(chǎn)物硫代膽堿，而硫代膽堿可迅速與溶液中的顯色劑DTNB反應(yīng)，生成黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸鹽，其在412 nm波長(zhǎng)處有最大吸收；而當(dāng)AChE活性被部分抑制時(shí)，其水解ATCI的能力下降，生成的黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸鹽減少，其在412 nm波長(zhǎng)波長(zhǎng)處的光密度值降低。參照文獻(xiàn)［9］確定AChE的濃度為0.85 U/mL，PAS840濃度為15.625 μg/mL，加入不同濃度（3.75、7.5、15、30、60 mmol/mL）的ATCI作為底物，檢測(cè)作用0、10、20、30 min時(shí)5-巰基-2-硝基苯甲酸鹽在412 nm波長(zhǎng)處的光密度值。結(jié)果顯示，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和底物ATCI濃度的增加，5-巰基-2-硝基苯甲酸鹽在412 nm波長(zhǎng)處的光密度值均呈升高趨勢(shì)，提示該模型可穩(wěn)定可靠地反映AChE活性，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)OSID碼圖1。

1.2.2 最佳酶促反應(yīng)時(shí)間確定 采用光密度—時(shí)間曲線(xiàn)。取PBS 150 μL，37 ℃水浴預(yù)熱5 min，再依次加入0.85 U/mL的AChE 20 μL、15 mmol/L DTNB 20 μL、15 mmol/L ATCI 20 μL，37 ℃水浴反應(yīng)不同時(shí)間（0、5、10、15、20、25、30 min）。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)412 nm波長(zhǎng)處的光密度值，扣除ATCI因非酶催水解所產(chǎn)生的光密度值，確定酶促反應(yīng)處于初速度的時(shí)間，即為酶促反應(yīng)時(shí)間。結(jié)果顯示，光密度值隨著酶促反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，但當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到20 min后光密度值也未見(jiàn)減小，基于反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)短以及參考相關(guān)文獻(xiàn)［8］，選擇最佳酶促反應(yīng)時(shí)間為20 min。見(jiàn)OSID碼圖2。

1.2.3 最佳AChE酶促反應(yīng)濃度確定 采用光密度—酶活曲線(xiàn)。取PBS 150 μL，37 ℃水浴預(yù)熱5 min，依次加入不同濃度（0.106 25、0.212 5、0.425、0.850、1.700 U/mL）的AChE 20 μL、15 mmol/L DTNB 20 μL、15 mmol/L ATCI 20 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱反應(yīng)20 min。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)412 nm波長(zhǎng)處的光密度值，扣除ATCI因非酶催水解所產(chǎn)生的光密度值，確定是否可以用光密度值代表AChE活性。結(jié)果顯示，該酶促反應(yīng)體系的光密度值隨著AChE濃度的升高而升高；但當(dāng)AChE濃度超過(guò)0.425 U/mL時(shí)，該酶促反應(yīng)體系的光密度值趨于平穩(wěn)，提示底物的水解產(chǎn)物含量趨于穩(wěn)定，反應(yīng)達(dá)到相對(duì)平衡；因此，選擇最佳AChE酶促反應(yīng)濃度為0.425 U/mL。見(jiàn)OSID碼圖3。

1.2.4 最佳底物濃度確定 取150 μL的PBS，37 ℃水浴預(yù)熱5 min，依次加入不同濃度（3.75、7.5、15、30、60 mmol/mL）的ATCI 20 μL、15 mmol/L DTNB 20 μL、0.425 U/mL AChE 20 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱反應(yīng)20 min，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)412 nm波長(zhǎng)處的光密度值。結(jié)果顯示，在A(yíng)ChE濃度為0.425 U/mL時(shí)，該酶促反應(yīng)體系的光密度值隨著底物ATCI濃度的升高而升高；當(dāng)?shù)孜顰TCI濃度大于15 mmol/L時(shí)，該酶促反應(yīng)體系的光密度值趨于平穩(wěn)；因此，選擇最佳底物ATCI濃度為15 mmol/L。見(jiàn)OSID碼圖4。

1.2.5 不同濃度PAS840對(duì)AChE活性的抑制作用觀(guān)察 采用改良的Ellman法［8-10］，按照上述已篩選出的最佳AChE、ATCI濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在96孔板中依次加入37 ℃預(yù)熱5 min后的PBS 150 μL，加入最佳濃度為0.425 U/mL的AChE 20 μL，15 mmol/L的DTNB 20 μL，再分別加入濃度為7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250 μg/mL的PAS840，以及最佳濃度為15 mmol/L的底物ATCI各20 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱反應(yīng)不同時(shí)間（0、5、10、15、20、25、30 min）；加入1% SDS 20 μL終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)412 nm波長(zhǎng)處的光密度值，記為OD樣。每個(gè)濃度做3個(gè)平行，每個(gè)平行設(shè)置樣品、空白和本底三個(gè)對(duì)照。由于本實(shí)驗(yàn)的樣品PAS840有顏色，所以每個(gè)樣品同時(shí)做一個(gè)本底扣除，用PBS 20 μL替代ATCI底物溶液，酶標(biāo)儀檢測(cè)其412 nm波長(zhǎng)處的光密度值（以O(shè)D值表示），記為OD底。用PBS代替AChE作為空白對(duì)照，酶標(biāo)儀檢測(cè)其412 nm波長(zhǎng)處的光密度值，記為OD空。繪制不同作用時(shí)間加入不同濃度的PAS840后AChE催化ATCI分解的光密度—時(shí)間曲線(xiàn)，以其斜率反映AChE催化ATCI分解的速率。

1.2.6 不同濃度PAS840的AChE抑制率測(cè)定 參照文獻(xiàn)［4］的方法，按照“1.2.2”“1.2.3”“1.2.4”篩選出的最佳條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，加入PAS840的濃度為15.625、31.25、62.5、125、250、500 μg/mL，按照“1.2.5”的方法測(cè)定光密度值，并計(jì)算各濃度PAS840對(duì)AChE活性的抑制率［11］。AChE活性抑制率=（OD空-OD樣+OD底）/OD空×100%。繪制不同濃度PAS840作用后的AChE抑制率曲線(xiàn)，采用GraphPad Prism5軟件得到PAS840抑制AChE催化ATCI分解的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.7 PAS840對(duì)AChE活性的抑制類(lèi)型分析 確定AChE濃度為0.425 U/mL，選擇不同濃度（3.75、7.5、15、30、60 mmol/mL）的底物ATCI，采用改良的Ellman法測(cè)定光密度值，繪制AChE催化ATCI分解的反應(yīng)速率（V）隨底物濃度（S）變化的曲線(xiàn)，即米氏方程曲線(xiàn)。結(jié)果顯示，在相同底物濃度條件下，隨著PAS840濃度的升高，AChE催化ATCI分解的反應(yīng)速率降低，即PAS840的抑制活性增強(qiáng)，見(jiàn)OSID碼圖5。該反應(yīng)體系酶促反應(yīng)速率增加的原因是底物濃度的非線(xiàn)性增加，這種趨勢(shì)符合米氏方程規(guī)律，可采用米氏方程相關(guān)的酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)定PAS840對(duì)AChE的抑制類(lèi)型［12］。采用雙倒數(shù)作圖法，繪制不同濃度PAS840作用后，AChE催化ATCI分解反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/V）隨底物濃度的倒數(shù)（1/S）變化的曲線(xiàn)，即不同濃度PAS840對(duì)AChE抑制作用的雙倒數(shù)曲線(xiàn)，通過(guò)雙倒數(shù)曲線(xiàn)判斷抑制類(lèi)型，包括競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制和混合性抑制［13］。

1.3 美洲大蠊提取物PAS840的抗氧化活性觀(guān)察

1.3.1 PAS840對(duì)DPPH自由基的清除能力觀(guān)察采用DPPH法。參照姚旭等［10］的方法并稍作改動(dòng)，稱(chēng)取1.971 6 mg的DPPH，加入無(wú)水乙醇配制成0.1 mmol/L的DPPH溶液，取不同濃度（3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、250 μg/mL）的PAS840溶液或維生素C（VC）1 mL，再加入DPPH溶液1 mL，充分混合均勻。23 ℃避光放置30 min，0.25 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液250 μL于96孔板中，517 nm處測(cè)定光密度值（以A表示），以此表示DPPH自由基含量，光密度水平越低表明清除的DPPH自由基越多，其抗化活性越強(qiáng)。DPPH自由基清除率=1-［（A樣-A底）/A空］×100%，其中A空為1 mL無(wú)水乙醇加1 mL DPPH溶液的光密度值、A樣為1 mL樣品溶液加1 mL DPPH溶液的光密度值、A底為1 mL樣品溶液加1 mL無(wú)水乙醇的光密度值。采用ELISA Calc回歸/擬合程序軟件計(jì)算PAS840清除DPPH自由基的IC50。

1.3.2 PAS840對(duì)鐵氰化鉀的還原能力觀(guān)察 采用總還原能力測(cè)定法。在4 mL離心管中分別加入濃度為0.2 mol/L的磷酸緩沖液（pH 6.6），分別加入不同濃度（0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0 mg/mL）的PAS840溶液或Vc 0.2 mL，加入1%鐵氰化鉀0.5 mL，混合均勻。50 ℃水浴20 min，加入10%三氯乙酸0.5 mL終止反應(yīng)，0.25 μm微孔濾膜過(guò)濾。加入去離子水0.5 mL和0.1%三氯化鐵0.1 mL，渦旋儀混合均勻，靜置10 min。取250 μL混合液于96孔板中，檢測(cè)700 nm處的光密度值（以B表示）［10］。鐵氰化鉀還原率=（B空-B樣）/B空×100%，其中B空為空白對(duì)照液的光密度值、B樣為加入樣品溶液后的光密度值。采用ELISA Calc回歸/擬合程序軟件計(jì)算PAS840還原鐵氰化鉀的IC50。

1.3.3 PAS840對(duì)羥自由基的清除能力觀(guān)察 采用水楊酸法。取9 mmol/L FeSO41 mL，加入到4 mL離心管中，再加入10 mmol/L水楊酸—乙醇溶液1 mL，依次加入不同濃度（0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0 mg/mL）PAS840溶液或Vc溶液1 mL，最后加入3% H2O21 mL作為顯色劑。37 ℃水浴反應(yīng)30 min，以蒸餾水為參比，檢測(cè)510 nm下的光密度值（以C表示）。羥自由基清除率=1-［（C樣-C底）/C空］×100%，其中C空為空白對(duì)照液的光密度值、C樣為加入樣品溶液后的光密度值、C底為不加顯色劑H2O2樣品溶液本底的光密度值。采用ELISA Calc回歸/擬合程序軟件計(jì)算PAS840清除羥自由基的IC50。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度PAS840對(duì)AChE的活性抑制作用比較 隨著PAS840濃度的升高，AChE催化ATCI分解的光密度—時(shí)間曲線(xiàn)斜率逐漸降低，提示PAS840對(duì)AChE催化反應(yīng)進(jìn)程具有抑制作用，且隨著作用濃度和時(shí)間的增加，其抑制作用更為明顯。見(jiàn)OSID碼圖6。

2.2 不同濃度PAS840的AChE抑制率比較 隨著PAS840濃度的增加，AChE抑制率先逐漸升高再趨于平緩；見(jiàn)OSID碼圖7。PAS840抑制AChE活性的IC50為22.30 μg/mL。

2.3 PAS840對(duì)AChE的活性抑制類(lèi)型 雙倒數(shù)曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，不同濃度PAS840作用后，幾條直線(xiàn)均相交于第二象限，且在橫坐標(biāo)軸和縱坐標(biāo)軸的交點(diǎn)均不同，AChE的表觀(guān)米氏常數(shù)隨PAS840濃度的增加而增加，而最大酶促反應(yīng)速率減??；這提示PAS840對(duì)AChE的活性抑制類(lèi)型是混合性抑制。見(jiàn)OSID碼圖8。

2.4 不同濃度PAS840、Vc對(duì)DPPH自由基的清除率比較 隨著濃度的增加，PAS840、Vc對(duì)DPPH自由基的清除率均呈先升高后平穩(wěn)的趨勢(shì)；500 μg/mL PAS840對(duì)DPPH自由基的清除率為93.95%，同等濃度Vc的清除率為97.31%；見(jiàn)OSID碼圖9。PAS840清除DPPH自由基的IC50為43.21 μg/mL。

2.5 不同濃度PAS840、Vc對(duì)鐵氰化鉀的還原率比較 隨著濃度的增加，PAS840對(duì)鐵氰化鉀的還原率呈先升高后平穩(wěn)的趨勢(shì)，Vc對(duì)鐵氰化鉀的還原率呈比較高的平穩(wěn)趨勢(shì)；3.0 mg/mL PAS840對(duì)鐵氰化鉀的還原率為78.20%，同等濃度Vc的還原率為82.20%；見(jiàn)OSID碼圖10。PAS840還原鐵氰化鉀的IC50為0.498 mg/mL。

2.6 不同濃度PAS840、Vc對(duì)羥自由基的清除率比較 隨著濃度的增加，PAS840對(duì)羥自由基的清除率呈比較中等的平穩(wěn)趨勢(shì)，Vc對(duì)羥自由基的清除率呈逐漸升高趨勢(shì)；1.8 mg/mL PAS840對(duì)羥自由基的清除率為45.72%，其后逐漸趨于平緩，同等濃度Vc的清除率為74.06%；3.0 mg/mL PAS840對(duì)羥自由基的清除率為47.83%，同等濃度Vc的清除率為89.73%；見(jiàn)OSID碼圖11。PAS840清除羥自由基的IC50為3.65 mg/mL。

3 討論

神經(jīng)退行性疾病是一類(lèi)認(rèn)知能力下降且不可逆的選擇性與進(jìn)行性神經(jīng)元功能障礙疾病，其中研究最多的是AD。目前，針對(duì)AD的發(fā)病機(jī)制有多種假說(shuō)，包括氧化應(yīng)激假說(shuō)、炎癥假說(shuō)、膽堿能損傷假說(shuō)、β淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)及Tau蛋白異常修飾假說(shuō)等，其中最具代表性的是膽堿能損傷假說(shuō)［14］。該假說(shuō)認(rèn)為，各種原因引起的大腦基底前腦膽堿能神經(jīng)元損傷，以及大腦皮層及海馬等區(qū)域的膽堿能神經(jīng)傳遞受損，在A(yíng)D患者記憶及認(rèn)知功能損傷過(guò)程中均具有重要作用［15］。AChE是人體大腦中生物信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵酶之一，能催化神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水解為膽堿和乙酸，進(jìn)而阻礙大腦中神經(jīng)信號(hào)的傳遞［16］。研究表明，癡呆程度與膽堿能含量有重要關(guān)系，而AChE活性與乙酰膽堿水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［17］。因此，抑制AChE進(jìn)而提高乙酰膽堿水平也就成了治療AD的重要途徑之一［18］。

我國(guó)是傳統(tǒng)中藥資源大國(guó)，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)AD一類(lèi)神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防及治療也有著悠久的歷史。中藥素以多組分、多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮作用著稱(chēng)，在許多病因不明的疑難雜癥中常收獲奇效。美洲大蠊提取物PAS840是從美洲大蠊乙醇提物中提取，經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附及水、醇水洗脫后，減壓蒸餾，冷凍干燥得到的。本研究結(jié)果顯示，美洲大蠊提取物PAS840具有較強(qiáng)的AChE活性抑制作用，IC50達(dá)22.30 μg/mL；PAS840對(duì)AChE的抑制類(lèi)型為混合性抑制。這表明PAS840既可以和游離酶單獨(dú)結(jié)合，也可以與酶和底物復(fù)合物結(jié)合，從而抑制AChE的催化活性。

研究表明，AChE抑制劑可刺激膽堿能神經(jīng)，從而減輕心肌梗死（MI）大鼠的交感迷走神經(jīng)失衡、缺血性心律失常、炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡［19］。氧化應(yīng)激可能是許多疾病的誘發(fā)因素，被認(rèn)為在衰老過(guò)程中具有重要作用。氧化損傷是衰老的標(biāo)志，被認(rèn)為可導(dǎo)致多種年齡相關(guān)疾病的發(fā)生，也包括AD等神經(jīng)退行性疾病。研究表明，具有抗氧化或抗炎特性的多靶點(diǎn)定向化合物是治療AD的有效藥物，如作為抗氧化劑和抗神經(jīng)炎癥劑的羽扇豆醇已被發(fā)現(xiàn)對(duì)AD的氧化應(yīng)激反應(yīng)具有積極影響［20］。

DPPH是一種較穩(wěn)定的自由基，文中通過(guò)測(cè)定DPPH自由基清除率為清除自由基活性的檢測(cè)提供了一個(gè)理想又簡(jiǎn)單的藥理模型。研究表明，鐵物質(zhì)在體內(nèi)能產(chǎn)生最有害的自由基物質(zhì)，即羥自由基，羥自由基在體內(nèi)會(huì)引起氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致一系列氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)生［21］。羥自由基是體內(nèi)最活躍的活性氧，作用于體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、脂類(lèi)等生物分子，可造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)代謝紊亂，如引發(fā)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并損傷膜結(jié)構(gòu)和功能等。因此，羥自由基清除能力是檢測(cè)抗氧化能力的重要指標(biāo)之一。本研究顯示，美洲大蠊提取物PAS840清除DPPH自由基的IC50為43.21 μg/mL，還原鐵氰化鉀的IC50為0.498 mg/mL，清除羥自由基的IC50為3.65 mg/mL。

綜上所述，PAS840具有較強(qiáng)的AChE活性抑制作用和抗氧化活性，對(duì)神經(jīng)退行性疾病及其他因氧化應(yīng)激而引起的疾病可能具有潛在的治療作用，其藥用價(jià)值仍需進(jìn)一步的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。