趙嘉俊,袁建波,王 璐,黃 健 綜述,閔 迅△ 審校

1.遵義醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院,貴州遵義563003;2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科,貴州遵義563003

細(xì)菌是自然界數(shù)量最多、分布最廣、最為常見的微生物。細(xì)菌不僅能夠引起某些特定疾病,還可以作為機(jī)會致病菌,當(dāng)宿主免疫力下降發(fā)生菌群失調(diào)從而造成機(jī)體的感染[1]。全球每年約770萬人死于細(xì)菌感染,占總死亡人數(shù)的13.6%,高居第二大死因(僅次于缺血性心臟病)[2]。

細(xì)菌對宿主的致病性主要取決于自身毒力因子和與宿主相互作用。毒力因子主要涵蓋細(xì)菌黏附侵襲、生長繁殖以及分泌的代謝酶等,這些因素可以協(xié)助細(xì)菌入侵宿主后啟動其感染的過程[3]。而在與宿主相互作用方面,細(xì)菌需要突破宿主先天免疫系統(tǒng)(中性粒細(xì)胞)才能引發(fā)后續(xù)的感染[4]。研究表明,當(dāng)細(xì)菌侵入宿主后會根據(jù)宿主體內(nèi)環(huán)境來調(diào)節(jié)自身能量代謝的相關(guān)基因來適應(yīng)生存,同時利用宿主的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成能量來啟動其在宿主后續(xù)的致病過程(細(xì)菌遷移、定植、生長和黏附等)[5]。目前,抗菌藥物的耐藥性仍然是一個重大的全球公共健康問題,其導(dǎo)致全球高死亡率和昂貴的醫(yī)療成本,主要原因是傳統(tǒng)抗菌藥物無法有效作用于耐藥菌[6]。因此尋找新的抗菌藥物靶點成為迫切的問題。相較于傳統(tǒng)抗菌藥物,以能量代謝為靶點的抗菌藥物更能夠從根源上抑制或者殺死細(xì)菌并且較少產(chǎn)生耐藥菌[7],這將有助于緩解傳統(tǒng)抗菌藥物耐藥性的問題。但是由于細(xì)菌代償機(jī)制和能量代謝的多元性,細(xì)菌某一能量代謝途徑分支受到阻礙,其也會通過加強(qiáng)其他能量代謝分支途徑來彌補(bǔ)[8]。故以能量代謝為靶點抗菌藥物的治療策略仍具有挑戰(zhàn)性,但是其中一些治療策略應(yīng)得到充分的建立和發(fā)展,并且已達(dá)到臨床應(yīng)用效果。因此,充分了解細(xì)菌不同能量代謝途徑對其致病性的影響有助于篩選出對致病性影響顯著的能量代謝途徑,為細(xì)菌感染性疾病的防治及緩解抗菌藥物耐藥性提供幫助?，F(xiàn)對細(xì)菌能量代謝和致病性方面的最新研究進(jìn)展予以綜述,希望為細(xì)菌耐藥問題的解決提供新思路。

1 細(xì)菌能量代謝

三磷酸腺苷(ATP)是驅(qū)動幾乎所有生命形式的細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)最重要的能量來源。致病菌能量代謝來源的基質(zhì)主要是糖類,通過糖的氧化或酵解釋放能量[9]。當(dāng)葡萄糖進(jìn)入細(xì)菌后,經(jīng)過一系列糖酵解途徑后形成重要的代謝物丙酮酸并釋放少量ATP。除厭氧菌外,大部分致病菌糖的氧化主要通過三羧酸循環(huán)完成[10]。丙酮酸通過三羧酸循環(huán)相關(guān)的限速酶氧化催化后,轉(zhuǎn)化成二氧化碳,釋放出大量的能量,并將能量存儲到輔酶黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)中,隨后這些輔酶通過電子傳遞鏈產(chǎn)能量[11]。

糖在細(xì)菌的分解途徑除了產(chǎn)能的有氧氧化和無氧氧化外,還存在不產(chǎn)生能量的磷酸戊糖途徑(PPP)[12]。PPP由兩個階段組成,一個是氧化階段,另一個是非氧化階段。在氧化階段,葡萄糖-6-磷酸通過相關(guān)酶催化生成核酮糖-5-磷酸、CO2和NADH,后者是合成代謝過程中必不可少的還原劑;在非氧化階段,核酮糖-5-磷酸經(jīng)過異構(gòu)化作用轉(zhuǎn)變?yōu)楹颂?5-磷酸,或者通過其他途徑轉(zhuǎn)化為糖酵解中的中間代謝物果糖-6-磷酸及甘油醛-3-磷酸[13]。研究證實,中華根瘤菌(Sinorhizobium)大部分的葡萄糖-6-磷酸都是通過糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑利用[14]。此外。PPP途徑幾乎所有碳源能夠以果糖-6-磷酸或者甘油醛-3-磷酸形式再次進(jìn)入糖酵解途徑。由此可見,糖酵解和磷酸戊糖途徑在細(xì)菌碳通量的調(diào)節(jié)中具有重要作用。

然而,當(dāng)細(xì)菌成功入侵宿主后,面對糖類含量匱乏的細(xì)胞環(huán)境時,其無法通過相應(yīng)的途徑進(jìn)行能量代謝。此時,細(xì)菌就會利用相關(guān)的非糖類物質(zhì)(氨基酸和脂類等物質(zhì)),這些非糖類物質(zhì)能夠通過糖異生、β-氧化、乙醛酸等途徑達(dá)到產(chǎn)生能量的目的[15]。

2 細(xì)菌能量代謝對其致病力影響

細(xì)菌能量代謝相關(guān)途徑(糖酵解、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環(huán)、糖異生等)的關(guān)鍵酶和重要相關(guān)編碼基因的缺失,能夠影響細(xì)菌的毒力、感染和定植能力等。

2.1細(xì)菌糖酵解與致病性 細(xì)菌能量代謝來源的基質(zhì)主要是糖類,糖代謝是致病菌把外界物質(zhì)轉(zhuǎn)化為自身能量的主要手段,其中糖酵解是糖代謝的主要途徑,其受損能明顯影響致病菌的增殖和致病能力。鼠傷寒沙門菌中糖酵解關(guān)鍵基因pfk缺失會顯著降低其在宿主細(xì)胞中的復(fù)制和存活能力,從而影響其致病性。結(jié)核分枝桿菌丙酮酸激酶編碼基因pykA的缺失能夠通過影響其碳代謝、鐵代謝和氧化應(yīng)激,從而影響其生長和毒力,進(jìn)而顯著地減弱其感染器官的能力[16]。腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)中甘油醛-3-磷酸脫氫酶Ⅰ編碼的基因gapA-1的缺失,能夠顯著降低其黏附在人體上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的能力[17]。此外,肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)的糖酵解轉(zhuǎn)錄因子CcpA的缺失,既能影響其在宿主中存活和增殖的能力,也能顯著減弱其毒力和定植能力[18]。這些研究表明,糖酵解關(guān)鍵基因均與細(xì)菌致病性密切相關(guān),有望成為抗菌藥物新的靶點。

2.2細(xì)菌磷酸戊糖途徑與致病性 細(xì)菌磷酸戊糖途徑與糖酵解一起構(gòu)成葡萄糖分解代謝的主要途徑,其對于維持碳穩(wěn)態(tài)、為核苷酸和氨基酸生物合成提供前體、為合成代謝提供還原分子以及抵抗氧化應(yīng)激具有重要意義[19]。研究發(fā)現(xiàn),致病性弗朗西斯菌和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)磷酸戊糖途徑中的轉(zhuǎn)酮醇酶(TKT)缺失均會使其在小鼠中毒性減弱[20]。在大腸埃希菌(Escherichia coli)中,通過敲除編碼核酮糖-5-磷酸-3-差向異構(gòu)酶的基因rpe后,發(fā)現(xiàn)其在宿主的生長受到顯著的抑制[21]。此外,鼠傷寒沙門菌中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在其發(fā)病機(jī)制中也起到重要作用,其缺失會導(dǎo)致鼠傷寒沙門菌對小鼠毒力下降,以及增加對活性氧的敏感性[22]。然而,有研究表明,金黃色葡萄球菌編碼6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶基因pgl的突變顯著增加了MRSA對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥性,并減少了苯唑西林誘導(dǎo)的裂解[23]。由此可見,細(xì)菌磷酸戊糖基因雖然對部分細(xì)菌致病性有影響,但是其突變會增加對抗菌藥物耐藥。因此,以細(xì)菌磷酸戊糖途徑為抗菌藥物新靶點未必能得到臨床應(yīng)用。

2.3細(xì)菌三羧酸循環(huán)與致病性 在糖代謝途徑中,糖的有氧氧化是大部分細(xì)菌獲得能量的主要途徑。三羧酸循環(huán)又作為有氧氧化最關(guān)鍵的一環(huán),作為能量代謝的樞紐,需氧菌70%以上的能量由三羧酸循環(huán)產(chǎn)生。細(xì)菌三羧酸循環(huán)相關(guān)酶編碼基因表達(dá)會顯著影響其生長、定植和毒力因子等因素。例如,在霍亂弧菌中三羧酸循環(huán)編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的基因pdh的缺失會顯著地影響其定植能力;鰻弧菌(Vibrio anguillarum)三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵基因異檸檬酸脫氫酶(ICDH)缺失后,其生長速率和對宿主的毒力作用均明顯下降[24];三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶蘋果酸脫氫酶(MDH)在流產(chǎn)布魯菌(Brucella abortus)定植中發(fā)揮重要作用[25]。此外,腸道沙門菌(Salmonella)中琥珀酸脫氫酶(SDH)的缺失也會導(dǎo)致其在小鼠上定植的能力出現(xiàn)缺陷[26]。這些研究結(jié)果表明,細(xì)菌三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶參與其多種致病過程,具有成為抗菌藥物新靶點潛力。

2.4細(xì)菌糖異生與致病性 細(xì)菌進(jìn)入宿主細(xì)胞后,可能會暴露在匱乏糖類的細(xì)胞環(huán)境下。此時細(xì)菌無法通過正常的糖代謝來獲取能量,而是通過糖異生等代謝途徑來獲取能量。糖異生能夠把簡單的非糖前體(乳酸、甘油、生糖氨基酸等)轉(zhuǎn)變?yōu)樘?從而使細(xì)菌在缺乏葡萄糖的環(huán)境下獲取糖類進(jìn)行后續(xù)一系列的能量代謝[27-28]。細(xì)菌糖異生的相關(guān)基因表達(dá)對其生長、繁殖和感染能力均有顯著影響。果糖-1,6-二磷酸酶(glpX)是糖異生途徑的關(guān)鍵酶,它的缺失不僅會顯著影響致病性弗朗西斯菌的增殖和毒力因素[29],還影響結(jié)核分枝桿菌在宿主中生長和存活能力。在霍亂弧菌糖異生途徑中的磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pckA)缺失后,雖然未影響其毒力,但會明顯減低其運動和定植能力[30]。此外,糖異生的激活轉(zhuǎn)錄因子Cra的缺失,會使鼠傷寒沙門菌的毒力明顯下降[31]。但是,在面對缺乏糖類營養(yǎng)的環(huán)境下,微生物除了進(jìn)行糖異生外還會通過其他分支途徑(β-氧化、乙醛酸循環(huán))來獲取能量。因此,若以細(xì)菌糖異生途徑為抗菌藥物新靶點未必能得到很好治療效果。

2.5細(xì)菌氧化磷酸化與致病性 在細(xì)菌中,氧化磷酸化是在細(xì)胞質(zhì)上進(jìn)行的,是物質(zhì)在其體內(nèi)氧化時釋放的能量通過質(zhì)膜呼吸鏈供給二磷酸腺苷(ADP)與無機(jī)磷酸合成ATP的偶聯(lián)反應(yīng),還是生物體能量產(chǎn)生的最終途徑。氧化磷酸化的主要作用是把許多代謝生化反應(yīng)中產(chǎn)生的NADH或FADH2中高能電子通過一系列酶反應(yīng)系統(tǒng)(呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ～Ⅳ)后釋放能量,并且把能量供給ADP和磷酸共同合成ATP[32-33]。研究表明,NADH的產(chǎn)生、呼吸鏈復(fù)合物和ATP的合成均有望成為調(diào)控氧化磷酸化途徑影響細(xì)菌致病性的潛在靶點[34-35]。

2.5.1細(xì)菌NADH產(chǎn)生 NADH作為主要的電子供體,對于ATP的合成必不可少。通過敲除結(jié)核分枝桿菌中NADH代謝途徑的相關(guān)的醇脫氫酶(adhA),顯著地改變其胞內(nèi)NADH和ATP水平,并且通過影響細(xì)胞壁特性削弱細(xì)菌在環(huán)境脅迫下的存活能力[36]。過表達(dá)肺炎鏈球菌中醇脫氫酶(adhE)可以增加溶血素的產(chǎn)生并增強(qiáng)細(xì)菌毒力,而adhE缺陷菌株的溶血活性、毒力和細(xì)胞髓過氧化物酶活性顯著下降[37]。另外,恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)丙酮酸脫氫酶(aceE)的缺失除了會導(dǎo)致其失去聚集生長和生物膜形成能力外,還減少在酸性環(huán)境下的脅迫能力以及對巨噬細(xì)胞的侵襲能力[38]。上述的脫氫酶均是產(chǎn)生NADH的重要催化酶,它們均是通過NADH水平的變化來影響其致病性。因此,以阻斷NADH產(chǎn)生來抑制細(xì)菌致病性具有一定可行性。

2.5.2呼吸鏈復(fù)合物 呼吸鏈復(fù)合物共有4種亞型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)。其中,呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ(又稱NADH-輔酶Q氧化還原酶)是第一個提供質(zhì)子動力的呼吸復(fù)合物,其對于ATP合成等耗能過程至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn),通過敲除結(jié)核分枝桿菌中兩種編碼NADH脫氫酶基因(ndh、nuoAN),發(fā)現(xiàn)其在小鼠中的毒力和感染能力嚴(yán)重下降[39]。在無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)中,2型NADH脫氫酶(NDH-2)的缺失雖然無法影響其體外生長,但會明顯減弱其對小鼠心臟和腎臟的定植[40]。呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ由琥珀酸脫氫酶、三個鐵硫蛋白和一個不參與電子傳遞的亞鐵血紅素基團(tuán)組成,是唯一的既是三羧酸循環(huán)又是電子傳遞鏈的酶系統(tǒng)[41]。針對呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ的潛在靶點的研究主要集中在琥珀酸脫氫酶上,因為其是三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈的交集。研究證實,腸鏈球菌(Streptococcus)和腸道沙門菌中其缺失均能夠?qū)е缕湓谛∈篌w內(nèi)定植的能力明顯減低[42]。呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ包含一個細(xì)胞色素B (含兩個血紅素)、一個細(xì)胞色素C1和一個鐵硫蛋白。目前針對呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ的抑制劑主要集中在醌的功能結(jié)合位點。醌的功能結(jié)合位點中的Qi位點抑制劑(吲唑磺菌胺和氰霜唑)有望成為殺菌劑發(fā)展的新靶標(biāo)[43]。呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ(又稱細(xì)胞色素C氧化酶)位于呼吸鏈的末端,負(fù)責(zé)將電子傳遞給O2,合成H2O。由于細(xì)胞色素C氧化酶對于細(xì)菌存活十分重要,因此無法通過直接完全敲除其編碼基因來觀察其缺陷狀況下的活動。在恥垢分枝桿菌中通過敲除細(xì)胞色素C氧化酶其中一個氧化還原中心(由qcrCAB基因編碼),發(fā)現(xiàn)其在體外的生長受到明顯抑制[44]。豬布魯菌(Brucella suis)中編碼細(xì)胞色素C氧化酶的亞基ccoN基因的缺失,會導(dǎo)致其對小鼠的毒力作用嚴(yán)重下降[45]。這些研究表明,呼吸鏈復(fù)合物在細(xì)菌致病性扮演重要角色,同時有望成為抗菌藥物新靶點。

2.5.3細(xì)菌ATP生成 ATP是細(xì)菌能量代謝最重要的物質(zhì)之一,也是進(jìn)行新陳代謝所需能量的直接來源,其主要合成途徑是氧化磷酸化,F1F0-ATP合酶是其關(guān)鍵酶。研究發(fā)現(xiàn),F1F0-ATP合酶對于恥垢分枝桿菌在不可發(fā)酵和可發(fā)酵碳源環(huán)境上生長必不可少的[46]。在銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)上,F1F0-ATP合酶的缺乏會導(dǎo)致其生長緩慢[47]。這些研究表明,細(xì)菌ATP合成對其生長不可或缺,以抑制ATP合成來削弱細(xì)菌致病性具有一定實踐價值。

2.6其他 氫化酶是細(xì)菌體內(nèi)普遍存在的金屬酶,并且與細(xì)菌能量代謝密切相關(guān)。VANNINI等[48]發(fā)現(xiàn),幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)缺失氫化酶后,雖然還能在體外環(huán)境下存活,但是在小鼠內(nèi)的定植效率比野生型菌株降低85%。在肝螺桿菌(Helicobacter hepaticus)中氫化酶缺失能夠明顯降低其毒力效應(yīng)[49]。

3 總結(jié)與展望

細(xì)菌能量代謝作為其生長繁殖的基礎(chǔ),也是影響其致病性的重要因素。本文總結(jié)了不同細(xì)菌能量代謝與其致病性之間的相互聯(lián)系的研究進(jìn)展,著重綜述了能量代謝的相關(guān)基因或酶的缺失后造成細(xì)菌對宿主致病力的影響。目前,能量代謝類抗菌藥物的研究在針對分枝桿菌上已經(jīng)取得相對優(yōu)勢的地位。除了已經(jīng)在臨床廣泛應(yīng)用的ATP合酶抑制藥物(貝達(dá)喹啉)外,最新研究的細(xì)胞色素bcc抑制劑Telacebec(Q203)和細(xì)胞色素bd氧化酶抑制劑(ND-011992)已經(jīng)進(jìn)行到第二期臨床試驗,有望應(yīng)用于臨床。然而,因為細(xì)菌能量代謝系統(tǒng)過于復(fù)雜并且細(xì)菌具有相應(yīng)的代償系統(tǒng),針對單一能量代謝途徑可能無法有效作用細(xì)菌。所以,未來需要聯(lián)合不同能量代謝途徑的藥物以防止細(xì)菌代償機(jī)制。對細(xì)菌能量代謝和致病性更深入的研究,可為尋找更多可能針對細(xì)菌能量代謝的潛在靶點提供幫助,不僅有利于對臨床細(xì)菌感染性疾病的防治,而且可為細(xì)菌耐藥性問題的研究提供相應(yīng)借鑒。