馮君 陳西婭 程力

摘要：目的 探討馬鞭草治療血瘀型閉經(jīng)的作用機(jī)制。方法 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選馬鞭草有效成分，在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，在GeneCards、DrugBank、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索閉經(jīng)相關(guān)疾病靶點(diǎn)，借助STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，在Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物富集分析，利用AutoDockVina、Ligplot、PyMOL軟件進(jìn)行分子對接。結(jié)果 保留馬鞭草有效成分7種，藥物靶點(diǎn)213個(gè)，60個(gè)與閉經(jīng)相關(guān)，疾病靶點(diǎn)2350個(gè)。GO富集涉及核雌激素受體結(jié)合等307條生物學(xué)過程；KEGG富集涉及內(nèi)分泌抵抗等43條信號(hào)通路。分子對接顯示，馬鞭草核心有效成分槲皮素、木犀草素、香葉木素、山奈酚、蒿黃素與核心靶點(diǎn)AKT1、EGFR、SRC、IGF1R、MMP9均有較強(qiáng)的結(jié)合能力。結(jié)論 馬鞭草可能作用于內(nèi)分泌抵抗等多條信號(hào)通路，通過抗炎、抗氧化、降解卵泡細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)卵泡血管重塑、誘導(dǎo)原始卵泡活化等作用治療血瘀型閉經(jīng)。

關(guān)鍵詞：馬鞭草；閉經(jīng)；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接

閉經(jīng)主要表現(xiàn)為無月經(jīng)或月經(jīng)停止，增加了女性發(fā)生應(yīng)激性或脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)，18歲以前出現(xiàn)的功能性下丘腦性閉經(jīng)還會(huì)不可逆地?fù)p害峰值骨量，影響成年后最終身高和骨成熟度[1]。中藥馬鞭草性味苦、涼，歸肝、脾經(jīng)，有活血散瘀、清熱解毒之功，主治癥瘕積聚、痛經(jīng)經(jīng)閉。《本草撮要》記載：“馬鞭草味苦微寒，入足厥陰經(jīng)，功專破血通經(jīng)”。現(xiàn)代藥理研究表明，馬鞭草主要化學(xué)成分揮發(fā)油、黃酮等具有抗炎、抗腫瘤等多種生物活性，臨床多用于治療支氣管哮喘、肝癌等，少有用于治療閉經(jīng)者[2]。本研究簡要探討馬鞭草治療血瘀型閉經(jīng)的作用機(jī)制。

1資料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

以“馬鞭草”為關(guān)鍵詞在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索后，導(dǎo)入SwissADME平臺(tái)篩選胃腸道吸收為“High”，且符合類藥性五原則（DL YES≥2；0 violation）的化合物，導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測；以“Amenorrhea”為關(guān)鍵詞分別在GeneCards、DrugBank、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索得到疾病靶點(diǎn)，獲取二者的交集靶點(diǎn)。

將有效成分、交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件篩選出核心有效成分；將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選核心PPI網(wǎng)絡(luò)后保留度值前10的基因?yàn)殛P(guān)鍵基因。

將關(guān)鍵基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物富集分析，篩選P值較小的前20個(gè)通路作圖；將有效成分、關(guān)鍵基因、KEGG通路信息導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件，篩選度值排序前5的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)。

1.2 分子對接

分別在TCMSP、PDB數(shù)據(jù)庫中獲取核心有效成分、核心靶點(diǎn)的分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入AutoDockVina軟件進(jìn)行半柔性對接，篩選生成氫鍵結(jié)合能最低的5組對接關(guān)系通過PyMOL、Ligplot軟件構(gòu)建對接模式圖。

2結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

保留有效成分7種（表1）、疾病靶點(diǎn)2350個(gè)、藥物靶點(diǎn)213個(gè)，交集靶點(diǎn)60個(gè)。導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件，篩選出槲皮素、山奈酚、木犀草素、香葉木素、蒿黃素為核心有效成分；將導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（圖1A），篩選核心PPI網(wǎng)絡(luò)（圖1B），推測EGFR、SRC、IGF1R、AKT1、ESR1、MMP9、SIRT1、PARP1、PTGS2、AR可能在馬鞭草治療血瘀型閉經(jīng)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。

將關(guān)鍵基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物富集分析。KEGG富集主要涉及內(nèi)分泌抵抗等43條信號(hào)通路；GO富集分析主要涉及一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性等307條生物學(xué)過程，其中富集在內(nèi)分泌抵抗信號(hào)通路上的基因顯著性最高。導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件，篩選出AKT1、EGFR、SRC、IGF1R、MMP9可能是核心作用靶點(diǎn)。

2.2 分子對接

核心有效成分與核心靶點(diǎn)均能有效結(jié)合，其中槲皮素、木犀草素、香葉木素與MMP9，山奈酚、蒿黃素與AKT1生成氫鍵結(jié)合能最低（表2），對接關(guān)系模式圖顯示，5組對接關(guān)系中的有效成分與靶點(diǎn)均通過形成氫鍵以及疏水作用力相互作用。

3討論

閉經(jīng)病名首見于《內(nèi)經(jīng)》，古稱“女子不月”、“月事不來”等，脾腎虧虛、血虛血瘀、痰濕阻滯均可導(dǎo)致本病，以“虛則補(bǔ)而通之，實(shí)則瀉而通之”為基本治則。血瘀型閉經(jīng)又分為氣滯血瘀、寒凝血瘀兩種證型?，F(xiàn)代藥理研究表明，馬鞭草總黃酮可通過抑制AKT/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬來抑制肝癌細(xì)胞增殖，但少有針對馬鞭草治療閉經(jīng)的藥理學(xué)研究[3～4]。

研究發(fā)現(xiàn)，卵泡膜細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）及卵泡液中存在大量明膠蛋白、纖維蛋白和 IV型膠原蛋白等，這些活性蛋白的有效水解能夠改變卵泡發(fā)育的微環(huán)境，有利于卵泡細(xì)胞增殖、遷移、分化[5]。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）屬于金屬蛋白酶超家族，后者是一個(gè)多結(jié)構(gòu)域鋅依賴的內(nèi)肽酶家族。MMPs的表達(dá)可被絲裂原活化蛋白激酶、p38、粘著斑激酶、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1或蛋白激酶B（AKT）的磷酸化而改變的細(xì)胞信號(hào)所誘導(dǎo)，并傾向于與炎癥、免疫細(xì)胞滲透和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[6]。MMPs包含23個(gè)家族成員，其中基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）均屬于明膠酶，二者結(jié)構(gòu)域相似，均含有3個(gè)重復(fù)的纖維連接蛋白Ⅱ型模塊結(jié)構(gòu)域，能在體外裂解ECM蛋白，從而促進(jìn)胚胎生長和發(fā)育、組織重塑、炎癥和傷口愈合，磷酸化的AKT還可誘導(dǎo)AKT依賴性FOXO蛋白磷酸化并從細(xì)胞核內(nèi)移除，觸發(fā)原始卵泡活化[7～8]。

本研究保留7種有效成分，60個(gè)交集靶點(diǎn)，核心有效成分是槲皮素、木犀草素、香葉木素、山奈酚、蒿黃素，核心靶點(diǎn)是AKT1、EGFR、SRC、IGF1R、MMP9。分子對接結(jié)果顯示，核心有效成分與核心靶點(diǎn)均能較好地結(jié)合，其中槲皮素、木犀草素、香葉木素與MMP9，山奈酚、蒿黃素與AKT1生成氫鍵結(jié)合能最低。由此可見，ECM蛋白水解失調(diào)、血管重塑失敗、原始卵泡活化受阻均可導(dǎo)致卵泡生長受限，最終導(dǎo)致閉經(jīng)的發(fā)生，提示MMP9、AKT是本病的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)。本研究通過生物富集分析得到43條通路和307個(gè)生物學(xué)過程，發(fā)現(xiàn)KEGG主要與內(nèi)分泌抵抗等信號(hào)通路有關(guān)，且內(nèi)分泌抵抗信號(hào)通路上富集的基因顯著性最高（P值最?。?，提示該條信號(hào)通路可能是馬鞭草治療血瘀型閉經(jīng)的關(guān)鍵信號(hào)通路。

綜上所述，馬鞭草主要成分槲皮素、木犀草素、香葉木素、山奈酚、蒿黃素作用于AKT1、EGFR、SRC、IGF1R、MMP9等基因靶點(diǎn)，參與多種生物學(xué)過程，調(diào)控內(nèi)分泌抵抗等多條信號(hào)通路，可通過抗炎、抗氧化、降解卵泡細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)卵泡血管重塑、誘導(dǎo)原始卵泡活化等作用治療血瘀型閉經(jīng)。

參考文獻(xiàn)：

[1]張志鵬，鄧?yán)罴t，王壽富，等.超高效液相色譜指紋圖譜與化學(xué)模式識(shí)別馬鞭草藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2022，19（21）：21-25.

[2]蔡小兵，胡欣，金鵬飛.對《中華人民共和國藥典》2010年版（一部）的分析和探討[J].中國新藥雜志，2012，21（16）：1874-1877.

[3]李振雨，梁月儀，呂渭升，等.馬鞭草藥材UPLC指紋圖譜建立及指標(biāo)性成分的測定[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2023，35（4）：551-561.

[4]王夢月，賈敏如.馬鞭草在民間的藥用情況概述[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，2002（3）：156-158.

[5]王夢月，賈敏如.25個(gè)民族藥用馬鞭草情況概述[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2002（2）：20-21.

[6]杜超群，楊最素.馬鞭草對治療生殖器官疾病的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2012，25（15）：1843-1844.

[7]王燕，朱向東，王歡，等.馬鞭草的臨床應(yīng)用及其用量探究[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，37（2）：278-281.

[8]馬設(shè)召.陽和湯加減聯(lián)合桂枝茯苓丸、益母草、馬鞭草治療子宮肌瘤的臨床療效觀察[J].智慧健康，2021，7（2）：153-155.